Wydział Medycyny Weterynaryjnej Uniwersytetu Przyrodniczego we Wrocławiu. lek. wet. Katarzyna Gajos

Transkrypt

1 Wydział Medycyny Weterynaryjnej Uniwersytetu Przyrodniczego we Wrocławiu lek. wet. Katarzyna Gajos EKSPRESJA SYNTAZ PROSTAGLANDYNOWYCH I RECEPTORÓW TOLL-PODOBNYCH ORAZ SYNTEZA WYBRANYCH METABOLITÓW KWASU ARACHIDONOWEGO I CZYNNIKA MARTWICY NOWOTWORU α W PODKLINICZNYM ZAPALENIU BŁONY ŚLUZOWEJ MACICY KLACZY Praca doktorska wykonana w Zakładzie Immunologii i Patologii Rozrodu Instytutu Rozrodu Zwierząt i Badań Żywności Polskiej Akademii Nauk w Olsztynie pod kierunkiem dr hab. Marty Siemieniuch - Instytut Rozrodu Zwierząt i Badań Żywności PAN w Olsztynie dr hab. Rolanda Kozdrowskiego, prof. nadzw. - Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu Praca wykonywana w ramach grantu finansowanego przez NCN pt.:,,ocena endometrium klaczy wykazujących subkliniczne endometritis w oparciu o badanie mikrobiologiczne, cytologiczne, histologiczne i molekularne Nr 2011/01/B/NZ5/04173 Wrocław 2014

2 VII. STRESZCZENIE Ekspresja syntaz prostaglandynowych i receptorów Toll-podobnych oraz synteza wybranych metabolitów kwasu arachidonowego i czynnika martwicy nowotworu α w podklinicznym zapaleniu błony śluzowej macicy klaczy Jedną z przyczyn niepłodności u klaczy i poważnych strat w rozrodzie koni jest podkliniczne zapalenie błony śluzowej macicy (subclinical endometritis SE). Zapalenia te mają charakter ukryty, a zespół objawów im towarzyszących jest niejednoznaczny i trudny w interpretacji i może różnić się indywidualnie w zależności od danego przypadku. Kontakt z czynnikami zapalnymi, w tym PAMPs (Pathogen Associated Molecular Patterns), aktywuje w błonie śluzowej macicy wrodzone mechanizmy odpowiedzi immunologicznej i poprzez nagromadzenie mediatorów zapalenia (interleukin, metabolitów kwasu arachidonowego) i komórek zapalnych, narusza równowagę funkcjonalną błony śluzowej macicy. Nadrzędnym celem badawczym pracy było określenie zmian towarzyszących podklinicznemu zapaleniu błony śluzowej macicy klaczy na poziomie komórkowym i molekularnym poprzez zbadanie profilu wydzielniczego prostaglandyn F 2 α i E 2, prostacykliny, leukotrienów B 4 i C 4, czynnika martwicy nowotworu α oraz ekspresji syntaz prostaglandynowych i receptorów toll-podobnych 2 i 4 w endometrium klaczy oraz zweryfikowanie istnienia zależności badanych czynników od stopnia nasilenia stanu zapalnego, wieku badanych klaczy, a także faz cyklu rujowego i procesów włóknienia. Zarówno ekspresja syntaz prostaglandynowych (PTGS-2, PGES, PGFS) jak i receptorów Toll-podobnych 2 i 4 oraz stężenie PGE 2 PGF 2α PGI 2 LTB 4 LTC 4 i TNFα ulegały zmianie w przebiegu podklinicznego endometritis w porównaniu do klaczy wolnych od stanu zapalnego. W przypadku syntaz prostaglandynowych, TLR2 i 4 oraz PGE 2 PGF 2α PGI 2 i TNFα notowano wzrost ww. czynników natomiast w przypadku LTB 4 LTC 4 spadek. W przypadku PGFS, PGF 2α, PGI 2 oraz LTB 4 zmiany te były niezależne od stopnia zapalenia, natomiast w przypadku pozostałych czynników stopnień zapalenia wpływał na ekspresję genów bądź stężeń badanych maetabolitów: w przypadku TNFα obserwowano zmiany zarówno w zapaleniu podklinicznym I jak i II stopnia a w przypadku PTGS-2, PGES, TLR2, TLR4, PGE 2 i LTC 4 wyłącznie w zapaleniu II stopnia. Brak wpływu faz cyklu rujowego na zmiany ekspresji bądź stężeń u klaczy wolnych od stanu zapalnego wykazano w przypadku TLR4, PTGS-2, PGES, PGI 2 oraz LTC 4 natomiast TLR2, TNFα, PGFS, PGE 2, PGF 2α oraz LTB 4 zależały od faz cyklu rujowego. 170

3 W przebiegu podklinicznego endometritis wszystkie ww. czynniki z wyjątkiem LTC 4 ulegały zmianom w poszczególnych fazach cyklu rujowego w porównaniu z klaczami wolnymi od stanu zapalnego. U klaczy wolnych od stanu zapalnego zależność od wieku obserwowano wyłącznie w przypadku stężenia LTB 4 i LTC 4, gdzie wykazano obniżenie leukotrienów wraz z wiekiem klaczy. Natomiast w przebiegu podklinicznego endometritis dochodziło do zmian ekspresji bądź stężenia wszystkich badanych czynników, w szczególności w grupie klaczy najstarszych (16-23 lata) i najmłodszych (2-5 lat). W przebiegu podklinicznego zapalenia błony śluzowej macicy u klaczy proces włóknienia nie zmieniał profilu ekspresji TLR2, TLR4, PTGS-2 ani profilu stężenia PGE 2, PGF 2α i PGI 2 natomiast włóknienie miało wpływ na profil ekspresji bądź stężenia w przypadku TNFα, PGES, PGFS oraz LTC 4 i LTB 4. U klaczy bardzo czułym wskaźnikiem toczącego się w endometrium podklinicznego stanu zapalnego wydaje się być prostacyklina, ze względu na niezależność PGI 2 od stopnia nasilenia zapalenia oraz niezależność od występowania w endometrium klaczy procesów włóknienia, tym bardziej, że u klaczy wolnych od zapalenia stężenie PGI 2 jest dodatkowo niezależne od wieku i fazy cyklu rujowego. Uzyskane wyniki wskazują, iż w przebiegu podklinicznego zapalenia błony śluzowej macicy klaczy dochodzi do zaburzeń mechanizmów odpowiedzi odpornościowej wrodzonej związanej ze zmianami w ekspresji TLR2 i 4 oraz stężeniem TNFα, a także zaburzeń funkcji wydzielniczych endometrium związanych ze zmianami w ekspresji syntaz prostaglandynowych i sekrecją metabolitów kwasu arachidonowego, w szczególności PGE 2, PGF 2α, PGI 2 oraz LTB 4 i LTC 4. Zaburzenia te prowadzą do naruszenia optymalnych warunków mikrośrodowiska macicy podczas cyklu jajnikowego jeszcze przed pojawieniem się zarodka w macicy i w czasie kiedy dochodzi do matczynego rozpoznania ciąży a to potencjalnie może upośledzać zdolność rozwoju zarodka i być przyczyną niepłodności u klaczy. W przebiegu podklinicznego endometritis dochodzi do szczególnej supresji w uruchomieniu i rozwinięciu pełnego mechanizmu opowiedzi zapalnej. Uzyskane wyniki mogą tłumaczyć także obserwowane w praktyce zjawiska towarzyszące podklinicznemu endometritis takie jak: skrócenie lub wydłużenie cyklu jajnikowego czy nietypowy dla danej fazy cyklu obraz w badaniu ultrasonograficznym. Ponadto, wskazują na możliwość opracowania nowych strategii terapeutycznych SE polegających na indukowaniu pełnej odpowiedzi odpornościowej lub stosowania leków o innym punkcie uchwytu. 171

4 VIII. SUMMARY The expression of prostaglandin synthases and Toll-like receptors and synthesis of selected arachidonic acid metabolites and Tumor Necrosis Factor α in the course of subclinical endometritis in the mare. Subclinical endometritis (SE) is one of the main causes of infertility in the mare and serious reducing of the reproductive efficiency. SE can be difficult to diagnose because clinical signs are absent or very subtle, sometimes present only during certain phase of the oestrus cycle and may differ in each mare. Results of routine examinations often are misinterpreted or false. Subclinical endometritis is influenced by the pathogen and mare s subsequent immunological response. Contact with infammatory factors like PAMPs change concentration of inflammatory mediators (cytokines, AA metabolites) and intrude endometrial functional balance. The main aim of the study was to determine molecular changes in the equine endometrium by evaluating of mrna transcription for prostaglandin synthases (PTGS-2, PGES, PGFS) and for Toll-like receptors type 2 and 4. In addition, spontaneous secretion of prostaglandin E 2 (PGE 2 ), F 2α (PGF 2α ), prostacyclin (PGI 2 ), leukotrien B 4 (LTB 4 ) and C 4 (LTC 4 ) as well as tumor necrosis factor (TNFα) were determined. Moreover, expression and synthesis of those factors was examined dependently on the grade of inflammation, estrous cycle, age and fibrosis. Expression of prostaglandin synthases (PTGS-2, PGES, PGFS) and Toll-like receptors type 2 and 4 as well as secretion of PGE 2, PGF 2α, PGI 2, LTB 4, LTC 4 and TNFα in the course of subclinical endometritis in the mare was disturbed compared with healthy mares. Expression of prostaglandin synthases, TLR2, TLR4 and secretion of PGE 2, PGF 2α, PGI 2 and TNFα was upregulated when LTB 4 and LTC 4 was downregulated. The PGFS expression and PGF 2α, PGI 2 and LTB 4 concentrations were not affected by the grade of inflammation. The expression of PTGS-2, PGES, TLR2, TLR4, and PGE 2, LTC 4 concentrations were changed only in grade II of SE and TNFα was changed in I as well as II grade of SE. In the control group the expression of TLR4, PTGS-2, PGES, and concentration of PGI 2 and LTC 4 were not affected by the stage of estrus cycle but the expression/concentrations oftlr2, TNFα, PGFS, PGE 2, PGF 2α and LTB 4 varied in different stages of estrous cycle. 172

5 In contrast all examined factors with exception of LTC4, varied dependently on the stage of the estrous cycle in the course of subclinical endometritis. In healthy females age of mare affected the expression/concentrations only of LTB 4 and LTC 4 and the concentrations of leukotriens was decreased in older mares. In the course of SE expression or concentrations all of the examined factors was affected, especiallay in the group of the oldest mares (16-23 years) and the youngest (2-5 years). The expression and concentration profile of TLR2, TLR4, PTGS-2, PGE 2, PGF 2α, PGI 2 in the course of SE was not affected in the course of fibrosis. However, the expression and concentration of other factors like PGES and PGFS expression and LTC 4 and LTB 4 concentration was influenced in the mares with fibrosis. Prostacyclin seems to be a very sensitive marker of SE in mares. The concentration of PGI2 metabolite was increased only in inflammed endometrium, independently on the inflammation and fibrotic grade. Moreover in the endometrium of healhy mares PGI 2 was not affected by the age of mare neither by the stage of the estous cycle. Obtained results indicate, that several disturbances of an innate immunity response, including changes in TLRs expression or TNFα concentration, are finding in the equine endometrium in the course of subclinical endometritis. Moreover disturbances in mrna for prostaglandyn synthases and the concentrations of PGs and LTs may lead to disfunctions of endometrial secretory capacity and immunological balance. An affected mrna expression for TLRs and PGs synthases as well as PGs, LTs and TNFα concentrations in the course of SE change the optimal uterine microenvironment in the estrous cycle. Moreover abovementioned changes may affect the maternal recognition of pregnancy and impair early embryo development. This could be potential reason of impaired development of embryo and persistent infertility in mares. Fluctuation of PGs and LTs contents could explain such phenomena as short or long inter-estrous intervals or abnormal oedema patterns during ultrasonography examination. Additionally, it seems that SE could have different pathology than clinical cases and does not fully mimic the inflammatory cascade, especially leukotrien s pathway. For this reason it should be necessary to work out a new terapeutic strategy to induce full innate immunity response or aplication drugs with different site of action. 173