Reakcje charakterystyczne dla aminokwasów oraz wykrywanie białek

Transkrypt

1 Ćwiczenie 2 eakcje charakterystyczne dla aminokwasów oraz wykrywanie białek Wyciąg z kart charakterystyki substancji niebezpiecznych Sodu azotan (III), T, Kwas octowy Kwas siarkowy Kwas azotowy (V) Kwas solny Wodorotlenek sodu Kwas glioksalowy Kwas sulfanilowy Xi itroprusydek sodu 2 hydrat T łowiu (II) octan 3 hydrat T, Miedzi (II) siarczan kryst. 5 hydrat Xn, alfanaftol Xn Etanol 96% F Brom cząsteczkowy T,, Sodu węglan bezwodny Xi Amonu nadsiarczan, Xn Amoniak roztw 25%, woda amoniakalna, I. eakcje wspólne dla wszystkich αaminokwasów 1. eakcja van Slyke a z kwasem azotowym (III) Wolne αaminokwasy pod wpływem kwasu azotowego (III), tworzącego się w środowisku reakcji ex tempore ze względu na jego nietrwałość, według poniŝsze reakcji: a a ulegają reakcji deaminacji i przechodzą w odpowiednie αhydroksykwasy, a ponadto wydziela się wówczas cząsteczkowy azot w formie gazowej, zgodnie z poniŝszym równaniem: eakcja ta jest wykorzystywana w gazometrycznej metodzie ilościowego oznaczania αaminokwasów na podstawie pomiaru objętości wydzielonego azotu (metoda van Slyke a). 1

2 Do 1 ml 10% roztworu a 2 dodać 1 ml 2 M roztworu 3 (próba kontrolna). Z roztworu wydzielają się brunatnoŝółte dymy tlenków azotu, pochodzące z rozkładu nietrwałego 2. Do 1 ml 1% roztworu glicyny dodać 1 ml 10% roztworu a 2, zamieszać i następnie dodać 1 ml 2 M roztworu 3. bserwować wydzielanie się pęcherzyków bezbarwnego, gazowego azotu. 2. eakcja ninhydrynowa Wolne grupy aminowe αaminokwasów pod wpływem ninhydryny (wodzianu triketohydrindenu) ulegają dekarboksylacji i oksydatywnej deaminacji. Przejściowo powstaje iminokwas i zredukowana ninhydryna (hydrindantyna). astępnie iminokwas przekształca się w aldehyd uboŝszy o jeden atom węgla od macierzystego aminokwasu, uwalnia się amoniak i dwutlenek węgla. W obecności powstałego amoniaku następuje kondensacja cząsteczek ninhydryny i hydrindantyny, co prowadzi do powstania niebieskofioletowo zabarwionego kompleksu nazywanego purpurą uhemanna (ys. 1). Poszczególne aminokwasy dają róŝne zabarwienia w tej reakcji. W przypadku glicyny powstaje zabarwienie niebieskofioletowe, fenyloalaniny niebieskie, alaniny szkarłatne. Maksimum absorbancji dla tego kompleksu przypada przy długości fali 570 nm. atęŝenie zabarwienia jest proporcjonalne do stęŝenia αaminokwasów ninhydryna hydrindantyna (zredukowana ninhydryna) purpura uhemanna ys. 1. Przebieg reakcji ninhydrynowej. eakcja aminokwasów z ninhydryną stanowi podstawę do ilościowego oznaczania tych związków w metodach gazometrycznych, w których oblicza się ilość wydzielanego 2 lub 3, oraz w metodach kolorymetrycznych, w których mierzy się natęŝenie barwy zaleŝne od stęŝenia powstałego kompleksu ninhydryny 2

3 z 3. eakcja ninhydrynowa nie jest specyficzna tylko dla aminokwasów. Barwną reakcję z ninhydryną dają równieŝ peptydy, białka, sole amonowe, aminocukry i amoniak (w przypadku peptydów i białek nie uwalnia się 2). Z tego powodu do ilościowego oznaczania aminokwasów analizowany roztwór musi być wolny od tych pozostałych związków. eakcja ninhydrynowa znalazła równieŝ zastosowanie do jakościowego wykrywania aminokwasów przewaŝnie do lokalizacji aminokwasów po rozdziale ich mieszaniny metodą chromatografii bibułowej. Prolina i hydroksyprolina aminokwasy, które nie mają grupy αaminowej tworzą z ninhydryną kompleksy innego typu o barwie Ŝółtej i maksimum absorbancji przy długości fali 440 nm (ys. 2). prolina ys. 2. Przebieg reakcji ninhydrynowej dla proliny. Przygotować 3 probówki. Do pierwszej dodać 1 ml 0,1% roztworu glicyny, do drugiej 1 ml 1% roztworu proliny, do trzeciej 1 ml surowicy 20krotnie rozcieńczonej 0,9% roztworem al. Do kaŝdej probówki dodać po 0,5 ml 0,1% roztworu ninhydryny w 50% etanolu. Próbki ogrzać do wrzenia we wrzącej łaźni wodnej. Porównać zabarwienia uzyskane dla poszczególnych aminokwasów i białka. II. eakcje charakterystyczne dla poszczególnych aminokwasów 1. Wykrywanie aminokwasów aromatycznych. eakcja ksantoproteinowa. Aminokwasy aromatyczne tyrozyna i tryptofan (wolne i związane w białku) podczas ogrzewania ze stęŝonym 3 ulegają reakcji nitrowania, tworząc zabarwione na Ŝółto pochodne nitrowe (ys. 4). W reakcjach nitrowania fenyloalaniny, najczęściej wykorzystywanym azotowym elektrofilem jest kation nitroniowy powstający z kwasu azotowego (V) pod wpływem katalizującego protonu, dostarczanego przez kwas siarkowy zgodnie z reakcją (ys. 3): S 4 2 kwas azotowy (V) uprotonowany kwas azotowy (V) jon nitroniowy ys. 3. Powstawanie kationu nitroniowego. Uprotonowany kwas azotowy po odłączeniu cząsteczki wody przechodzi w jon nitroniowy. W reakcjach nitrowania fenyloalaniny stosuje się tzw. mieszaninę nitrującą składającą się ze stęŝonego kwasu azotowego (V) oraz stęŝonego kwasu siarkowego (w stosunku 1:3 v/v). W środowisku zasadowym Ŝółty kolor związków nitrowych pogłębia się do Ŝółtopomarańczowego, gdyŝ powstają intensywniej zabarwione sole pseudokwasów. 3

4 tyrozyna dinitrotyrozyna (Ŝółta pochodna nitrowa) ys. 4. eakcja nitrowania tyrozyny. Przygotować trzy probówki. Do pierwszej dodać 1 ml 1% roztworu tyrozyny w 0,1 M l, do drugiej 1 ml surowicy 10krotnie rozcieńczonej 0,9% roztworem al, a do trzeciej 1 ml 1% roztworu glicyny. Do wszystkich probówek dodać po 1 ml stęŝonego 3, a następnie bardzo ostroŝnie lekko podgrzać. Uwaga: reakcja silnie egzotermiczna! Zaobserwować, w których probówkach roztwór przyjmie barwę Ŝółtą. Zawartość probówek oziębić w wodzie, a następnie zalkalizować próbki 30% roztworem a. Uwaga: reakcja silnie egzotermiczna. Zaobserwować, w których probówkach roztwór zabarwi się na kolor Ŝółtopomarańczowy. Zinterpretować uzyskane wyniki. 2. Wykrywanie układu indolowego. eakcja Adamkiewiczaopkinsa. Jest to reakcja charakterystyczna dla tryptofanu, który zawiera pierścień indolowy. W środowisku stęŝonych kwasów nieorganicznych układy indolowe dwóch cząsteczek tryptofanu bardzo łatwo ulegają kondensacji z aldehydami, między innymi kwasem glioksalowym (reakcja Adamkiewiczaopkinsa) lub aldehydem mrówkowym (reakcja Voisseneta), dając barwne produkty kondensacji (ys. 5). W kwaśnych hydrolizatach białek lub peptydów wynik tej reakcji jest ujemny, poniewaŝ tryptofan ulega zniszczeniu podczas kwaśnej hydrolizy tryptofan kw. glioksalowy ys. 5. Przebieg reakcji Adamkiewiczaopkinsa. Przygotować cztery probówki. Do pierwszej odmierzyć 1 ml 1% roztworu tryptofanu w 0,1 M l, do drugiej 1 ml surowicy 5krotnie rozcieńczonej 0,9% roztworem al, do trzeciej 1 ml 2% roztworu albuminy w 0,9% al, 4

5 a do ostatniej 1 ml 2% roztworu Ŝelatyny w 0,9% al. Do kaŝdej probówki dodać po 1 ml kwasu glioksalowego, a po wymieszaniu ostroŝnie podwarstwić 1 ml stęŝonego 2S 4 wlewając go bardzo ostroŝnie po ściance lekko nachylonej probówki, której nie naleŝy wstrząsać. grzewać we wrzącej łaźni do 2 min. Pojawienie się na granicy faz bardzo delikatnego czerwonofioletowego pierścienia oznacza wynik dodatni na obecność tryptofanu. Zinterpretować uzyskane wyniki. 3. Wykrywanie układu imidazolowego. eakcja Pauliego. Związki imidazolowe, w tym histydyna, w środowisku alkaicznym (roztwór węglanu sodu) ulegają reakcji sprzęgania z kwasem (jonem) psulfobenzenodiazoniowym, tworząc pomarańczowoŝółty barwnik azowy (ys. 6). 2 2 a S jon psulfobenzenodiazoniowy histydyna 2 2 a 3 S S 3 a 2 2 ys. 6. Przebieg reakcji Pauliego. Bezpośrednio przed wykonaniem oznaczenia przygotować kwas psulfobenzenodiazoniowy w następujący sposób: do probówki odmierzyć 5 ml 0,5% kwasu sulfanilowego w 2 M l, a następnie dodać 0,25 ml 0,5% roztworu a 2 cały czas chłodząc probówkę w zimnej wodzie. trzymany roztwór soli diazoniowej zalkalizować przy uŝyciu a 2 3 in substantia, sprawdzając p roztworu papierkiem wskaźnikowym. Przygotować dwie probówki. Do pierwszej odmierzyć 1 ml 0,5% roztworu histydyny, a do drugiej 1 ml surowicy 10krotnie rozcieńczonej 0,9% roztworem al. Do obu probówek dodać po 2,5 ml otrzymanego uprzednio roztworu kwasu psulfobenzenodiazoniowego. Pojawienie się pomarańczowego zabarwienia oznacza dodatni wynik na obecność histydyny. 4. Wykrywanie układu guanidynowego. eakcja Sakaguchiego. Związki zawierające resztę guanidynową, w tym agrinina w obecności utleniacza bromianu (I) sodu w środowisku zasadowym w roztworze zawierającym αnaftol tworzą pomarańczowoczerwony produkt (ys. 7). W razie dłuŝszego działania abr dochodzi do odbarwienia roztworu, poniewaŝ barwny kompleks dalej się utlenia. Dodanie 40% roztworu mocznika powoduje stabilizację utworzonego barwnika. Podobnie reagują 5

6 metyloguanidyna i kwas guanidynooctowy. Kreatyna, kreatynina, mocznik i guanidyna nie dają pozytywnej reakcji, poniewaŝ w reakcji niezbędny jest odpowiedni układ, gdzie jest grupą alkilową 2(=), bądź resztą kwasu tłuszczowego. 2 ( 2 ) 3 abr arginina 2 alfanaftol 3 abr 2 ( 2 ) abr abr ys. 7. Przebieg reakcji Sakaguchiego. Przygotować dwie probówki. Do pierwszej dodać 1 ml 0,1% roztworu argininy, a do drugiej 1 ml surowicy 10 krotnie rozcieńczonej 0,9% roztworem al. Do obu probówek dodać po 1 ml 10% roztworu a i 2 krople świeŝo przygotowanego 1% alkoholowego roztworu αnaftolu (w 50% Et). Wymieszać energicznie, a po dodaniu 0,1 ml roztworu bromianu (I) sodu ponownie wymieszać. Dodać 0,5 ml 40% roztworu mocznika w celu stabilizacji pojawiającego się pomarańczowoczerwonego barwnika. oztwór bromianu (I) sodu: 0,62 ml bromu rozpuścić w 100 ml 5% roztworu a. 5. Wykrywanie grup tiolowych. eakcja z nitroprusydkiem sodu. Aminokwasy zawierające grupy tiolowe (S) tworzą z nitroprusydkiem sodu połączenia kompleksowe o czerwonofiołkowym kolorze. Aminokwasy posiadające ugrupowania dwusiarczkowe nie dają pozytywnego odczynu w tej reakcji. [Fe 3 () 5 ] 2 3 S [Fe 2 () 5 S] 3 4 Przygotować dwie probówki. Do pierwszej odmierzyć 1 ml świeŝo przygotowanego 0,1% roztworu cysteiny w 0,1 M l, a do drugiej 1 ml surowicy 10krotnie rozcieńczonej 0,9% roztworem al. Do obu probówek dodać po 1 ml 1% roztworu nitroprusydku sodu. trzymane roztwory nasycić siarczanem amonu in substantia, a następnie zalkalizować je amoniakiem. Pojawia się czerwonofiołkowe zabarwienie. 6

7 6. Wykrywanie aminokwasów siarkowych. eakcja cystynowa. ysteina i cystyna podczas gotowania z a (w środowisku silnie zasadowym) ulegają deaminacji i przekształcają się w kwas pirogronowy, a takŝe powstają jony siarczkowe. Jony siarczkowe w obecności Pb 2 tworzą czarny osad PbS. Inny aminokwas siarkowy tj. metionina, nie daje pozytywnego wyniku w tej reakcji. ysteina 2 kwas pirogronowy 3 S 2_ 2 Pb 2 S 2_ PbS Do 1 ml surowicy 10krotnie rozcieńczonej 0,9% roztworem al dodać 2 ml 30% roztworu a i ogrzewać kilkanaście minut we wrzącej łaźni wodnej. astępnie dodać kilka kropli 1% roztworu ( 3) 2Pb i ponownie ogrzewać. Wytrąca się czarny osad PbS. III. eakcja ogólna na białka. eakcja biuretowa Piotrowskiego Jest to test na obecność wiązania peptydowego w peptydach i białkach, gdyŝ pozytywną reakcję dają wszystkie związki posiadające w cząsteczce co najmniej dwa wiązania peptydowe. azwa metody pochodzi od biuretu (bimocznika), najprostszego związku spełniającego ten warunek, a powstającego przy ogrzewaniu mocznika do 180º (ys. 8). 2 ( 2 ) 2 temp mocznik biuret ys. 8. Synteza biuretu. W środowisku zasadowym dochodzi do tautomeryzacji wiązania peptydowego z utworzeniem formy enolowej. Z ugrupowaniami tego typu jony miedzi tworzą dwa wiązania z atomami tlenu grup enolowych oraz cztery wiązania z atomami azotu, co powoduje powstanie fioletowoniebieskiego kompleksu o maksimum absorbancji przy długości fali 546 nm (ys. 10). asilenie barwy tego kompleksu zaleŝy od długości (ilości wiązań peptydowych) łańcucha peptydowego, a więc jest proporcjonalne do stęŝenia białka. f o r m a k e t o n o w a f o r m a e n o l o w a ys. 9. Wiązanie peptydowe 7

8 u 2 ys. 10. Kompleks powstający w reakcji biuretowej. Do 1 ml surowicy rozcieńczonej 10krotnie 0,9% roztworem al dodać 1 ml 10% roztworu a i kilka kropli 0,5% roztworu us 4. Pojawia się fioletowa barwa. Wybierając dowolny aminokwas sprawdzić, Ŝe reakcja biuretowa daje z aminokwasami wynik ujemny. aleŝy unikać nadmiaru us 4, poniewaŝ niebieska barwa wodorotlenku miedziowego maskuje właściwy odczyn. IV. Wykrywanie glikoprotein. eakcja Libermanna. Białka podczas ogrzewania ze stęŝonym l ulegają hydrolizie do aminokwasów, a z cukrów powstają pochodne furfuralowe, które z fenolami utworzonymi w czasie hydrolizy tworzą fioletowo zabarwione połączenia. Do 1 ml surowicy 2krotnie rozcieńczonej 0,9% roztworem al dodać 3 ml stęŝonego l. Zawartość probówki ogrzewać przez kilka minut. oztwór stopniowo zabarwia się na kolor fioletowy. dczynniki roztwory aminokwasów: 0,1% roztwór argininy; świeŝo przygotowany 0,1% roztwór cysteiny w 0,1 M l; 0,1% roztwór glicyny; 1% roztwór glicyny; 0,5% roztwór histydyny; 1% roztwór proliny; 1% roztwór tryptofanu w 0,1 M l; 1% roztwór tyrozyny w 0,1 M l; surowica bydlęca; 0,9% roztwór al; 2% roztwór Ŝelatyny w 0,9% al; 2% roztwór albuminy w 0,9% al; kwasy: stęŝony 3; stęŝonego 2S 4 ; stęŝonego l; kwas glioksalowy; 2 M roztwór 3; 0,5% kwas sulfanilowy w 2 M l; 10% roztwór a 2; 0,5% roztwór a 2; 40% roztwór mocznika; 1% roztwór nitroprusydku sodu; 1% roztwór ( 3) 2Pb; 0,5% roztwór us 4; 10% roztwór a; 30% roztwór a; 0,1% roztwór ninhydryny w 50% etanolu; świeŝo przygotowany 1% roztwór αnaftolu w 50% etanolu; roztwór bromianu (I) sodu: 0,62 ml bromu rozpuszczonego w 100 ml 5% a, przed uŝyciem roztwór rozcieńczony 10 krotnie 5% a; a 2 3 in substantia; ( 4) 2S 4 in substantia; stęŝony 3aq.; papierki wskaŝnikowe; 8