WYTWARZANIE I ANALIZA PRODUKTÓW MLECZNYCH

Transkrypt

1 WYTWARZANIE I ANALIZA PRODUKTÓW MLECZNYCH Fermentacja różno-kulturowa, otrzymywanie kefiru. Kefir jest popularnym napojem mlecznym fermentowanym, wywodzącym się z Bałkanów. Sporządzany jest z mleka krowiego lub koziego, fermentację powodują drobnoustroje w postaci ziaren kefirowych (grzybki kefirowe) złożonych z paciorkowców mlekowych Streptococcus lactis (75%) oraz Betabacterium caucasicum (25%) żyjących w symbiozie z drożdżami z rodzaju Candida. Symbioza polega na zakwaszaniu środowiska przez bakterie, hydrolizie laktozy do m.in. glukozy, która jest wykorzystywana przez drożdże, dostarczające w zamian witaminy z grupy B. Kefir zawiera 0,8% kwasu mlekowego, 0,3-0,8% etanolu i znaczną ilość CO 2. Miano coli nie może być mniejsze niż 0,1. Immobilizacja enzymów Enzymy są biokatalizatorami, które charakteryzuje: - wysoka specyficzność działania - kierunkowość działania - zdolność do obniżania w istotny sposób energii aktywacji reakcji chemicznych. Dzięki temu znalazły szerokie zastosowanie w wielu gałęziach przemysłu spożywczego, farmaceutycznego, kosmetycznego, chemicznego i w analityce medycznej. Często jednak stosowanie enzymów w formie natywnej wiąże się z wysokimi kosztami prowadzenia procesów, szczególnie wtedy gdy konieczne jest stosowanie preparatu enzymatycznego o wysokim stopniu oczyszczenia, jak np. w farmacji, a także wówczas gdy proces prowadzony jest cyklicznie. Dlatego od 60-ych lat XX wieku coraz większym zainteresowaniem cieszą się enzymy immobilizowane. Pierwszą technologią, która wykorzystała unieruchomiony biokatalizator, była mikrobiologiczna produkcja kwasu octowego. Dziś stosuje się unieruchamianie zarówno pojedynczych enzymów, kompleksów dwóch lub większej ilości enzymów, jak i całych komórek czy struktur komórkowych. Najczęściej stosowanymi metodami unieruchamiania enzymów są: 1. Metody z wykorzystaniem oddziaływań fizycznych: - immobilizacja oparta na adsorpcji i adhezji, które wykorzystują siły jonowe, wiązania wodorowe, oddziaływania van der Waalsa i inne słabe oddziaływania fizykochemiczne do związania enzymu z nośnikiem, takim jak: drewno, celuloza, polimery syntetyczne, antracyt, tlenki metali, szkło porowate, ziemia okrzemkowa, węgiel aktywny, pumeks czy jonity (DEAE-Sephadex, CM-celuloza itp.) - pułapkowanie biokatalizatora wewnątrz struktury naturalnych lub syntetycznych polimerów; przykładowymi nośnikami są: agar, alginian, kolagen, poliakrylamid, poliuretan, polistyren, żywice sieciowane energią świetlną - immobilizacja z wykorzystaniem półprzepuszczalnych membran lub układów fazowych, gdzie membrana lub granica faz stanowi przegrodę uniemożliwiającą migrację enzymu: zamykanie w komórkach naturalnych, np. w erytrocytach kapsułkowanie i mikrokapsułkowanie (liposomy, kapsułki nylonowe, polimocznikowe, pochodne celulozowe) zamykanie pomiędzy półprzepuszczalnymi membranami lub w wężach (np. silikonowych, nylonowych) - pułapkowanie we włóknach (włókna z octanu celulozy) 2. Metody z wykorzystaniem oddziaływań chemicznych - immobilizacja poprzez tworzenie wiązań kowalencyjnych (peptydowego, estrowego, węgiel-węgiel, węgiel-azot i in.); nośniki i odczynniki wiążące to np.: hydroksyalkilometakrylan - aldehyd glutarowy, CM-celuloza karbodiimid, szkło porowate lub silikażel aldehyd glutarowy, a także: diaminy, kwasy dikarboksylowe, bromocyjan, izomocznik - unieruchamianie bez makroskopowego nośnika mechanicznego, np. sieciowanie przestrzenne, kopolimeryzacja enzymów z nośnikami rozpuszczalnymi przy użyciu odczynników dwufunkcyjnych) oraz sieciowanie kryształów i agregatów białek enzymatycznych (enzym pełni rolę matrycy i biokatalizatora) Zaletami metod fizycznych jest zachowanie struktury enzymu oraz łatwość i niski koszt przeprowadzenia procesu immobilizacji. Często jednak następuje wymywanie biokatalizatora ze złoża, zwłaszcza w przypadku stosowania prostej adsorpcji białka na powierzchni matrycy. Metody chemiczne zapewniają stabilność układu, ale w wielu przypadkach wiąże się to z częściową utratą aktywności enzymu, spowodowaną zmianą konformacji białka. Wiązanie kowalencyjne z nośnikiem jest łatwą metodą i daje stabilny układ, lecz jest kosztowne. Pułapkowanie w żelu jest tanie, ale nie można stosować go do enzymów hydrolitycznych, działających na substraty wielkocząsteczkowe, czyli mogących degradować żel. Kapsułkowanie stosuje się przede wszystkim w farmacji, jest jednak trudne w kontroli i znajduje zastosowanie jedynie do przemian niskocząsteczkowych, podobnie jak membrany półprzepuszczalne. Natomiast wzajemne sieciowanie jest łatwe i tanie, zapewnia dużą aktywność i stabilność chemiczną, jednak przy tym niską stabilność mechaniczną. Podstawowym parametrem technologicznym, który pozwala ocenić celowość stosowania wybranej metody immobilizacji, jest stabilność operacyjna enzymu. Określa ona czas pracy, po którym zachodzi utrata połowy początkowej aktywności biokatalizatora. W czasie procesu technologicznego immobilizowany biokatalizator stopniowo traci swoją produktywność, co spowodowane jest: - wymywaniem enzymu ze złoża oraz rozpuszczaniem się lub ścieraniem matrycy - utratą aktywności na skutek zatruwania lub denaturacji enzymu

2 - pogorszeniem się warunków kontaktu substratu z enzymem w wyniku zanieczyszczenia i zatkania się porów złoża lub mechanicznego zgniatania matrycy - zanieczyszczeniem mikrobiologicznym Wady stosowania immobilizacji enzymów są następujące: - wysoki koszt, związany głównie z otrzymaniem czystego preparatu enzymatycznego - utrata aktywności wywołana zmianą warunków fizykochemicznych środowiska, w porównaniu do warunków, jakie panowały wewnątrz komórki przed izolacją - utrata aktywności podczas prowadzenia procesu immobilizacji (w tym ilościowe straty enzymu) Większość wyżej wymienionych wad można usunąć przez dobór prawidłowej metody immobilizacji dla potrzeb konkretnego procesu technologicznego. Zalety unieruchamiania enzymów: - immobilizacja może stabilizować strukturę białek, dzięki czemu zwiększona jest ich termostabilność i odporność na działanie czynników denaturujących - możliwość stosowania enzymów w środowisku organicznym - łatwe oddzielenie od mieszaniny reakcyjnej po zakończeniu procesu, dzięki czemu otrzynujemy produkt o wysokiej czystości - możliwość wielokrotnego wykorzystywania biokatalizatora - ograniczenie inhibicji enzymu, zarówno przez substrat jak i przez produkt, podnosi wydajność procesu biokatalizy - możliwość pracy w systemach ciągłych (np. z wykorzystaniem reaktora przepływowego) Wykonanie ćwiczenia (cz. 1) I. Immobilizacja (unieruchomienie) enzymu i komórek drożdży. 1. W zlewce o objętości 100 cm 3 przygotować 80ml 1,5% roztwór CaCl 2 w wodzie destylowanej. 2. W probówce sporządzić 2% roztwór alginianu sodu, w 5 ml wody destylowanej. Alginian sodu niezbyt dobrze rozpuszcza się w wodzie, wymaga ciepłej wody, wytrząsania i cierpliwości w czasie rozpuszczania (roztwór alginianu ogrzewamy umieszczając w ciepłej wodzie ogrzanej w małej zlewce na kuchence elektrycznej, lub w łaźni wodnej w temperaturze ok C). 3. Odważyć/odmierzyć 2g/ml drożdży piekarniczych/winiarskich. 4. Rozpuścić i wymieszać (vortex) odważone drożdże w probówce zawierającej 5ml wody destylowanej. Zakryć probówkę folią aluminiową i pozostawić do wyrośnięcia przez 10 minut w temperaturze pokojowej. 5. Do probówki z rozpuszczonym alginianem wlać zawiesinę drożdży i wsypać całą zawartość kapsułki zawierającej bakterie z rodzaju Lactobacillus. Całość dokładnie wymieszać (wytrząsanie, vortex). 6. Nabrać ok. 10ml mieszaniny drożdży, bakterii i alginianu sodu do strzykawki - użyć wężyka gumowego, następnie zdjąć wężyk i dodawać powoli, po kropli roztwór do zlewki z 1,5% CaCl 2. Nie wolno dopuścić aby końcówka strzykawki zetknęła się z roztworem CaCl 2. Po wkropleniu całości należy dokładnie umyć strzykawkę, wężyk i używane probówki z pozostałości alginianu!!! 7. Pozostawić kulki immobilizowanych komórek drożdży i bakterii do utwardzenia w roztworze CaCl 2 przez 10 minut. 8. Odcedzić powstałe kuleczki z roztworu CaCl 2 za pomocą sitka (przelewając zawartość przez sitko do drugiej zlewki) i pozostawić, aż odciekną. 9. Kuleczki przechowywać w zlewce z jałową wodą destylowaną. II. Przygotowanie fermentowanego mleka. 1. Wlać ok. 300 ml mleka do zlewki ml, przykryć folią aluminiową i wstawić do łaźni wodnej o temperaturze ok C na 10 minut (do kontroli temperatury wody użyć termometru). 2. Ogrzane mleko poddać procesowi homogenizacji - ok. 5 minut. 3. Po homogenizacji mleko spasteryzować zagotowując je na kuchence w trakcie gotowania mleko należy od czasu do czasu zamieszać!!! 4. Po pasteryzacji mleko schłodzić do temperatury ok C w zimnej wodzie. 5. Rozlać po ok. 150ml mleka do 2 jałowych kolby o pojemności cm 3, do pierwszej dodać 3-4 łyżeczki jogurtu naturalnego, do drugiej kuleczki immobilizowanych komórek drożdży i bakterii (po uprzednim odcedzeniu, kuleczki pobrać łyżeczką plastikową). Całość delikatnie zamieszać. 6. Dokonać pomiaru ph mleka. Należy pamiętać, aby dokładnie płukać elektrodę wodą destylowaną i delikatnie ją osuszyć bibułą przed każdym pomiarem. 7. Szczelnie zakryć kolby folią aluminiową, opisać i inkubować w temperaturze ok C przez ok. 1-2 godziny. 8. Po tym czasie wyciągnąć kolby z termostatu i przechowywać w chłodnym miejscu do kolejnych zajęć. Otrzymywanie mleka pozbawionego laktozy. Ocena aktywności enzymatycznej laktazy. Immobilizacja enzymów.

3 Enzym laktaza katalizuje hydrolizę laktozy do glukozy i galaktozy. Oba produkty są słodsze od laktozy i dużo chętniej konsumowane niż ten cukier. Pomimo tradycyjnych upodobań konsumentów co do spożywania produktów mlecznych pochodzących od krów, znaczna część populacji (szacuje się, że nawet ok. 75%) nie jest w stanie przyswoić zbyt dużej ilości laktozy. Mleko krowie może zostać poddane trawieniu poprzez dodanie enzymów hydrolizujących laktozę, co pozwala otrzymać produkt dla ludzi nie tolerujących tego dwucukru. Wykonanie ćwiczenia (cz. 2) I. Analiza wyników fermentacji mlekowej Dokonać pomiaru ph otrzymanych produktów i opisać zaobserwowane zmiany (konsystencja, barwa itd.). II. Immobilizacja laktazy UWAGA!!! Wszystkie roztwory używane w doświadczeniu muszą być przygotowane na bazie wody destylowanej (jony wapnia w wodzie kranowej mogą wchodzić w reakcje z alginianem sodu). 1. W zlewce o objętości 100 cm 3 przygotować 80ml 1,5% roztwór CaCl 2 w wodzie destylowanej. 2. W probówce sporządzić 2% roztwór alginianu sodu, w 5 ml wody destylowanej. Alginian sodu niezbyt dobrze rozpuszcza się w wodzie, wymaga ciepłej wody, wytrząsania i cierpliwości w czasie rozpuszczania (roztwór alginianu ogrzewamy umieszczając w ciepłej wodzie ogrzanej w małej zlewce na kuchence elektrycznej, lub w łaźni wodnej w temperaturze ok C). 3. Za pomocą glukometru oznaczyć w mleku (nie UHT), które będzie używane w doświadczeniu poziom glukozy patrz pomiar glukozy 4. Wprowadzić do probówki z roztworem alginianu sodu zawartość kapsułki z enzymem laktazą. Całość dokładnie wymieszać (vortex). 5. Mieszaninę enzymu i alginianu pobrać do strzykawki użyć wężyka gumowego i delikatnie wkraplać do zlewki z CaCl 2. Nie wolno dopuścić aby końcówka strzykawki zetknęła się z roztworem CaCl 2. Po wkropleniu całości należy dokładnie umyć strzykawkę, wężyk i używane probówki z pozostałości alginianu!!! 6. Pozostawić kulki immobilizowanego enzymu do utwardzenia w roztworze CaCl 2 przez 10 minut. 7. Odcedzić powstałe kuleczki z roztworu CaCl 2 za pomocą sitka (przelewając zawartość przez sitko do drugiej zlewki) i pozostawić, aż odciekną. 8. Jako kolumny wypełnionej immobilizowaną laktazą użyć cylindra strzykawki (10ml). W tym celu należy wyjąć tłoczek ze strzykawki, umieścić w środku kawałeczek waty i ubić go delikatnie tłoczkiem tak aby grubość warstwy nie przekraczała 1 cm. Wata lub gaza zapobiegną blokowaniu wylotu cylindra strzykawki przez kuleczki enzymu. 9. Do strzykawki wprowadzić kuleczki unieruchomionego w alginianie enzymu (użyć plastikowej łyżeczki). 10. Przez tak przygotowaną kolumnę przelać powoli ok. 50ml mleka. Otrzymaną frakcję zebrać do czystej zlewki o pojemności ml i po kilku minutach oznaczyć w niej poziom glukozy za pomocą glukometru patrz pomiar glukozy. III. Pomiar glukozy za pomocą glukometru

4 Zamiast próbki krwi nanosimy kroplę mleka rozcieńczonego 5-krotnie w wodzie destylowanej. Rozcieńczone mleko nanosimy na brzeg paska za pomocą pipety automatycznej Jeżeli próbka mleka jest zbyt mała można nanieść dodatkową ilość w ciągu 60 sekund od czasu naniesienia pierwszej kropli Wynik pomiaru stężenia podawany jest w mg/dl Zakres pomiaru gleukometru wynosi od mg/dl. Jeżeli wynik pomiaru jest niższy niż 20 mg/dl na ekranie wyświetlacza pojawia się symbol LO. (należy zmniejszyć rozcieńczenie próby) Jeżeli wynik pomiaru jest wyższy od 500 mg/dl na ekranie wyświetlacza pojawia się symbol HI (należy zwiększyć rozcieńczenie próby) IV. Opracowanie wyników: - pomiary ph, opis otrzymanego produktu i na tej podstawie wyciągnięte wnioski o przebiegu i skutkach fermentacji, - pomiary poziomu glukozy w mleku i na tej podstawie wyciągnięte wnioski dotyczące aktywności laktazy. V. Materiały do ćwiczeń, które zapewnia student! Cz. 1: - świeże drożdże (kostka) - mleko 300ml - jogurt naturalny 10ml Cz. 2:

5 - mleko ok. 100ml (nie UHT!!!) VI. Zagadnienia teoretyczne: - rodzaje fermentacji mlekowej - przemysłowe wykorzystanie bakterii fermentacji mlekowej - immobilizacja enzymów VII. Literatura: - Chmiel A., Biotechnologia. Podstawy mikrobiologiczne i biochemiczne; Wyd. PWN, Warszawa; Kunicki-Goldfinger W.; Życie bakterii; Wyd. PWN; Warszawa; Libudzisz Z. Kowal K.; Mikrobiologia techniczna; Wyd. Politechniki Łódzkiej; Bednarski W., Reps A.; Biotechnologia żywności; WNT; Warszawa; 2003.