Ocena ekspresji inwolukryny i β-defenzyny2 w skórze osób chorych na atopowe zapalenie skóry i łuszczycę zwykłą

Transkrypt

1 Agnieszka Terlikowska-Brzósko Ocena ekspresji inwolukryny i β-defenzyny2 w skórze osób chorych na atopowe zapalenie skóry i łuszczycę zwykłą STRESZCZENIE Wstęp Atopowe zapalenie skóry (AZS) i łuszczyca zwykła (PSV) są przewlekłymi zapalnymi chorobami skóry, które mają wiele cech wspólnych. Obie jednostki rozpoznaje się na podstawie objawów klinicznych. Badanie histopatologiczne pełni rolę pomocniczą. W wątpliwych przypadkach zarówno badanie kliniczne jak i histopatologiczne są niewystarczające do różnicowania tych chorób. Dlatego poszukiwane są nowe metody diagnostyczne. Zarówno w AZS jak i w PSV opisywane są zaburzenia immunologiczne dotyczące odporności wrodzonej i nabytej oraz nieprawidłowości bariery naskórkowej. Barierę naskórkową stanowią: bariera mikrobiologiczna, bariera fizyczna, bariera chemiczna oraz bariera immunologiczna. Barierę fizyczną tworzy naskórek, a szczególnie najbardziej zewnętrzna jego warstwa, czyli warstwa rogowa. Składająca się z martwych keratynocytów, nazywanych korneocytami, warstwa rogowa naskórka budową przypomina mur. Otoczki lipidowe korneocytów wraz z lipidami macierzy pozakomórkowej są przyrównywane do zaprawy murarskiej a otoczki rogowe korneocytów do cegieł. Jednym z podstawowych białek otoczki rogowej korneocyta, czyli wewnętrznego rusztowania komórki, jest inwolukryna. Jest to białko cytoplazmatyczne produkowane przez keratynocyty. W naskórku osób z łuszczycą zwykłą ekspresja inwolukryny jest wyższa w porównaniu z ekspresją tego białka w naskórku osób zdrowych. Elementem zarówno bariery chemicznej jak i immunologicznej naskórka są peptydy przeciwbakteryjne, a wśród nich β-defenzyna-2. Jest to mała proteina kationowa o właściwościach bójczych dla niektórych bakterii, grzybów i wirusów oraz o właściwościach chemotaktycznych w stosunku do limfocytów T, komórek dendrytycznych i mastocytów. Po raz pierwszy została wyizolowana z łusek pacjentów z łuszczycą zwykłą. Jej stężenie w naskórku osób chorujących na łuszczycę zwykłą jest wyższe niż w naskórku osób zdrowych.

2 Cel pracy Celem pracy była ocena przydatności: białka otoczki rogowej korneocyta - inwolukryny i peptydu przeciw bakteryjnego - β-defenzyny-2 w rozpoznawaniu i różnicowaniu atopowego zapalenia skóry i łuszczycy zwykłej. Realizując cel pracy postanowiono wykonać: 1. Ocenę stężeń inwolukryny i stężeń β-defenzyny-2 oraz ocenę ekspresji mrna dla inwolukryny i ekspresji mrna dla β-defenzyny-2 w skórze chorych na atopowe zapalenie skóry, chorych na łuszczycę zwykłą oraz zdrowych ochotników stanowiących grupę kontrolną. 2. Ocenę zależności pomiarów stężeń inwolukryny, stężeń β-defenzyny-2, ekspresji mrna dla inwolukryny oraz ekspresji mrna dla β-defenzyny-2 pomiędzy badanymi grupami oraz ocenę ich przydatności w rozpoznawaniu i różnicowaniu atopowego zapalenia skóry i łuszczycy zwykłej. 3. Analizę zależności pomiarów stężeń inwolukryny, stężeń β-defenzyny-2, ekspresji mrna dla inwolukryny oraz ekspresji mrna dla β-defenzyny-2 z wybranymi parametrami klinicznymi i immunologicznymi. Metodyka badań Do badania zakwalifikowano 41 osób spośród pacjentów hospitalizowanych w latach w Klinice Dermatologicznej WIM z rozpoznaniem atopowego zapalenia skóry lub łuszczycy zwykłej oraz 10 ochotników stanowiących grupę kontrolną. W badaniu wzięło udział 19 osób z atopowym zapaleniem skóry, w tym 11 kobiet i 8 mężczyzn oraz 22 osoby z łuszczycą zwykłą, w tym 9 kobiet i 13 mężczyzn. Po przeprowadzeniu wywiadu lekarskiego oceniano rozległość i nasilenie zmian skórnych według skal: BSA (Body Surface Area), SCORAD (Severity Scoring of Atopic Dermatitis), Zmodyfikowany SCORAD, EASI (Eczema Area and Severity Index) u pacjentów z atopowym zapaleniem skóry oraz według skal: BSA (Body Surface Area), PASI (Psoriasis Area and Severity Index) u pacjentów z łuszczycą zwykłą. Wybrano zmianę do biopsji i oceniono w jej obrębie nasilenie rumienia, nacieku i złuszczania u osób z łuszczycą zwykłą oraz nasilenie rumienia, nacieku, złuszczania i lichenifikacji u osób z atopowym zapaleniem skóry. Pobierane jednorazowymi sztancami o średnicy 5mm biopsje przepoławiano. Jedną część zamrażano, a drugą część zamrażano po umieszczeniu jej w płynie lizującym. Tkanki przechowywano do czasu wykonania oznaczeń w temperaturze -80ºC. Po zebraniu odpowiedniej ilości tkanek przewieziono je w opakowaniu termicznym do Katedry i Zakładu Histologii i Embriologii Centrum Biostruktury Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego (Kierownik: prof. dr hab. n. med.

3 Jacek Malejczyk), gdzie wykonywano oznaczenia białek i ich mrna. Stężenia inwolukryny i β-defenzyny-2 oznaczano metodą ELISA, natomiast względny poziom ekspresji mrna dla inwolukryny i względny poziom ekspresji mrna dla β-defenzyny-2 oznaczano metodą Real Time PCR. Do analiz dołączono pobierane od pacjentów w trakcie hospitalizacji wyniki badań laboratoryjnych: poziom krwinek białych, wartość białka ostrej fazy CRP, wartość opadu-ob, wartość aktywności transaminaz, wartości lipidogramu oraz wartości bezwzględne krwinek białych w rozmazie: limfocytów, neutrofilów, monocytów, eozynofilów i bazofilów, a w grupie osób z atopowym zapaleniem skóry także całkowity poziom immunoglobuliny E. Badania laboratoryjne były wykonywane w Zakładzie Diagnostyki Laboratoryjnej Centralnego Szpitala Klinicznego Wojskowego Instytutu Medycznego w Warszawie (Kierownik: płk dr hab. n. med. Wiesław Piechota). Uzyskane dane poddano analizie statystycznej za pomocą oprogramowania StatSoft, Inc. (2011), STATISTICA (data analysis software system), version Wyniki badań Stwierdzono obecność zarówno badanych białek jak i ich mrna we wszystkich badanych tkankach. Wartości wszystkich badanych parametrów (stężenie inwolukryny, stężenie β-defenzyny-2, oraz ekspresja mrna dla inwolukryny i ekspresja mrna dla β-defenzyny-2) były wyższe w grupie osób chorych, bez podziału na rozpoznanie, niż u osób zdrowych. Istotna statystycznie różnica wartości dotyczyła stężeń inwolukryny, stężeń β-defenzyny-2, oraz ekspresji mrna dla β-defenzyny-2. Wartości badanych parametrów były wyższe w grupie osób chorujących na atopowe zapalenie skóry niż w grupie kontrolnej. Różnica była istotna statystycznie w zakresie stężeń inwolukryny, stężeń β-defenzyny-2, oraz ekspresji mrna dla β-defenzyny-2. Wartości badanych parametrów były wyższe w grupie osób chorujących na łuszczycę zwykłą niż w grupie kontrolnej. Różnica była istotna statystycznie w zakresie stężeń inwolukryny, stężeń β-defenzyny-2 oraz ekspresji mrna dla β-defenzyny-2. Wartości badanych parametrów były wyższe w grupie osób chorujących na łuszczycę zwykłą niż w grupie osób chorujących na atopowe zapalenie skóry. Różnica była istotna statystycznie w zakresie stężeń inwolukryny, stężeń β-defenzyny-2, oraz ekspresji mrna dla β-defenzyny-2. Analizując wzajemne zależności miedzy badanymi parametrami stwierdzono istotną statystycznie, zgodną, silną zależność pomiędzy stężeniami β-defenzyny-2 a stężeniami inwolukryny we wszystkich grupach badanych. W oparciu o uzyskane dane stworzono drzewa diagnostyczne.

4 Nie stwierdzono zależności badanych parametrów ani od płci, ani od wieku osób badanych. W grupie chorych na łuszczycę zwykłą stwierdzono zależność ekspresji mrna dla β-defenzyny-2 od czasu trwania choroby. Ani u chorych na łuszczycę zwykłą, ani u chorych na atopowe zapalenie skóry nie stwierdzono zależności badanych parametrów od czasu utrzymywania się zmiany skórnej, z której pobierano biopsję. Analizowano zależność badanych parametrów od świądu zmian skórnych stwierdzając w grupie osób z atopowym zapaleniem skóry istotną statystycznie, silną, odwrotną zależność nasilenia świądu od ekspresji mrna dla inwolukryny. Oceniano zależność badanych parametrów od rozległości i natężenia zmian skórnych. U osób z atopowym zapaleniem skóry stwierdzono silną, zgodną zależność ekspresji mrna dla β-defenzyny-2 od natężenia zmian skórnych mierzonych skalami: skala SCORAD i zmodyfikowana skala SCORAD. W grupie osób z atopowym zapaleniem skóry nie stwierdzono istotnych statystycznie zależności badanych parametrów ani od rozległości zmian skórnych ocenianych w skali BSA, ani od oceny nasilenia zmian mierzonych skalą EASI, ani od nasilenia: rumienia, nacieku, złuszczania i lichenizacji w obrębie zmiany, z której pobierano biopsję. W grupie osób chorujących na łuszczycę zwykłą stwierdzono istotne statystycznie zależności między ekspresją mrna dla β-defenzyny-2 a nasileniem nacieku i złuszczania w obrębie zmiany, z której była pobierana biopsja. Nie stwierdzono natomiast zależności badanych parametrów ani od nasilenia rumienia w obrębie zmiany, z której pobierana była biopsja, ani od nasilenia zmian skórnych mierzonego skalą PASI, ani od rozległości zmian skórnych ocenianych skalą BSA. Spośród wyników analiz zależności badanych parametrów od wyników badań laboratoryjnych trzy zasługują na uwagę. W grupie osób z atopowym zapaleniem skóry istotna statystycznie, silna, odwrotna zależność miedzy ekspresją mrna dla β-defenzyny-2 a eozynofilią we krwi obwodowej. W grupie osób z łuszczycą zwykłą istotna statystycznie, silna i bardzo silna, odwrotna zależność między stężeniem β-defenzyny-2 a poziomem frakcji HDL-cholesterolu. W grupie osób chorych, bez podziału na rozpoznanie, zależność odwrotna miedzy poziomem ekspresji mrna dla inwolukryny a bazofilią we krwi obwodowej. Wnioski 1. Przeprowadzone badania wykazały obecność β-defenzyny-2 i inwolukryny zarówno w skórze osób zdrowych jak i w skórze osób chorych na przewlekłe choroby zapalne tj. atopowe zapalenie skóry

5 oraz łuszczycę zwykłą. Na podstawie pomiarów wykazano, że stężenia inwolukryny, stężenia β- defenzyny-2 oraz ekspresja mrna dla β-defenzyny-2 (hbd-2 mrna) są istotnie wyższe w skórze osób chorych na łuszczycę zwykłą i atopowe zapalenie skóry niż u osób zdrowych. Analiza wykazała również, że stężenia inwolukryny, stężenia β-defenzyny-2 oraz ekspresja mrna dla β-defenzyny-2 (hbd-2 mrna) są istotnie wyższe w skórze chorych na łuszczycę zwykłą niż chorych na atopowe zapalenie skóry. β-defenzyna-2 i inwolukryna mają najwyższe stężenia w zmianach skórnych u chorych z łuszczycą zwykłą. 2. Pomiary ekspresji mrna dla β-defenzyny-2, ekspresji mrna dla inwolukryny oraz stężeń β-defenzyny-2 i stężeń inwolukryny mogą być elementem diagnostyki różnicowej przewlekłych chorób zapalnych skóry, tzn. atopowego zapalenia skóry i łuszczycy zwykłej. Ocena ekspresji mrna dla β-defenzyny-2 w skórze ma największe znaczenie diagnostyczne. Wnioskowanie w oparciu o wyniki pomiarów ekspresji mrna dla β-defenzyny-2, ekspresji mrna dla inwolukryny oraz stężenia inwolukryny zwiększa trafność rozpoznania. 3. Ocena ekspresji mrna dla β-defenzyny-2 w skórze może być przydatna w ocenie i kontroli nasilenia stanu zapalnego u chorych na łuszczycę zwykłą.