The use of real-time RT-PCR method for the determination of Toll-like genes expression at mrna level

Transkrypt

1 MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2014, 66: Zastosowanie metody real-time RT-PCR do oznaczania ekspresji genów receptorów Toll-like na poziomie mrna The use of real-time RT-PCR method for the determination of Toll-like genes expression at mrna level Agnieszka Częścik, Agnieszka Trzcińska, Milena Dunal-Szczepaniak, Joanna Siennicka Zakład Wirusologii, Narodowy Instytut Zdrowia Publicznego Państwowy Zakład Higieny, ul. Chocimska 24, Warszawa W pracy przedstawiono metodykę doświadczenia mającego na celu optymalizację warunków stymulacji komórek PBMC i walidację metody real-time RT-PCR stosowanej do oznaczania ekspresji na poziomie mrna receptorów Toll-like w tych komórkach. Słowa kluczowe: receptory Toll-like, ekspresja, walidacja, real-time RT-PCR ABSTRACT Introduction: Toll-like receptors (TLRs) are an important component of a innate immune system. Stimulation of TLRs, through action with helper T cells, could change Th1/Th2 balance and thus affect adaptive immune response. The aim of this work was to optimize the stimulation of the peripheral blood mononuclear cells (PBMC) and the validation of real-time RT-PCR method for determination of Toll-like gene expression in these cells. Methods: PBMCs from healthy donors were stimulated with measles viruses and ligands for TLR2 and TLR4. For examinations the real time RT-PCR (QuantiFast Assay, Qiagen) was used. Fold change of TLRs expression was normalized to GAPDH and estimated by 2 - Ct method. Validation of real-time RT-PCR method was performed for repeatability and efficiency. Results: The level of gene expression varies between individuals and was dose and time of incubation dependent. The efficiency of real-time RT-PCR was 90.4% ± 10.2 for GAPDH, 87.0% ± 8.2 for TLR2 and 44.5% ± 9.2 for TLR4. Repeatability, expressed as relative standard deviation (RSD) for Ct values was less than 0.70% for GAPDH, <3.2% for TLR2 and <2.84% for TLR4. Conclusions: Based on obtained results, the optimal conditions for stimulation were: 10 μg/ml/24h for LPS, 1μg/ml/6h for Pam3CSK4 and 1250 MeV infectious particles/24h. Key words: Toll-like receptors, expression, validation, real-time RT-PCR

2 18 A. Częścik i inni Nr 1 WSTĘP Receptory Toll-like (TLR) są ważnym elementem reakcji odpornościowej. Stanowią pomost pomiędzy odpowiedzią wrodzoną (innate response) a nabytą (adoptive response). Przy udziale TLRs rozpoznawane są pewne struktury charakterystyczne dla patogenów (PAMP pathogen associated molecular patterns). W odróżnieniu od odpowiedzi nabytej, związanie receptora nie pociąga za sobą uruchomienia procesów pamięci immunologicznej (4, 5). Pobudzenie receptorów TLR skutkuje między innymi indukcją syntezy cytokin i na tej drodze wpływa na modyfikację odpowiedzi nabytej. Dzieje się tak poprzez oddziaływanie na limfocyty pomocnicze i ukierunkowywanie ich bądź w stronę Th1 (przewagi cytotoksyczności), bądź Th2 (przewagi odpowiedzi humoralnej) (6, 7). Skuteczność reakcji odpornościowej indukowanej szczepieniem warunkowana jest zarówno czynnikami związanymi z konstrukcją szczepionki (w tym jej składem antygenowym) jak i czynnikami leżącymi po stronie organizmu. Pierwszymi elementami odpowiedzi immunologicznej aktywowanymi w wyniku kontaktu z wirusem odry (MeV) są te związane z odpowiedzią nieswoistą: interferonami (IFN), układem dopełniacza, komórkami NK oraz pobudzeniem receptorów Toll-like (TLR). Dostępne dane wskazują, że spośród wszystkich znanych receptorów TLR, na kształtowanie reakcji odpornościowej indukowanej przez MeV największe znaczenie ma aktywacja TLR2 oraz TLR4 (1, 2, 3). Celem pracy była optymalizacja warunków stymulacji komórek PBMC i walidacja metody real-time RT-PCR stosowanej do oznaczania ekspresji genów receptorów Toll-like w tych komórkach. MATERIAŁ I METODY K o m ó r k i P B M C. Od zdrowych ochotników pobierano 10 ml krwi obwodowej, z której izolowano PBMC (Peripheral Blood Mononuclear Cells) przy użyciu LSM (Lymphocyte Separation Medium, MP Biomedicals). Zebrane komórki płukano w PBS, zawieszano w RPMI 1640 (Sigma, R8758) z dodatkiem 10% płodowej surowicy cielęcej (FBS) i liczono w komorze Bűrkera. Do stymulacji używano zawiesiny 10 6 PBMC w 4 ml RPMI + 10% FBS. S t y m u l a t o r y. Szczepy wirusa odry szczep szczepionkowy (E) Edmonston (ATCC, VR-24) i szczep dziki (W), wyizolowany w 2007r. w Polsce w Krajowym Ośrodku Referencyjnym WHO d/s. eliminacji odry/różyczki NIZP-PZH (izolat 2521/07). Ligandy receptorów Toll like - Pam3CSK (InvivoGen tlrl-pms), syntetyczna trójacetylowana lipoproteina, agonista receptora TLR2 i LPS (InvivoGen tlrl-eblps), lipopolisacharyd uzyskany z E.coli szczepu 0111:B4, agonista receptora TLR4. O p t y m a l i z a c j a w a r u n k ó w s t y m u l a c j i. Komórki PBMC stymulowano zawiesiną zawierającą 2500, 1250 i 625 cząstek zakaźnych wirusa odry szczepu szczepionkowego Edmonston (E) i dzikiego (W) oraz ligandami dla TLR2 i TLR4 w dawkach 0,1, 1,0 i 10 µg/ml w dwóch czasach inkubacji: 6h oraz 24h. Jako kontrolę negatywną stosowano komórki niestymulowane (NS). Doświadczenie przeprowadzono w dwukrotnym powtórzeniu.

3 Nr 1 Real-time RT-PCR do oznaczania receptorów Toll-like 19 O z n a c z a n i e e k s p r e s j i g e n ó w. Z PBMC (stymulowanych i kontrolnych) izolowano mrna (Qiagen, Oligotex Direct mrna Mini Kit) i określano poziom ekspresji genów TLR2 i TLR4 wobec genu referencyjnego (GAPDH) metodą real-time RT-PCR z sondą TaqMan. Badania wykonano przy użyciu zestawów QuantiFast Assay (Qiagen) w cyklerze Rotor-Gene TM 6000 (Corbett Life Science). Wpływ stymulacji na poziom ekspresji oceniano metodą 2 - Ct. M e t o d a r e a l t i m e R T P C R. Badania przeprowadzono metodą real-time one-step RT-PCR z jednoczesną detekcją poszukiwanego genu (TLR2 lub TLR4) oraz genu referencyjnego (GAPDH) z wykorzystaniem zastawów: QuantiFast Probe Assays oraz QuantiFast Probe RT-PCR Plus Kit (Qiagen, ). Zestaw QuantiFast Probe Assays zawierał indywidualnie projektowane startery oraz sondę TaqMan dla genów TLR2 (Hs_TLR2_FAM_1, QF ), TLR4 (Hs_TLR4_ FAM_1; QF ) lub genu referencyjnego, dehydrogenazy gliceraldehydo-3-fosforanu; GAPDH (Hs_GAPDH_MAX_2, QF ). Sondy TaqMan posiadały przyłączony na końcu 3 wygaszacz, a na końcu 5 fluorofor. Jako wygaszacz zastosowano IBFQ o szerokim spektrum absorbancji ( nm). Jako fluorofor dla genów TLR2 i TLR4 zastosowano FAM (wzbudzenie 494 nm, emisja 518 nm) a dla genu referencyjnego zastosowano MAX (wzbudzenie 524 nm, emisja 557 nm). Zestaw QuantiFast Probe RT-PCR Plus Kit zawierał zestaw buforów oraz enzymów (odwrotna transkryptaza Omniscript i Sensiscript, HotStarTaq Plus DNA polimeraza) niezbędnych do przeprowadzenia reakcji odwrotnej transkrypcji (mrna cdna) oraz amplifikacji (one-step RT-PCR) jednocześnie dla genu TLR2 lub TLR4 oraz genu referencyjnego GAPDH (format duplex detection) w czasie rzeczywistym (real-time). Zastosowany zestaw zawierał bufor umożliwiający efektywne usunięcie zanieczyszczeń genomowym DNA, które mogłoby generować fałszywie dodatnie odczyty. W a l i d a c j a m e t o d y r e a l t i m e R T P C R. Wydajność reakcji real-time RT-PCR określano na podstawie wyników - sześciu dla GAPDH, trzech dla TLR2 i trzech dla TLR4 niezależnych doświadczeń, przeprowadzając reakcje w szeregu dwukrotnych rozcieńczeń próbek mrna. Powtarzalność wyników reakcji real-time RT-PCR określano na podstawie danych uzyskanych w sześciu niezależnych doświadczeniach, w których badano próbki uzyskane od dwóch osób. WYNIKI I ICH OMÓWIENIE Obserwowano osobniczo różny i zależny od dawki stymulatora poziom ekspresji badanych genów w komórkach PBMC. Po stymulacji szczepem szczepionkowym wirusa odry średni poziom zmiany ekspresji TLR2 i TLR4 normalizowany w stosunku do ekspresji GAPDH wyniósł od 0,79 (E2500) do 5,84 (E625) natomiast po stymulacji szczepem dzikim od 0,54 (W625) do 2,77 (W2500) (rycina 1). Dodanie do zawiesiny komórek PBMC ligandu dla receptora TLR2 skutkowało zmianami ekspresji tego genu, zależnymi w większym stopniu od czasu inkubacji niż dawki (rycina 2). Zakres zmian ekspresji TLR2 w zależności od dawki Pam3CSK4 i czasu inkubacji wyniósł od 0,37 do 1,33. Efektem traktowania PBMC ligandem dla receptora TLR4 była zmiana ekspresji tego genu, zależna od czasu inkubacji i dawki (rycina 2). Podczas gdy inkubowanie komórek w obecności LPS w dawkach o wyż-

4 20 A. Częścik i inni Nr TLR2-A TLR4-A TLR2-B TLR4-B Względna ekspresja genu E2500 E1250 E625 W2500 W1250 W625 Ryc.1. Względna ekspresja genów TLR2 i TLR4 w komórkach PBMC stymulowanych zawiesiną zawierającą Ryc.1. Względna 2500, ekspresja 1250 genów i 625 TLR2 cząstek i TLR4 zakaźnych w komórkach wirusa PBMC odry stymulowanych szczepu szczepionkowego zawiesiną zawierającą 2500, 1250 i 625 cząstek zakaźnych wirusa odry szczepu szczepionkowego Edmonston (E) i dzikiego Edmonston (W). Poziom (E) i dzikiego zmiany był (W). normalizowany Poziom zmiany w stosunku był normalizowany do ekspresji GAPDH. w stosunku Na wykresie do przedstawiono ekspresji GAPDH. średnie Na oraz wykresie odchylenia przedstawiono standardowe (zaznaczono średnie oraz górny odchylenia zakres) dla standardowe wyników z dwóch (zaznaczono niezależnych górny zakres) doświadczeń dla przeprowadzonych wyników z dwóch na materiale niezależnych uzyskanym od doświadczeń dwóch osób przeprowadzonych na materiale uzyskanym od dwóch osób 5 Względna ekspresja genu Ryc.2. Względna ekspresja genów TLR2 i TLR4 w komórkach PBMC stymulowanych Pam3CSK4 i LPS w dawkach 0,1, 1,0 i 10 µg/ml przez 6h i 24h. Poziom zmiany był normalizowany w stosunku do ekspresji GAPDH. Na wykresie przedstawiono średnie oraz odchylenia Ryc.2. Względna ekspresja genów TLR2 i TLR4 w komórkach PBMC stymulowanych Pam3CSK4 i LPS w standardowe (zaznaczono górny zakres) dla wyników z dwóch niezależnych doświadczeń dawkach 0,1, 1,0 i 10 µg/ml przez 6h i 24h. Poziom zmiany był normalizowany w stosunku do ekspresji GAPDH. Na wykresie przedstawiono średnie oraz odchylenia standardowe (zaznaczono górny zakres) szym stężeniu (1,0 dla wyników µg/ml i z 10,0 dwóch µg/ml) niezależnych przez doświadczeń 6h przy skutkowało w wzrostem aktywności genu TLR4 (4,55 i 1,04 odpowiednio), to dłuższy czas inkubacji powodował zahamowanie aktywności genu TLR4 (od 0,05 do 0,16). Walidację w zakresie wydajności reakcji real-time RT-PCR przeprowadzono w oparciu o dane generowane przez Rotor-Gene 6000Series software v (rycina 3) i określono

5 Nr 1 Real-time RT-PCR do oznaczania receptorów Toll-like 21 Normalizowana wartość fluorescencji Numer cyklu Ryc.3. Przykładowy obraz real-time RT-PCR dla badania wydajności reakcji. Na podstawie oznaczeń sześciu podwójnych rozcieńczeń próbki wydajność reakcji dla GAPDH (yellow Ryc.3. Przykładowy fluorescence) obraz real-time w tym doświadczeniu RT-PCR dla badania określono wydajności na 91% reakcji. (r2=98,2) Na podstawie oznaczeń sześciu podwójnych rozcieńczeń próbki wydajność reakcji dla GAPDH (yellow fluorescence) w tym doświadczeniu określono 120 na 91% (r 2 =98,2) Wydajność reakcji real-time RT-PCR [%] GAPDH TLR2 TLR4 Ryc.4. Wydajność reakcji real-time RT-PCR dla TLR2, TLR4 i GAPDH. Na wykresie przedstawio- Ryc.4. Wydajność średnie reakcji oraz real-time odchylenia RT-PCR standardowe dla TLR2, TLR4 (zaznaczono i GAPDH. dolny Na wykresie i górny przedstawiono zakres) dla wyników średnie oraz odchylenia z trzech (TLR2 standardowe i TLR4) (zaznaczono i sześciu dolny (GAPDH) i górny niezależnych zakres) dla wyników doświadczeń z trzech (TLR2 i TLR4) i sześciu (GAPDH) niezależnych doświadczeń ją na 90,4% ± 10,2 dla GAPDH, 87,0% ± 8,2 dla TLR2 oraz 44,5% ± 9,2 dla TLR4 (rycina 4). Powtarzalność wyrażona jako względne odchylenie standardowe (RSD) dla wartości Ct w przeprowadzonych eksperymentach przeprowadzonych na materiałach pochodzących od dwóch osób była mniejsza niż 0,70% dla GAPDH, <3,2% dla TLR2 oraz <2,84% dla TLR4.

6 22 A. Częścik i inni Nr Wartość Ct Ryc.3. Wydajność reakcji real-time RT-PCR dla TLR2, TLR$ i GAPDH. Na wykresie przedstawiono średnie oraz odchylenia 26 standardowe (zaznaczono dolny i górny zakres) dla wyników z trzech (TLR2 i TLR4) i sześciu (GAPDH) niezależnych doświadczeń 24 GAPDH-Os2 TLR2-Os2 TLR4-Os2 GAPDH/1 TLR2/1 TLR4/1 GAPDH/2 TLR2/2 TLR4/2 Ryc.5. Powtarzalność reakcji real-time RT-PCR dla TLR2, TLR4 i GAPDH oznaczanych w próbkach mrna uzyskanych od dwóch osób (1 i 2). Wykresy box-and-whisker reprezentują wyniki sześciu niezależnych doświadczeń Ryc.5. Powtarzalność reakcji real-time RT-PCR dla TLR2, TLR4 i GAPDH oznaczanych w próbkach mrna uzyskanych od dwóch osób (1 i 2). Wykresy PODSUMOWANIE box-and-whisker reprezentują wyniki sześciu niezależnych doświadczeń Uzyskane wyniki oznaczeń walidacyjnych, w których za akceptowalną wartość dla powtarzalności przyjęto rozrzut wyników poniżej 15% a za akceptowalną wartość wydajności - wynik powyżej 85%, wskazują na przydatność opisanej metody do oznaczania ekspresji na poziomie mrna receptorów Toll-like. Kierując się uzyskanymi wynikami, za optymalne warunki stymulacji przyjęto: LPS 10 µg/ml/24h, Pam3CSK4 1µg/ml/6h, MeV 1250 cząstek zakaźnych wirusa /24h. PIŚMIENNICTWO 1. Bieback K, Lien E, Klagge IM i inni. Hemagglutinin protein of wild-type measles virus activates toll-like receptor 2 signaling. J Virol 2002; 76: Częścik A, Trzcińska A, Siennicka J. Wirus odry reakcje odpornościowe związane z naturalnym zakażeniem i odpowiedzią poszczepienną. Post Mikrobiol 2011; 50: Hahm B, Cho JH, Oldstone MB. Measles virus-dendritic cell interaction via SLAM inhibits innate immunity: selective signaling through TLR4 but not other TLRs mediates suppression of IL-12 synthesis. Virology 2007; 358: Janeway CA Jr, Medzhitov R. Innate immune recognition. Annu Rev Immunol 2002; 20: Tokarz-Deptuła B, Niedźwiedzka P, Deptuła W. Receptory Toll-podobne nowe znaczniki w immunologii. Alergia Astma Immunologia 2006; 11: van Els CA, Nanan R. T cell responses in acute measles. Viral Immunol 2002; 15: Xu D, Liu H, Komai-Koma M. Direct and indirect role of Toll-like receptors in T cell mediated immunity. Cell Mol Immunol 2004; 1: Otrzymano: 28 II 2014 r. Adres Autora: Warszawa, ul. Chocimska 24, Zakład Wirusologii Narodowego Instytutu Zdrowia Publicznego - PZH jsiennicka@pzh.gov.pl