Laboratorium biotechnologia ogólna dla studentów kierunku biotechnologia od 2014/2015 WYTWARZANIE I ANALIZA PRODUKTÓW MLECZNYCH

Transkrypt

1 Bakterie fermentacji mlekowej Bakterie fermentacji mlekowej (ang. lactic acid bacteria, LAB) są grupą mikroorganizmów wyróżnioną ze względu na właściwości metaboliczne fermentację cukrów w warunkach mikroaerofilnych lub ściśle beztlenowych z kwasem mlekowym jako głównym produktem fermentacji glukozy. Cechy charakterystyczne LAB: - grupa silnie zróżnicowana morfologicznie (pałeczki, laseczki, formy kuliste), - nie wytwarzają przetrwalników, - są Gram-dodatnie, - są beztlenowcami bądź względnymi beztlenowcami, - mają zdolność rozkładu laktozy do kwasu mlekowego dzięki wytwarzaniu enzymu β-galaktozydazy, - są katalazo-ujemne, - tolerują niskie ph, - nie posiadają cytochromów i funkcjonalnego Cyklu Krebsa - nie posiadają rzęsek, - nie redukują azotanów, - nie są zdolne do wzrostu na podłożach minimalnych, wymagają dodatku do podłoża większości witamin i aminokwasów. Do grupy LAB zaliczane są: ziarniaki gramdodatnie (Streptococcus, Lactococcus, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus), gramdodatnie pałeczki z rodzaju Lactobacillus oraz rodzaj Bifidobacterium. Naturalnym środowiskiem występowania LAB jest mleko, rośliny, kiszonki, a także błony śluzowe oraz przewód pokarmowy człowieka i zwierząt. Stanowią zanieczyszczenia produktów fermentacji alkoholowej (piwo, wino), produktów mleczarskich i przetworów mięsnych. Bakterie fermentacji mlekowej różnią się między sobą: - ilością produkowanego kwasu mlekowego zależnie od gatunku od 0,6 do 3%, - tolerancją na niskie ph środowiska, - optymalnymi temperaturami rozwoju, - sposobem metabolizowania cukrów, - środowiskiem bytowania. Podział LAB Podział bakterii fermentacji mlekowej ze względu na wymagania temperaturowe: - mezofile - optymalna temp C, produkcja do 1,5% kwasu mlekowego, Lactococcus lactis (paciorkowiec mlekowy), Lactococcus cremoris (paciorkowiec śmietanowy), Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum, Leuconostoc (Leuconostoc citrovorum - bywa używany jako dodatek do zakwasów przy wyrobie masła), - termofile optymalna temp C, produkcja do 3% kwasu mlekowego, Lactobacillus delbrueckii, Streptococcus thermophilus Podział bakterii mlekowych ze względu na szlaki przemian cukrów: - homofermentatywne (produkt końcowy: kwas mlekowy), Lactococcus lactis, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus plantarum (gatunek względnie homofermentatywny), Lactobacillus acidophilus, - heterofermentatywne (produkt końcowy: kwas mlekowy, kwas octowy i alkohol etylowy), Leuconostoc, niektóre z rodzaju Lactobacillus, np.: Lactobacillus brevis, Lactobacillus fermentum. Bakterie pseudomlekowe (Micrococcus i Microbacterium) p.: Bacterium gracile, Bacterium mannitopeum - biologiczne odkwaszanie wina, zmętnienie, nieprzyjemny zapach i smak. Homo- i heterofermentacja mlekowa W homofermentacji, przebiegającej wg szlaku EMP, z jednego mola glukozy powstają dwa mole pirogronianu ulegającego redukcji do kwasu mlekowego (pod wpływem dehydrogenazy mleczanowej i w obecności NADH). Kwas mlekowy jest więc głównym produktem końcowym homofermentacji stanowi ponad 85-90% metabolitów przy niewielkim udziale kwasu octowego i CO 2 (powstają w wyniku dekarboksylacji niewielkiej ilości pirogronianu).

2 Hydroliza laktozy u bakterii LAB. Wolna laktoza (u bakterii termofilnych) hydrolizowana wewnątrz komórki do glukozy i galaktozy (β-galaktozydaza), glukoza wchodzi w szlak glikolityczny (EMP)bezpośrednio, galaktoza jest przekształcana w ufosforylowaną glukozę w szlaku Leloira. Ufosforylowana laktoza (u bakterii mezofilnych) jest hydrolizowana przez fosfo-βgalaktozydazę do glukozy i galaktozo-6-fosforanu, który następnie jest przekształcany do fosfodihydroksyacetonu i aldehydu trifosfoglecerynowego (szlak tagatozowy) i w takiej postaci są włączane do szlaku EMP. W przypadku heterofermentacji glukoza ulega glikolizie w szlaku HMP, a częściowo w szlaku EMP. W wyniku tych przemian na każdy mol kwasu mlekowego powstaje dodatkowo 1 mol etanolu lub kwasu octowego oraz 1 mol dwutlenku węgla. Końcowym produktem heterofermentacji jest więc tylko w około 50% kwas mlekowy. Pozostałe metabolity stanowią głównie kwas octowy, etanol i CO 2. Ponadto, w trakcie fermentacji mlekowej u obu typów bakterii powstają śladowe ilości dodatkowych produktów ubocznych nadających charakterystyczne cechy organoleptyczne powstającym produktom fermentacji: diacetyl, acetoina, aldehyd octowy, w mniejszych ilościach: kwasy lotne (propionowy, mrówkowy), lotne kwasy tłuszczowe, alkohole, aceton i estry. Na przykład Streptococcus diacetilactis, pałeczka heterofermentatywna, wytwarza niewielkie ilości kwasu octowego, etanolu oraz diacetylu związek ten odpowiada za powstawanie świeżego zapachu masła. Specyficzny rodzaj heterofermentacji mlekowej przeprowadzają bifidobakterie jest to to szlak fosfoketolazy pentozowej. Ten odrębny szlak jest wynikiem obecności u bifidobakterii specyficznych enzymów zastępujących kluczowe enzymy odpowiedzialne za przeprowadzanie typowej fermentacji mlekowej. Sumaryczny schemat heterofermentacji typu Bifidobacterium przedstawia się następująco: 2 C 6H 12O 6 2 CH 3-CHOH-COOH + 3 CH 3COOH glukoza kwas mlekowy kwas octowy Charakterystyka LAB Rodzaj Lactobacillus: L. acidophilus, L. amylovorus, L. casei, L. crispatus, L. gasseri, L. johnsonii, L. paracasei, L. plantarum, L. reuteri, L. rhamnosus. - Grupa I bezwzględnie homofermentatywne (fermentują heksozy do kwasu mlekowego, pentozy i glukonian nie fermentują). Obejmuje 15 gatunków, z których tylko: L. delbrueckii, L. helveticus, L. acidophilus są wykorzystywane w mleczarstwie. - Grupa II względnie heterofermentatywne (fermentują heksozy do kwasu mlekowego, pentozy do kwasu mlekowego i kwasu octowego z udziałem indukowanej fosfoketolazy). Obejmuje 11 gatunków, z których tylko L. casei jest wykorzystywany w mleczarstwie. - Grupa III bezwzględne heterofermentatywne (fermentują heksozy do kwasu mlekowego, kwasu octowego lub etanolu i CO 2, pentozy do kwasu mlekowego i kwasu octowego. W obu drogachmetabolicznych uczestniczy fosfoketolaza. Obejmuje 18 gatunków, spośród których: L. brevis, L. fermentum, często wykorzystywane w mleczarstwie. Rodzaj Lactococcus: Optymalna temp. wzrostu C. Wykorzystanie: - L. lactis ssp. lactis zdolne do fermentowania cytrynianu i tworzenia diacetylu - istotne znaczenie dla uzyskania aromatu masła; - składnik szczepionek mleczarskich wykorzystywanych w produkcji serów dojrzewających, twarogowych, masła, napojów fermentowanych. Rodzaj Leuconostoc: Optymalna temp. wzrostu C; heterofermentatywne (produkcja kwasu mlekowego i etanolu). Wykorzystanie: - produkcja serów typu holenderskiego (edam, gouda) - tworzenie CO 2 zdolność tworzenia diacetylu - produkcja kiszonek roślinnych - odpowiada za pierwsze etapy fermentacji - produkcja dekstranu (L. dextranicum) Rodzaj Bifidobacterium: Naturalnym środowiskiem ich występowania jest przewód pokarmowy człowieka i zwierząt. Wykorzystanie: - składnik szczepionek - do produkcji mlecznych napojów fermentowanych, mieszanek mlecznych przeznaczonych dla dzieci. Właściwości Bifidobacterium bifidum: - hamują rozwój bakterii Salmonella i Shigella, E. coli, odpowiedzialnych za biegunki u niemowląt i dzieci, a także Campylobacter i Helicobacter pylori wywołujących stany zapalne i owrzodzenia żołądka i dwunastnicy; - regulują nieprawidłowości fizjologiczne; - eliminują wzdęcia, zaparcia, niestrawność; - obniżają zawartość cholesterolu we krwi;

3 - przywracają równowagę biologiczną po leczeniu antybiotykami; - nie wywołują reakcji alergicznych; - nie syntetyzują związków toksycznych. Otrzymywanie i zastosowanie kwasu mlekowego Do celów spożywczych i farmaceutycznych kwas mlekowy pozyskiwany jest na drodze biologicznej z hodowli czystych kultur bakterii fermentacji mlekowej przeprowadzających homofermentację. Maksymalne stężenia kwasu mlekowego powstającego w pożywce hodowlanej sięgają 0,6-3,0%. Stosowane podłoża zawierają dodatek węglanu wapnia, dzięki czemu powstający kwas mlekowy jest neutralizowany, a po zakończeniu fermentacji odzyskiwany z mleczanu wapnia za pomocą kwasu siarkowego. Roztwór kwasu mlekowego po oddzieleniu od gipsu poddawany jest oczyszczaniu i zagęszczeniu do 50% - jest to gotowa postać trafiająca na rynek. Wydajność praktyczna tego bioprocesu wynosi 80-90% wydajności teoretycznej. Podłoża przemysłowe zawierają jako główny składnik cukier spożywczy (sacharozę) lub melasę buraczaną oraz skiełkowany jęczmień (słód) będący stymulatorem wzrostu. W wyniku naturalnej fermentacji sacharozy powstaje właśnie kwas mlekowy. Naturalny kwas mlekowy służy jako środek zakwaszający, konserwujący (właściwości bakteriostatyczne i bakteriobójcze) oraz poprawiający walory smakowe. Właściwości bakteriostatyczne (przy ph=5,0-6,8) i bakteriobójcze (ph<5,0) kwasu mlekowego wykazano wobec takich patogenów, jak E. coli, Salmonella sp., Pseudomonas aeruginosa i in. W przemyśle spożywczym stosowany jest do następujących celów: - produkcja przetworów owocowych i warzywnych (ogórki konserwowe, dodatek do ogórków kiszonych, papryka konserwowa, pieczarki i warzywa marynowane, mizerie, sałatki warzywne, dżemy, marmolady), - produkcja przetworów rybnych, - produkcja napojów (poprawa smaku, uwydatnienie naturalnego aromatu owocowego, właściwości konserwujące stosowany jako zamiennik kwasu benzoesowego i askorbowego), - piwowarstwo, winiarstwo, - piekarnictwo (do korygowania kwasowości ciasta), - mleczarstwo (do korygowania kwasowości mleka przy wyrobie serów, do zakwaszania śmietany), - produkcja przetworów mięsnych. Ponadto, w rolnictwie kwas mlekowy używany jest w żywieniu trzody chlewnej, drobiu, w przygotowaniu kiszonek paszowych oraz w lecznictwie zwierząt (preparaty przeciwko biegunce prosiąt). Zastosowanie kwasu mlekowego do produkcji kiszonek paszowych powoduje szybkie obniżenie ph środowiska, a dzięki temu hamuje rozwój pleśni i innych szkodliwych mikroorganizmów gnilnych. Ogranicza to istotnie straty w produkcji kiszonek. Naturalna mikroflora mleka i proces metabiozy Głównymi mikroorganizmami tworzącymi naturalną mikroflorę mleka są bakterie fermentacji mlekowej i pseudomlekowej, bakterie gnilne oraz bakterie fermentacji masłowej. W trakcie przechowywania mleka zachodzi jego naturalne kwaśnienie oparte na fermentacji mlekowej. Zmiany jakościowe i ilościowe drobnoustrojów z poszczególnych grup w trakcie kwaszenia mleka mają charakter metabiozy, czyli typowej sukcesji ekologicznej. Polega ona na następczym rozwoju danych gatunków mikroflory po zakończeniu rozwoju innych mikroorganizmów. W pierwszym etapie kwaszenia zachodzi rozwój bakterii tzw. niewłaściwej fermentacji mlekowej. Powodują one zakwaszenie środowiska, co ułatwia rozwój bakterii z gatunków przeprowadzających właściwą fermentację mlekową. Jako pierwsze rozwijają się bakterie z grupy paciorkowców (tolerujących stężenie kwasu mlekowego na poziomie nie przekraczającym 1% przede wszystkim Streptococcus lactis), a następnie pałeczki kwasu mlekowego bardziej oporne na wyższe stężenia kwasu mlekowego - typu Lactobacillus lactis. W końcu zaczynają się pojawiać bakterie fermentacji propionowej z rodzaju Propionibacterium, a wreszcie w szerokim zakresie temperatur Oidium lactis, a na samym końcu zaczynają dominować bakterie proteolityczne. Bakterie kwasu propionowego produkują w wyniku fermentacji laktozy i innych cukrów głównie kwas propionowy, a także inne składniki (np. kwas octowy) nadające charakterystyczny zapach i smak dojrzewającym serom oraz sprzyjają powstawaniu oczek. Po zakończeniu fermentacji mlekowej należy odciąć fermentowany produkt od dostępu powietrza z uwagi na możliwość rozwoju nadmiernych ilości drożdżaków oraz grzybów pleśniowych. Działalność tych drobnoustrojów prowadzi do spadku kwasowości środowiska, a konsekwencji ułatwia rozwój bakterii gnilnych. Jednym z końcowych etapów sukcesji w kwaśniejącym mleku są tzw. białe pleśnie z gatunku Oidium lactis (syn. Oospora lactis) należące do grzybów niedoskonałych. Grzyby te wykorzystują laktozę, jak i kwas mlekowy jako źródło węgla i energii, przez co stwarzają bezpośrednio warunki dla wzrostu bakterii proteolitycznych bezpośrednio prowadzących do psucia się mleka. Konserwacja i obróbka mleka Do produkcji mlecznych napojów fermentowanych oraz innych przetworów mlecznych (serów) stosowane jest obecnie wyłącznie mleko o odpowiednich parametrach fizykochemicznych oraz konserwowane dzięki procesowi pasteryzacji lub krótkotrwałej sterylizacji. Mleko służące do produkcji przetworów jest także zwykle poddawane homogenizacji lub zagęszczaniu. Stosowane są następujące typy mleka:

4 1. mleko pasteryzowane: jest to surowe mleko poddane działaniu wysokiej temperatury rzędu 100 C. Taka obróbka jest wystarczająca do wyeliminowania większości bakterii chorobotwórczych, a pozostawienia mikroflory ciepłoopornej przetrwalnikującej stanowiącej naturalną mikroflorę mleka. Są 3 rodzaje takiej obróbki: a. niska długotrwała: min. w temp C (klasyczna pasteryzacja) stosowana do przygotowania mleka w produkcji serów. b. wysoka krótkotrwała: s w temp C. c. wysoka momentalna: 2-5 s w temp C stosowana do produkcji mleka w proszku. 2. Mleko sterylizowane: jest to mleko poddawane działaniu temperatury C przez kilka sekund. Tzw. mleko UHT to odmiana poddawana działaniu temp. 132 C przez 1-2 s. Mleko sterylizowane ma długi termin przydatności do spożycia, jest jałowe w znaczeniu mikrobiologicznym, jednak zawartość witamin jest zmieniona w porównaniu z mlekiem pasteryzowanym. 3. Mleko homogenizowane: mleko powstające przez rozbicie kropelek tłuszczu do małych rozmiarów. Jest dzięki temu procesowi łatwiej trawione i przyswajane. 4. Mleko zagęszczone: powstaje z mleka pełnotłustego, poddawanego homogenizacji. Następnie wyznacza się dokładną zawartość tłuszczu i poddaje sterylizacji. Stanowi bogate źródło wapnia i fosforu. Produkowana jest także odmiana słodzona zawierająca 45% glukozy w tym przypadku nie jest konieczna sterylizacja ani pasteryzacja. 5. Śmietanka: jest to produkt wzbogacony w tłuszcz (9-36%) otrzymywany przez wirowanie. Zawiera dużo witaminy A oraz wapnia i fosforu. Produkcja fermentowanych napojów mlecznych Na świecie znanych jest około 400 napojów otrzymywanych na bazie fermentowanego mleka. Najpopularniejszymi fermentowanymi napojami mlecznymi są zsiadłe mleko, maślanka, jogurty oraz kefiry. Proces produkcji wszystkich tych napojów polega na przeprowadzeniu fermentacji mlekowej, czyli ukwaszeniu mleka za pomocą odpowiednich zaszczepów mleczarskich. W przypadku produkcji kefiru prowadzona jest fermentacja mlekowo-alkoholowa. Najprostszą technologię stanowi produkcja zsiadłego mleka i maślanki. Proces prowadzony jest w temperaturze ok. 25 C. W skład zaszczepów wchodzą głównie ziarniaki Lactococcus lactis, Lactococcus cremoris oraz rzadziej Lactococcus diacetilactis. Tradycyjne jogurty przygotowywane są natomiast z zaszczepów dwóch gatunków: Streptococcus thermophilus i Lactobacillus bulgaricus. Oba szczepy tworzą w procesie otrzymywania jogurtu układ symbiotyczny ziarniaki wytwarzają niewielkie ilości kwasu mrówkowego i CO 2 (z obecnego w mleku mocznika) będące stymulatorami wzrostu pałeczek Lactobacillus. Pałeczki z kolei dostarczają ziarniakom aminokwasy i peptydy powstałe w wyniku ich wysokiej aktywności proteolitycznej, której ziarniaki są pozbawione. Kwaszenie mleka w produkcji jogurtu trwa bardzo krótko 4-5 h z uwagi na wysoką temperaturę procesu (43 C). Do zagęszczania jogurtu stosuje się dodatek odtłuszczonego mleka w proszku lub białek mleka. Najnowsze tendencje w produkcji jogurtów to tzw. biojogurty czyli jogurty łagodne. Produkuje się w sposób tradycyjny, jednak szczepionki mają zmieniony skład mikroflory (zawierają dodatkowo m.in. Lactobacillus acidophilus i Bifidobacterium sp.). W efekcie uzyskuje się jogurty o delikatniejszym smaku, prawie pozbawione kwaskowości i charakterystycznego zapachu pochodzących od aldehydu octowego. W produkcji kefiru stosuje się najbardziej skomplikowane struktury zaszczepowe zwane grzybkami kefirowymi lub ziarnami kefirowymi. Grzybki kefirowe są strukturami symbiotycznymi, w których skład wchodzi wiele gatunków bakterii (85% mikroflory) oraz grzybów z grupy drożdżaków (15% mikroflory). Najliczniejsze gatunki tworzące grzybki kefirowe stanowią: - pałeczki: L. acidophilus, L. brevis, L. casei, L. fermentum, L. delbrueckii, L. helveticus, L. kefiri, L. kefiranofaciens, L. plantarum, - paciorkowce: Lactococcus lactis, Streptococcus thermophilus, Leuconostoc mesenteroides, - drożdże: Candida kefyr, C. crusei, C. lambica, Cryptococcus humicolus, Debaromyces hansenii, Geotrichum candidum, Kluyveromyces marxianus, Saccharomyces unisporus, S. cerevisiae, S. exiguus, Zygosaccharomyces sp. Charakterystyczne walory smakowo-zapachowe kefiru są wynikiem mieszanej fermentacji mlekowo-alkoholowej zachodzącej w trakcie jego kiszenia. Kefir młody (słabo kwaśny) otrzymuje się w czasie 5-24 h fermentacji, kefir średni po 48 h, a kefir mocny, o największej kwasowości i lekko alkoholowym posmaku (do 0,8% alkoholu), po 72 h fermentacji. Produkcja prowadzona jest w temperaturze o C. Produkcja kiszonek spożywczych i paszowych Kiszenie warzyw i pasz służy do zakonserwowania produktu roślinnego. Polega to na pobudzeniu fermentacji mlekowej w kiszonej masie roślinnej. Powstający w jej wyniku kwas mlekowy w odpowiedniej ilości (stężeniu) staje się podstawowym czynnikiem konserwującym kiszonkę. Prawidłowe kiszenie ma więc za zadanie stworzenie optymalnych warunków do rozwoju naturalnej mikroflory roślinnej zdominowanej przez bakterie mlekowe. Uzyskuje się to poprzez odpowiednie przygotowanie materiału roślinnego rozdrobnienie (uzyskanie homogennej pod względem składu chemicznego masy roślinnej), dokładne ubicie masy (indukowanie warunków beztlenowych) oraz dostarczenie odpowiedniej ilości substratów do fermentacji mlekowej zwykle odpowiednia ilość cukru, ewentualnie także dodatek stymulatorów wzrostu bakterii (substancje azotowe rośliny o dużej zawartości białka lub serwatka). Konieczne jest zwłaszcza zapewnienie tzw. minimum cukrowego, które stanowi ilość cukru pozwalająca na szybkie wytworzenie kwasu mlekowego zapewniającego spadek ph środowiska do wartości około

5 4,2. Jest to odczyn skutecznie hamujący rozwój większości mikroorganizmów szkodliwych w procesie kiszenia żywności. W przypadku produktów trudno poddających się kiszeniu (np. ogórki) stosuje się dodatkowo solenie, które zabezpiecza materiał przed rozwojem szkodliwych drobnoustrojów, natomiast nie hamuje istotnie rozwoju bakterii mlekowych tolerujących dość wysokie zasolenie. Do mikroorganizmów szkodliwych mogących się pojawiać w nieprawidłowo przygotowywanych kiszonkach należą głównie: - bakterie gnilne zarówno tlenowe, jak i beztlenowe (Pseudomonas, Bacillus, Serratia bakterie te powodują psucie się żywności dzięki właściwościom proteolitycznym), - bakterie fermentacji masłowej (różne gatunki Clostridium), - bakterie celulolityczne i pektynolityczne (wywołują mazistość poprzez naruszenie struktury tkanek roślinnych), - bakterie rzekomej fermentacji mlekowej (gł. E. coli i Aerobacter aerogenes produkują dwutlenek węgla oraz niepożądane produkty o charakterze kwasów organicznych). Ponadto mogą się rozwijać drożdże i pleśnie. Rozwój pleśni jest zawsze szkodliwy dla produktów kiszenia produkują substancje toksyczne, rozkładają tkanki roślinne (dzięki wytwarzaniu proteaz, pektynaz i celulaz), mogą wykorzystywać jako substraty pokarmowe kwasy organiczne powodując w ten sposób wtórny spadek kwasowości środowiska mogący prowadzić do rozwoju bakterii gnilnych. Natomiast obecność niewielkich ilości drożdży jest czynnikiem stabilizującym mikroflorę kiszonki, ponieważ produkują alkohol zaostrzający smak i działający jako dodatkowy konserwant oraz wytwarzają wiele witamin i substancji wzrostowych dla bakterii mlekowych. Problemem staje się nadmierny rozwój drożdży w kiszonce; wtedy drożdże stają się dominującym składnikiem mikroflory skutecznie konkurującym z bakteriami fermentacji mlekowej. Do fermentowanych produktów roślinnych zaliczamy także zakwas buraczany (otrzymywany przez spontaniczną fermentację rozdrobnionych buraków czerwonych), sosy sojowe, herbaty czarne i czerwone, fermentowane liście winogron, fermentowane oliwki i inne. Fermentowane produkty mięsne Fermentacja jest również metodą konserwacji surowego mięsa stanowiącą alternatywę dla utrwalania mięsa za pomocą solenia, suszenia, bądź wędzenia. Obecnie fermentację wykorzystuje się do produkcji wędlin dojrzewających np. salami (produkowana od 250 lat), metka. W mięsie występuje zbyt mała ilość cukrów, aby efektywnie przebiegała fermentacja mlekowa. Z tego względu do rozpoczęcia procesu fermentacji konieczny jest dodatek cukrów prostych w ilości 0,4-0,8%. W wyniku fermentacji mlekowej następuje szybkie obniżenie ph w mięsie zapobiegające rozwojowi szkodliwych bakterii gnilnych rozkładających aminokwasy. Jako zaszczepy stosowane są obecnie czyste kultury bakterii mlekowych z rodzaju Lactobacillus sp. (głównie L. sakei, L. curvatus, L. plantarum), a także Pediococcus sp. (P. acidilactici, P. pentosaceus). Dodatkowo, na etapie dojrzewania, stosuje się zaszczepy zawierające czyste kultury drożdży (Debaromyces hansenii, Candida famata) i pleśni (głównie Penicillium sp.). Temperatura fermentacji jest dość niska - mieści się zazwyczaj w zakresie C. W wyższych temperaturach oraz przy wysokiej wilgotności zachodzi niebezpieczeństwo rozwoju drobnoustrojów chorobotwórczych. Cały proces dojrzewania wędlin trwa od kilku dni do 8 tygodni. Właściwości organoleptyczne gotowych produktów fermentowanych są unikatowe i bardzo cenione. Immobilizacja enzymów Immobilizacja, inaczej zwana unieruchomieniem, jest zespołem technik, które prowadzą do częściowego lub całkowitego ograniczenia możliwości ruchu, poprzez związanie z nośnikiem cząsteczek, substancji, czy też materiałów biologicznych. Główne metody immobilizacji: - unieruchomienie na powierzchni nośnika, - unieruchomienie wewnątrz nośnia, - unieruchomienie bez udziału nośnika. Immobilizacja na powierzchni nośnika opiera się ona na powinowactwie immobilizowanego czynnika (mikroorganizm, enzym, substancje zapachowe, itp.) do nośnika. W metodzie tej wyróżniamy dwie grupy: - Adsorpcja polega na wytworzeniu wiązań wodorowych, oddziaływań: elektrostatycznych, van der Waalsa oraz hydrofobowych. Jest to metoda tania i prosta, jednak bardzo wrażliwa na zmiany w środowisku (ph, temp.), w wyniku czego często dochodzi do desorpcji. - Immobilizacja poprzez wiązania kowalencyjne polega natomiast na wytworzeniu trwałych wiązań chemicznych, przez co układ jest stabilny i bardziej trwały. Wymaga to jednak często zastosowania czynników wiążących o właściwościach toksycznych, które wykluczają zastosowanie tej metody w technologii żywności. Stosowanymi nośnikami w unieruchamianiu powierzchniowym są: szkło porowate, drewno, celuloza, ziemia okrzemkowa, pumeks, polimery syntetyczne, spieki ceramiczne oraz tlenki metali. Jako czynniki wiążące stosuje się aldehyd glutarowy, bromocyjan, diaminy, kwasy dikarboksylowe. Zamykanie wewnątrz nośnika opiera się na wykorzystaniu materiałów, które tworzą porowate, półprzepuszczalne membrany, umożliwiające dyfuzję. W metodzie tej wyróżniamy trzy grupy:

6 - Pułapkowanie (inkluzja) jest metodą, w której dana substancja zostaje zawieszona w żelu naturalnym bądź syntetycznym, po czym powstała mieszanina poddawana jest sieciowaniu. W wyniku tego powstają najczęściej kuleczki o wielkości rzędu kilkudziesięciu μm do paru mm. - Mikrokapsułkowanie polega na utworzeniu kapsułek, w których wyróżniono dwie warstwy: pierwszą jest rdzeń, który może występować w postaci gazowej, ciekłej lub stałej, natomiast drugą warstwę stanowi otoczka utworzona z żelowego polimeru lub półprzepuszczalnej membrany. W metodzie tej możliwe jest utworzenie kilku warstw otoczki, których zadaniem jest lepsza ochrona materiału w rdzeniu przed oddziaływaniem czynników zewnętrznych. - Zamykanie biokatalizatorów wewnątrz przegród zbudowanych z półprzepuszczalnych membran, co umożliwia swobodny przepływ małocząsteczkowych substratów i produktów. W przypadku zastosowania mikroorganizmów, metoda ta nie zmniejsza ich aktywności oraz nie hamuje ich wzrostu. Wyżej wymienione metody nie wymagają użycia skomplikowanych urządzeń, cechują się prostotą oraz są ekonomiczne, jednak posiadają kilka istotnych wad, uniemożliwiających ich szersze zastosowanie. Kapsuły niecałkowicie spełniają swoją rolę w przypadku immobilizacji mikroorganizmów, gdyż ograniczają ich wzrost i aktywność, a ponadto część komórek przenika do pożywki. Bardzo często już sam proces sieciowania, przy zastosowaniu syntetycznych nośników, wykazuje toksyczność. W przypadku półprzepuszczalnych membran, dużym minusem jest przenikanie jedynie małocząsteczkowych substancji; cząsteczki o większych rozmiarach uniemożliwiają swobodny przepływ metabolitów. Jako nośniki w powyższych metodach stosuje się: alginian, karageny, agar, chitozan, pektynę, żelatynę, poliakryloamid, poliuretan, pochodne celulozy, membrany nylonowe, silikonowe, liposomowe, poliwęglanowe. Immobilizacja bez udziału nośnika, zwana inaczej flokulacją, polega na tworzeniu agregatów przez drobnoustroje. W tym procesie wykorzystywana jest naturalna zdolność mikroorganizmów do oddziaływania fizycznego lub chemicznego z grupami funkcyjnymi ścian komórkowych, w wyniku czego zostają one połączone. W celu zwiększenia tego zjawiska stosuje się zmianę ph, składu pożywki, stężenia tlenu, a także innych czynników. Zaletą tej metody jest znaczne zwiększenie koncentracji biomasy, a co za tym idzie aktywności mikroorganizmów, bez stosowania nośników. Zalety immobilizacji: - możliwość wielokrotnego wykorzystania biokatalizatora, - zwiększenie stabilności, reaktywności oraz wydłużenie aktywności biokatalizatora/substancji czynnej, - łatwiejsze oddzielenie końcowego produktu od biomasy, - eliminacja fazy namnażania, dzięki czemu niemal od razu mikroorganizmy przystępują do produkcji pożądanej substancji (dodatkowo ulega skróceniu czas fermentacji), - zwiększenie koncentracji pożądanych substancji w bioreaktorze, - ułatwienie prowadzenia procesów ciągłych, ich automatyzację i kontrolę, - zmniejszenie występowania zakażeń mikrobiologicznych, - eliminacja niektórych etapów produkcji (mniejsze zapotrzebowanie na energię, sprzęt, siłę roboczą), - lepsze wykorzystanie bioreaktora przy procesach ciągłych, - możliwość zastosowania wydajniejszego mieszania i napowietrzania medium, co może sprzyjać lepszemu wykorzystaniu substratów, - ochrona immobilizowanej substancji, - kontrolowane uwalnianie produktów. Wady immobilizacji: - ograniczenia dyfuzyjne dot. przenikania substratów i produktów, - trudności z utrzymaniem długotrwałej stabilności nośnika, - zmiany metaboliczne wywołane unieruchomieniem i długotrwałym wykorzystaniem tych samych komórek, - przenikanie/uwalnianie komórek do pożywki, - strata aktywności biokatalizatorów wraz z upływem czasu. Rodzaje nośników Nośniki organiczne. Naturalne biopolimery cieszą się dużym zainteresowaniem w procesach immobilizacji ze względu na szereg zalet. Posiadają wiele grup funkcyjnych, co wpływa na stabilizację biokatalizatorów/substancji w strukturze żelu. Układy takie są hydrofilowe, biodegradowalne, biokompatybilne oraz tanie. Jednak ich niska odporność mikrobiologiczna, wrażliwość na rozpuszczalniki organiczne oraz wąski zakres ph, w którym nośniki są stabilne, niestety bardzo często przekreśla możliwość ich zastosowania. Najchętniej stosowanymi biopolimerami są: agar, chitozan, alginian, karageny, pochodne celulozy i inne. W celu polepszenia ich właściwości naturalnych polimerów stosuje się liczne modyfikacje, np. nośniki hybrydowe, kopolimery, nowe czynniki sieciujące. W ostatnim czasie coraz więcej uwagi zwraca się na możliwość zastosowania syntetycznych polimerów. Podobnie jak naturalne, posiadają liczne oraz o zróżnicowanym charakterze grupy funkcyjne. Dodatkowo niewątpliwie ich zaletą jest możliwość

7 regulowania ich struktury na poziomie makromolekularnym, a mianowicie dobór właściwej masy cząsteczkowej, struktury przestrzennej oraz sposób i kolejność rozmieszczenia poszczególnych aktywnych grup funkcyjnych w łańcuchu. Na etapie ich syntezy można wpływać na ich budowę, co może z kolei w konsekwencji regulować porowatość, średnicę porów oraz inne właściwości fizyczne nośnika, takie jak jego polarność, hydrofobowość, a także zmieniać charakter chemiczny powierzchni poprzez występujące określone grupy funkcyjne. Ponadto nośniki takie mogą przybierać najróżniejsze kształty (rurki, membrany, powłoki, nośniki o różnych kształtach od kulistych do owalnych), są łatwo dostępne i stosunkowo tanie, jednak mają ograniczoną możliwość regeneracji, a sam proces ich sieciowania zazwyczaj jest toksyczny. Dodatkowo polimery takie nie są z reguły biodegradowalne. Najczęściej stosowanymi polimerami syntetycznymi jako nośniki, są pochodne polimetakrylanów, poliamin, poliakrylany. Alginiany są jednymi z najczęściej stosowanych polimerów naturalnych do immobilizacji. Pozyskiwane są w wyniku ekstrakcji ze ścian komórkowych alg, należących do klasy Brunatnic (Phaeophyceae). Tworzą one jednowartościowe sole kwasu alginowego, np. alginian sodu, który jest szeroko wykorzystywany w różnych dziedzinach przemysłu. Cząsteczka alginianu jest liniowym kopolimerem zbudowanym z kwasu α-l-guluronowego (G) i β-d-mannuronowego (M). Te dwa monomery zawierające grupy karboksylowe powodują, iż alginian jest typowym polianionem. W cząsteczce alginianu można wyróżnić trzy regiony. Region zbudowany z kwasu guluronowego (G) lub mannuronowego (M) oraz region mieszany (MG). Alginiany zawierające w swoim składzie dużą ilość regionów G formują żele sztywne i kruche, które ulegają synerezie (kurczenie się żelu z wydzieleniem wody), natomiast alginiany zawierające dużo regionów M oraz MG, tworzą żele słabe, lecz elastyczne, które łatwo się deformują, ale są odporne na synerezę. Monomery alginianu różnią się miedzy sobą sposobem wiązania oraz strukturą przestrzenną. Dlatego regiony M przybierają kształt rozciągniętej wstążki, natomiast regiony G są regularnie pozaginane. Skutkiem tego jest tworzenie pustych przestrzeni pomiędzy dwoma monomerami G, odpowiadającymi idealnie rozmiarom jonu wapnia, co wiąże się z wykazywaniem większego ich powinowactwa do tych jonów (niż do jonów sodu). Dodanie jonów wapnia do algianianu bogatego w regiony G powoduje powstanie żelu. Regiony M posiadają słabe powinowactwo do jonów wapnia, przez co w żelu będą tworzyły się rejony plastyczne lub wręcz ciekłe. Algianian sodu dodatkowo tworzy żele w obecności jonów innych metali wielowartościowych, np.: baru, kobaltu, cynku, miedzi, żelaza, glinu, jednak brak biokompatybilności tak wytworzonych żeli, powoduje, iż nie są one stosowane. Alginian wapnia jest jednym z lepszych nośników do immobilizacji biokatalizatorów. Na fakt ten wpływają takie czynniki, jak: obecność grup karboksylowych, hydrofilowość, naturalne pochodzenie, stosunkowo dobra wytrzymałość mechaniczna, a także bardzo tania i łatwa procedura otrzymywania żelu, który jest nietoksyczny i łagodny dla immobilizowanego materiału. Nośniki nieorganiczne. Nośniki nieorganiczne posiadają dużą odporność chemiczną, fizyczną oraz biologiczną. Istotną wadą tych nośników jest występowanie małej liczby grup funkcyjnych, co uniemożliwia dostateczne związanie biokatalizatora, dlatego najczęściej wykorzystuje się je w tworzeniu nośników hybrydowych, zarówno z polimerami naturalnymi, jak i syntetycznymi. Najczęściej stosowanymi nośnikami nieorganicznymi są: krzemionka, tlenki metali, ceramika, szkło porowate oraz zeolity. Wykonanie ćwiczenia (cz. 1) Immobilizacja komórek. Otrzymywanie fermentowanych napojów mlecznych. 1. Immobilizacja (unieruchomienie) mikroorganizmów. UWAGA!!! Wszystkie roztwory używane w doświadczeniu muszą być przygotowane na bazie wody destylowanej (jony wapnia w wodzie kranowej mogą wchodzić w reakcje z alginianem sodu) W zlewce o objętości 100 cm 3 przygotować 80ml 1,5% roztwór CaCl 2 w wodzie destylowanej W probówce sporządzić 2% roztwór alginianu sodu, w 5 ml wody destylowanej. Alginian sodu niezbyt dobrze rozpuszcza się w wodzie, wymaga ciepłej wody i mieszania w czasie rozpuszczania, możemy użyć szklanej bagietki Odważyć 2g drożdży piekarniczych Rozpuścić i wymieszać (vortex/bagietka) odważone drożdże w probówce zawierającej 5ml wody destylowanej. Zakryć probówkę folią aluminiową i pozostawić przez 10 minut w temperaturze pokojowej Do probówki z rozpuszczonym alginianem wlać zawiesinę drożdży i wsypać całą zawartość kapsułki zawierającej bakterie z rodzaju Lactobacillus. Całość dokładnie wymieszać (vortex/bagietka) Przy użyciu strzykawki pobrać mieszaninę drożdży, bakterii i alginianu sodu - użyć wężyka gumowego - następnie zdjąć wężyk i dodawać powoli, po kropli roztwór do zlewki z 1,5% CaCl 2. Nie wolno dopuścić aby końcówka strzykawki zetknęła się z roztworem CaCl 2. Po wkropleniu całości należy dokładnie umyć strzykawkę, wężyk i używane probówki z pozostałości alginianu!!! 1.7. Pozostawić kulki immobilizowanych komórek drożdży i bakterii do utwardzenia w roztworze CaCl 2 przez 10 minut Odcedzić powstałe kuleczki z roztworu CaCl 2 za pomocą sitka (przelewając zawartość przez sitko do drugiej zlewki) i pozostawić, aż odciekną Kuleczki przechowywać w zlewce z jałową wodą destylowaną. 2. Przygotowanie fermentowanego mleka.

8 2.1. Wlać ok. 300 ml mleka do zlewki ml, przykryć folią aluminiową i wstawić do łaźni wodnej o temperaturze ok C na 10 minut (do kontroli temperatury wody użyć termometru) Ogrzane mleko poddać procesowi homogenizacji - ok. 5 minut Po homogenizacji mleko spasteryzować zagotowując je na kuchence w trakcie gotowania mleko delikatnie mieszać!!! 2.4. Po pasteryzacji mleko schłodzić do temperatury ok C w zimnej wodzie Rozlać po ok. 150ml mleka do 2 jałowych kolby o pojemności cm 3, do pierwszej dodać 3-4 łyżeczki jogurtu naturalnego, do drugiej kuleczki immobilizowanych komórek drożdży i bakterii. Całość delikatnie zamieszać Dokonać pomiaru ph mleka. Pamiętać, aby dokładnie płukać elektrodę wodą destylowaną i delikatnie ją osuszyć bibułą przed każdym pomiarem!!! 2.7. Szczelnie zakryć kolby folią aluminiową, opisać i inkubować w temperaturze ok C przez ok. 1-2 godziny Po tym czasie wyciągnąć kolby z termostatu i przechowywać w lodówce do kolejnych zajęć. Wykonanie ćwiczenia (cz. 2) Otrzymywanie mleka pozbawionego laktozy. Ocena aktywności enzymatycznej laktazy. Immobilizacja enzymów. 1. Analiza wyników fermentacji mlekowej Dokonać pomiaru ph otrzymanych produktów i opisać zaobserwowane zmiany (konsystencja, barwa itd.). 2. Immobilizacja laktazy UWAGA!!! Wszystkie roztwory używane w doświadczeniu muszą być przygotowane na bazie wody destylowanej (jony wapnia w wodzie kranowej mogą wchodzić w reakcje z alginianem sodu) W zlewce o objętości 100 cm 3 przygotować 80ml 1,5% roztwór CaCl 2 w wodzie destylowanej W probówce sporządzić 2% roztwór alginianu sodu, w 5 ml wody destylowanej. Alginian sodu niezbyt dobrze rozpuszcza się w wodzie, wymaga ciepłej wody i mieszania w czasie rozpuszczania, możemy użyć szklanej bagietki 2.3. Wprowadzić do probówki z roztworem alginianu sodu zawartość kapsułki z enzymem laktazą (dostępna u prowadzącego). Całość dokładnie wymieszać (vortex/bagietka) Mieszaninę enzymu i alginianu pobrać do strzykawki użyć wężyka gumowego i delikatnie wkraplać do zlewki z CaCl 2. Nie wolno dopuścić aby końcówka strzykawki zetknęła się z roztworem CaCl 2. Po wkropleniu całości należy dokładnie umyć strzykawkę, wężyk i używane probówki z pozostałości alginianu!!! 2.5. Pozostawić kulki immobilizowanego enzymu do utwardzenia w roztworze CaCl 2 przez 10 minut Odcedzić powstałe kuleczki z roztworu CaCl 2 za pomocą sitka (przelewając zawartość przez sitko do drugiej zlewki) i pozostawić, aż odciekną W kolbce stożkowej o pojemności 100 cm 3 przygotować 50 ml mleka rozcieńczonego 5-krotnie wodą destylowaną. Oznaczyć stężenie glukozy w r-rze mleka za pomocą glukometru patrz pomiar glukozy Do kolbki z rozcieńczonym mlekiem wprowadzamy kuleczki enzymu laktazy. Całość umieszczamy na 15/20 minut w inkubatorze z wytrząsaniem (temp. 30 o C, 100 rpm.), a następnie dokonujemy ponownego pomiaru stężenia glukozy glukometrem. 3. Pomiar glukozy za pomocą glukometru Zakres pomiarowy glukometru wynosi od mg/dl. Jeżeli wynik pomiaru jest niższy niż 20 mg/dl na ekranie wyświetlacza pojawia się symbol LO (należy przygotować mleko o mniejszym rozcieńczeniu wodą). Jeżeli wynik pomiaru jest wyższy od 500 mg/dl na ekranie wyświetlacza pojawia się symbol HI (należy przygotować mleko o większym rozcieńczeniu wodą). Paski do glukometru należy pobrać u prowadzącego. Bardzo małą kroplę rozcieńczonego mleka wprowadzamy pipetką w miejsce odpowiednio oznaczone na pasku. Paski są jednorazowego użycia!!!! 4. Opracowanie wyników: 4.1. Przedstawić pomiary ph, opis otrzymanego produktu i na tej podstawie wyciągnąć wnioski o przebiegu i skutkach fermentacji Przedstawić pomiary poziomu glukozy w mleku i na tej podstawie wyciągnąć wnioski dotyczące aktywności laktazy. 5. Materiały do ćwiczeń, które zapewnia student! - Cz. 1: świeże drożdże (kostka), mleko 300ml, jogurt naturalny 10ml - Cz. 2: mleko ok. 100ml (nie UHT!!!) 6. Literatura: - Chmiel A., Biotechnologia. Podstawy mikrobiologiczne i biochemiczne; Wyd. PWN, Warszawa; Kunicki-Goldfinger W.; Życie bakterii; Wyd. PWN; Warszawa; Libudzisz Z. Kowal K.; Mikrobiologia techniczna; Wyd. Politechniki Łódzkiej; Bednarski W., Reps A.; Biotechnologia żywności; WNT; Warszawa; 2003.