BADANIE WŁAŚCIWOŚCI FIZYKOCHEMICZNYCH AMINOKWASÓW

Transkrypt

1 BADAIE WŁAŚIWŚI FIZYKEMIZY AMIKWASÓW IDETYFIKAJA AMIKWASÓW BIAŁKA, JAK I WLE AMIKWASY EAGUJĄ ZA PŚEDITWEM GUP: - 2 I Z IYDYĄ, DIITFLUBEZEEM I KWASEM AZTWYM (III). WYSTĘPWAIE W STUKTUZE AMIKWASÓW IY GUP FUKYJY, PÓZ AMIWEJ I KABKSYLWEJ, UMŻLIWIA IDETYFIKAJĘ TY AMIKWASÓW A PDSTAWIE ZUŁY EAKJI BAWY. eakcja biuretowa azwa pochodzi od biuretu, związku powstającego przy ogrzewaniu mocznika do 180. eakcję biuretową dają wszystkie połączenia zawierające w cząsteczce co najmniej 2 grupy --- połączone ze sobą bezpośrednio (np. w diamidzie kwasu szczawiowego ), poprzez azot (w biurecie) lub poprzez atom węgla (w diamidzie kwasu malonowego, bursztynowego, w produktach hydrolizy białek). W wyniku utworzenia połączenia koordynacyjnego u 2 z dwoma przyległymi wiązaniami -- powstaje barwny produkt. Dodatniego odczynu reakcji biuretowej nie dają wolne aminokwasy i dipeptydy. Do 1 ml danej próby dodać 1 ml a i kilka kropli 0,5% us 4 W obecności białka powstaje fioletowe zabarwienie. Uwaga: ponieważ niebieska barwa odczynnika może maskować właściwy odczyn należy unikać nadmiaru us 4. eakcja ninhydrynowa Aminokwasy pod wpływem ninhydryny ulegają utlenieniu poprzez iminokwasy do amoniaku, dwutlenku węgla i aldehydu uboższego o 1 atom węgla. W wyniku kondensacji cząsteczki zredukowanej i utlenionej ninhydryny z amoniakiem powstaje niebiesko-fioletowe zabarwienie, którego natężenie jest proporcjonalne do zawartości azotu aminowego aminokwasów ninhydryna zredukowana ninhydryna barwny kompleks

2 Do 1 ml próby badanej dodać 3-4 krople 0,1% roztworu ninhydryny w 50% etanolu. Po wymieszaniu próbę ogrzać do wrzenia. Wszystkie aminokwasy (oprócz proliny) reagują z ninhydryną tworząc niebieskie zabarwienie. eakcja ksantoproteinowa Aminokwasy aromatyczne oraz fenole ulegają reakcji nitrowania w czasie ogrzewania ze stężonym 3, dając żółto zabarwione pochodne nitrowe (fenyloalanina wymaga do nitrowania dodatku 2 S 4 ) Do 1 ml próby badanej dodać 0,5 ml stężonego 3 i ogrzewać na wrzącej łaźni wodnej przez 2 min. Wytrąca się żółty osad. eakcja Adamkiewicza Jest to reakcja charakterystyczna dla tryptofanu zawierającego pierścień indolowy. W obecności kwasu siarkowego i formaldehydu (kwas glioksalowy) dwie grupy indolowe ulegają kondensacji z wydzieleniem cząsteczki wody i dają barwny fioletowy związek. Schemat przebiegu reakcji: 2 Do 1 ml próby badanej dodać kilka kropli formaldehydu. Po wymieszaniu roztwór podwarstwić (po ściance) stężonym 2 S 4. a granicy cieczy powstaje fioletowy pierścień. eakcja Millona eakcja na wykrywanie tyrozyny jest mało specyficzna, ponieważ dodatni wynik dają również związki zawierające reszty fenolowe. Do 1 ml próby badanej dodać kilka kropli odczynnika Millona. Mieszaninę ogrzewać w łaźni wodnej przez kilka minut. W przypadku obecności tyrozyny pojawia się biały osad, który zabarwia się na żółto, a później na czerwono (lub powstaje czerwone zabarwienie roztworu). 2

3 Wykrywanie cysteiny i cystyny Zawarta w cysteinie i cystynie siarka w silnie zasadowym środowisku ulega uwolnieniu w postaci jonów siarczkowych, które z jonami Pb 2 dają czarny osad PbS. Metionina nie daje dodatniego wyniku w tej reakcji. Schemat przebiegu reakcji: S S Pb 2 S 2 Do 1 ml próby badanej dodać 1 ml roztworu octanu ołowiu i 3 ml 10% roztworu a (roztwór powinien być klarowny). Próbkę ogrzewać na łaźni wodnej, po kilku minutach pojawia się czarny osad. PbS Wykrywanie glutaminy Próba na obecność glutaminy wykorzystuje obecność w jej cząsteczce ugrupowania amidowego, z którego w warunkach hydrolizy zasadowej uwalnia się gazowy amoniak. Dodatni wynik tej reakcji dają też asparagina i sole amonowe. Do 3 ml próby badanej dodać 3 ml 10% a (roztwór dodać do probówki pipetą, tak aby nie dotknąć jej wylotu). ałość umieścić we wrzącej łaźni wodnej a do wylotu probówki zbliżyć zwilżony uniwersalny papierek lakmusowy. W przypadku obecności glutaminy papierek zmienia zabarwienie na niebieski Uwaga: należy uważać, aby nie dotknąć papierkiem brzegu probówki. wówczas zmiana zabarwienia papierka następuje na skutek obecności a a nie amoniaku. 3

4 BADAIE WŁAŚIWŚI FIZYK-EMIZY BIAŁEK Właściwości amfoteryczne białek Przygotować 2 kolbki. a) Do kolbki odmierzyć 5 ml 0,5% roztwory żelatyny, dodać 2-3 krople zieleni bromokrezolowej i zawartość dobrze wymieszać. astępnie miareczkować 0,01 M l aż do żółtego zabarwienia, co następuje przy p roztworu ok. 3. b) Powtórzyć doświadczenie używając jako wskaźnika błękit bromotymolowy i 0,01 M a. Miareczkować do uzyskania barwy niebieskiej, co następuje przy p roztworu ok. 8,9. a podstawie przeprowadzonego miareczkowania porównać ilość l i a zużytych do zmiany zabarwienia roztworu żelatyny przy zastosowaniu obu składników. Denaturacja cieplna białek grzać do zagotowania 2 ml roztworu białka jaja kurzego. Tworzy się biały osad wytrąconego białka. sad jest wyraźniejszy po dodaniu odrobiny al lub zakwaszeniu kwasem octowym. Denaturacja białek stężonym kwasem azotowym Do probówki odmierzyć około 1 ml stężonego roztworu 3 i następnie po ściance nachylonej probówki dodać wolno około 1 ml roztworu białka jaja kurzego tak, aby nie ulegając zmieszaniu nawarstwił się na roztwór kwasu. a granicy obu cieczy powstaje biały pierścień zdenaturowanego i skoagulowanego białka. Działanie etanolu na białko Do probówki dodać 1 ml roztworu białka jaja kurzego i 2 ml 96% etanolu. Po godzinie rozcieńczyć zawartość probówki wodą. Strąt nie rozpuszcza się. Strącanie białka za pomocą kationów (soli metali ciężkich) a) Do 2 ml roztworu białka jaja kurzego dodać kilka kropli 1% Fel 3. Wytrąca się brunatny osad białczanu żelazowego, który rozpuszcza się w nadmiarze odczynnika. b) Do 2 ml roztworu białka jaja kurzego dodać kilka kropli us 4. Powstaje jasnobłękitny osad białczanu miedziowego rozpuszczający się w roztworze 0,01 M a, dając kolor fioletowy (reakcja biuretowa). Strącanie białka za pomocą anionów a) Do 1 ml roztworu białka jaja kurzego dodać 1 ml 10% l 3 (TA). b) Do 1 ml roztworu białka jaja kurzego dodać kilka kropli 20% roztworu kwasu sulfosalicylowego. 4

5 Właściwości ochronne koloidów hydrofilowych Do 2 probówek odmierzyć po 1 ml 0,01 M roztworu Ag 3 i kilka kropli rozcieńczonego 3. Do pierwszej dodać 1 ml 0,5% roztworu żelatyny, a do drugiej 1 ml wody. Po zmieszaniu do obu probówek należy wprowadzić kroplami 2 ml 0,01 M roztworu al. W probówce z żelatyną nie wytrąca się osad Agl. znaczanie punktu izoelektrycznego kazeiny Białka są amfoterami wieloelektrolitowymi, stąd zmiany p roztworu powodują zmiany jonizacji grup funkcyjnych łańcuchów białkowych, co wpływa na ich rozpuszczalność. W p różnym od pi cząsteczki białka posiadają ładunek, co zmniejsza ich wzajemne przyciąganie, a w następstwie zwiększa się ich rozpuszczalność. atomiast w punkcie izoelektrycznym, kiedy cząsteczki pozbawione są ładunku elektrycznego, przyciąganie pomiędzy nimi jest największe, co prowadzi do ich wytrącania z roztworu. Kazeina charakteryzuje się najmniejszą rozpuszczalnością w punkcie izoelektrycznym. dpowiednio dobierając stężenia 3 i 3 a przygotowuje się szereg probówek z roztworami o różnych wartościach p. Dodaje się do nich jednakową ilość kazeiny. Wartość p w probówce, w której wystąpi najobfitszy osad, odpowiada pi kazeiny. Wykonanie Przygotować 9 suchych probówek. Do pierwszej odmierzyć 3,2 ml 1 M roztworu 3 i 6,8 ml 2, a do następnych ośmiu po 5 ml 2. Po dokładnym wymieszaniu zawartości w probówce pierwszej, przenieść z niej 5 ml do drugiej, a z tej, po wymieszaniu, 5 ml do trzeciej itd. Do każdej probówki dodać po 1 ml roztworu kazeiny i wymieszać. bserwować roztwory natychmiast po zamieszaniu i po 30 minutach. Wynik wpisać do tabelki: r próbki Liczba ml 1M 3 1,6 0,8 0,4 0,2 0,1 0,05 0,025 0,012 0,006 p roztworu 3,5 3,8 4,1 4,4 4,7 5,0 5,3 5,6 5,9 Zmętnienie sad Zagadnienia do przygotowania: 1. Aminokwasy białkowe wzory strukturalne i skróty. 2. Aminokwasy niebiałkowe. 3. Wiązanie peptydowe struktura i właściwości. 4. Poziomy organizacji łańcucha polipeptydowego w białkach. 5. Właściwości fizykochemiczne białek. 6. Denaturacja i renaturacja. 7. Klasyfikacja białek. 5