(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (13) (51) T3 Int.Cl. A61K 35/74 ( ) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 2013/43 EP B1 (54) Tytuł wynalazku: Sposób wytwarzania farmaceutycznie czynnego wyciągu z Arthrospira spec. (30) Pierwszeństwo: DE (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2013/10 (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 2014/01 (73) Uprawniony z patentu: Ocean Research & Development GmbH, Reinbek, DE (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP T3 JÖRG KEIMES, Reinbek, DE PATRICK GÜNTHER, Aumühle, DE (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Włodzimierz Gałązkiewicz BRANDPAT KANCELARIA RZECZNIKÓW PATENTOWYCH CHLEBICKA CZYŻ GAŁĄZKIEWICZ ZIÓŁKOWSKI SP.P. ul. Hoża 29/31 lok Warszawa Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 1519-PAT-EP-PL 1 EP Opis [0001] Wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania farmaceutycznie czynnego wyciągu z cyjanobakterii Arthrospira spec. [0002] Od dawna wiadomo, że organizmy wodne rozwinęły szereg cząsteczkowych mechanizmów obronnych przeciwko atakom mikrobów, zwłaszcza bakterii i grzybów. Wraz z wzrastającym rozwojem technik molekularnobiologicznych cząsteczki te w ostatnich czasach stały się też celem badań dla medycznego zastosowania w przypadku chorób ludzi i zwierząt. [0003] W szczególności należy tu wymienić różne algi i cyjanobakterie, które są nie tylko samym przedmiotem badań cząsteczkowych mechanizmów obronnych, lecz ze względu na wytwarzanie przez nie farmaceutycznie czynnych substancji są między innymi także znaczącym czynnikiem gospodarczym jako uzupełniające środki spożywcze. [0004] O cyjanobakteriach Arthrospira spec. wiadomo na przykład, że w warunkach fizjologicznego stresu wydzielają przeciwdrobnoustrojowo czynne substancje, które przez odpowiednie etapy ekstrakcyjne mogą zostać wzbogacone i zastosowane do leczenia różnych schorzeń. Taki sposób znany jest na przykład z WO 2006/ A1. [0005] Jednak warunki stresowe, w których organizmy stosowane do produkcji określonych substancji wytwarzają najwięcej żądanych substancji, można tylko z trudem ustalić względnie nastawić, tak że często uzyskuje się mało żądanych substancji albo nastawia się zbyt ostre warunki, wskutek czego organizmy obumierają. [0006] Zadaniem wynalazku jest więc dostarczenie sposobu wytwarzania farmaceutycznie czynnego wyciągu z Arthrospira spec., dzięki któremu naturalnie występującą zawartość

3 1519-PAT-EP-PL 2 EP farmaceutycznie czynnych substancji można ekstrahować z tych organizmów w wysokim stopniu. Przy tym uzyskany wyciąg powinien wykazywać dobre działanie przeciwdrobnoustrojowe, zwłaszcza bakteriobójcze i grzybobójcze. [0007] Zadanie to rozwiązuje sposób o cechach przedstawionych w zastrz. 1. Zastrzeżenia zależne przedstawiają korzystne postacie wykonania wynalazku. [0008] Myślą przewodnią wynalazku jest to, aby do roztwarzania komórek stosować występującą w handlu wytłaczarkę, która zresztą występuje w przemyśle przerabiającym Arthrospira do wytwarzania produktów w postaci tabletek. [0009] W szczególności przewiduje się wytłaczanie proszku dostępnego w handlu jako proszek Spirulina z wysuszonych osobników Arthrospira, korzystnie cyjanobakterii Arthrospira maxima, Arthrospira fusiformis lub Arthrospira platensis, z dodatkiem wody w temperaturze pomiędzy każdorazowo włącznie 130 C i 160 C pod ciśnieniem pomiędzy każdorazowo włącznie 8 MPa i 13 MPa (co odpowiada 80 do 130 bar), tak że przy głowicy matrycy wytłaczarki tylko na krótko dochodzi do temperatury najwyżej 160 C. Wybór wytłaczarki nadającej się do sposobu według wynalazku zależy więc od możliwości stosowania wody jako rozpuszczalnika, jak również od wyżej wymienionych parametrów, które zasadniczo nie powinny być przekroczone ani w górę ani w dół. [0010] W następnym etapie składniki Arthrospira ekstrahuje się za pomocą rozpuszczalnika organicznego, korzystnie octanu etylu. Szczególnie korzystnie stosuje się tu 10 ml octanu etylu na 1 g produktu wytłaczania, przy czym ekstrakcję prowadzi się najkorzystniej w ciągu 24 h w temperaturze 28 C.

4 1519-PAT-EP-PL 3 EP [0011] Aby na koniec otrzymać produkt handlowy, można usuwać rozpuszczalnik stosowany do ekstrakcji, na przykład na wyparce rotacyjnej. Szczególnie korzystnie pozostały po usunięciu rozpuszczalnika wyciąg dla odbarwienia i/lub dla usunięcia zapachu wyciągu sączy się z zastosowaniem węgla aktywnego, aby ostatecznie otrzymać wodny wyciąg, który można stosować do celów terapeutycznych lub profilaktycznych w medycynie i weterynarii. Można też wyciąg ten stosować w dziedzinie kosmetyki. [0012] Wynalazek jest bliżej wyjaśniony na podstawie szczególnie korzystnego przykładu wykonania. [0013] Nie obrabiany genetycznie proszek Spirulina (Spirulina platensis względnie Arthrospira platensis) przerabia się na peletki w wytłaczarce jednowałowej firmy Kahl typu OEE8. [0014] Stosowany proszek Arthrospira wykazuje właściwości przedstawione w Tabeli 1: Tabela 1 Parametry Metoda/Sprzęt Wartości pomiaru Barwa wizualnie ciemnozielona Zapach DAB 10 (V.3.1.6) właściwy dla gatunku Konsystencja wizualnie w postaci proszku Wilgotność DAB 10 (V.6.22.N2) dozymetr absolutny w 105 C Białko 35 LMBG L oznacznik Kjeldahla Substancje mineralne DAB 10 (V ) spopielenie Tłuszcz/Lipidy Sposób według 35 LMBG L ; ekstrakcja według Weibull/Stoldt Toksyny algowe HPLC, detekcja UV, spektrometr masowy 3,92 g/100 g 54,75 g/100 g 5,65 g/100 g 5,6 g/100 g nie wykrywalne

5 1519-PAT-EP-PL 4 EP Parametry Metoda/Sprzęt Wartości pomiaru Chlorofil Jeffrey, SW i Humphrey, GF (1975) Biochem. Physiol. Pflanzen 167, , fotometr spektralny 1,019 mg/100 g [0015] Łączna liczba drobnoustrojów wynosi 7 x 10 4 drobnoustrojów/g proszku, przy czym udział drożdży, pleśni i zarazków typu coli wynosi każdorazowo mniej niż 100 komórek/g proszku (Escherichia coli była niewykrywalna). [0016] Wytłaczarka stosowana w tym przykładzie odznacza się wysoką obciążalnością, możliwością pracy pod wysokim ciśnieniem (do 150 bar), wysokim poziomem mocy (do 11 kw), hydraulicznie sterowaną matrycą i doprowadzaniem cieczy w procesie ciągłym. W szczególności poprzez płytę stykową można sterować ciśnieniem, szybkością obrotową wału wytłaczarki, wprowadzaniem produktu i doprowadzaniem cieczy, tu: wody. Dwa czujniki temperatury umożliwiają obserwację i możliwe przeciwsterowanie poprzez chłodzenie. Wytłaczarka wykorzystuje nastawne na głębokość wnikania stożkowo doprowadzane śruby, które zastępują drugi wał. [0017] Szczególną zaletą wytłaczania jest bardzo krótkie obciążenie temperaturowe sproszkowanych mikroalg, wynoszące najwyżej 2 minuty, w zależności od nastawienia okresu przebywania w reaktorze. Jak stwierdzono, zgranie ciśnienia i sił ścinających pomimo bardzo krótkiego obciążenia temperaturowego umożliwia wysoki stopień roztwarzania. W szczególności w przypadku zastosowanej wytłaczarki możliwe jest chłodzenie wytłaczarki cieczą chłodzącą, tak że w ciągu całego procesu można utrzymywać względnie niską temperaturę.

6 1519-PAT-EP-PL 5 EP [0018] W pierwszym etapie sproszkowaną Arthrospira wprowadza się do wytłaczarki za pomocą ślimaka dozującego. Po krótkim okresie zagniatania proszek zwilża się przez doprowadzenie wody w zakresie każdorazowo włącznie 2 l/h do 4 l/h. Dopiero teraz rozpoczyna się mieszanie z wodą i ścinanie mieszaniny sproszkowanej Arthrospira/wody. [0019] Zdolność przepustowa proszku w czasie przebiegu procesu wynosi korzystnie około 40 kg/h, przy czym korzystnie stosuje się standardowy wał (nr ) z 300 obr./minutę. [0020] Na końcu ślimaka wytłaczarkę zamyka matryca, która umożliwia mieszaninie alg i wody wyjście z wytłaczarki przez nawiercone otwory względnie szpary w określonej liczbie i formie. Korzystnie stosuje się matrycę o 14 otworach o średnicy otworu 3,0 mm każdy. Przy zastosowaniu biegu wymuszonego dochodzi do zgrania ciśnienia i ścinania, aż do wytłoczenia produktu wytłaczania przez otwory względnie szpary. Podczas wychodzenia produktu wytłaczania z wytłaczarki przez matrycę dochodzi do rozprężania produktu wytłaczania z odparowaniem rozpuszczalnika i nagłym obniżeniem temperatury. [0021] Korzystnie umocowana za matrycą obracająca się głowica nożowa ścina produkt wytłaczania na peletki, które podczas spadania do pojemnika zbiorczego dzięki zwiększonej powierzchni szybko wysychają i ochładzają się. Przy matrycy temperatura może na krótko wzrastać do 160 C. [0022] Do ekstrakcji farmaceutycznie czynnych składników Arthrospira stosuje się każdorazowo 10 ml octanu etylu na 1 g wytłaczanej sproszkowanej Arthrospira i poddaje się inkubacji w ciągu 24 h w temperaturze 28 C. Po inkubacji roztwór korzystnie sączy się przez sączek fałdowany i rozpuszczalnik odparowuje się

7 1519-PAT-EP-PL 6 EP na wyparce rotacyjnej. Następnie przesącz korzystnie roztwarza się w 1 ml etanolu i sączy przez sterylny filtr. [0023] Szczególnie korzystnie w celu odbarwienia i/lub zmniejszenia zapachu wyciąg można sączyć dalej, na przykład przez kolumnę z węglem aktywnym. W wyniku otrzymuje się przezroczysty roztwór o zapachu właściwym dla gatunku. [0024] Wyciąg otrzymany korzystnym sposobem wykazuje wysoką czynność przeciw drobnoustrojom, zwłaszcza czynność przeciwbakteryjną i przeciwgrzybiczą. Jako miarę bioaktywności bierze się pod uwagę czynność chitynazy w wyciągu. [0025] I tak w wyciągu z proszku Spirulina Powder High Performance, który nie był poddany wytłaczaniu, lecz poza tym był traktowany w sposób wyżej opisany, stwierdzono czynność chitynazy 5,5 U/g. [0026] W przeciwieństwie do tego pomiar czynności chitynazy proszku Spirulina Powder High Performance poddanego wytłaczaniu sposobem według wynalazku wykazuje w porównaniu z nietraktowanym proszkiem około 3,5-krotnie zwiększoną czynność wynoszącą 19,1 U/g. [0027] Czynność wyciągu alg przeciwko grzybom, bakteriom i wirusom prowadzi się w pierwszym etapie in vitro, to jest prowadzi się klasyczny test hamowania wobec grzybów i bakterii. W szczególności prowadzono testowanie bioaktywności (między innymi testy hamowania) z Propionibakterium acnes, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Trichophytum rubrum, Trichophytum mentagrophytes i opryszczką. Przeciwwirusowe działanie ochronne wobec wirusów opryszczki (HHV-1) badano na komórkach Vero. Po skutecznych pozytywnych testach in vitro prowadzono dalej

8 1519-PAT-EP-PL 7 EP leczenie i obserwację przypadków na pacjentach w celu zbadania działania klinicznego. [0028] Wyniki testowania wykazują, że w porównaniu z czynnością przeciwdrobnoustrojową wyciągu Arthrospira wytworzonego bez wytłaczania materiału wyjściowego (Ekstrakt 1) wyciąg otrzymywany sposobem według wynalazku (Ekstrakt 2) wykazuje podwyższoną czynność przeciwdrobnoustrojową. Ponadto porównuje się wartości pomiarowe uzyskane dla Arthrospira platensis (Ekstrakt 1 i Ekstrakt 2) z czynnością przeciwdrobnoustrojową wytworzonego sposobem według wynalazku wyciągu z Arthrospira maxima (Ekstrakt 3). [0029] Przedstawione w Tabeli 2 wyniki testów ukazują dla Propionibakterium acnes, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Trichophytum rubrum, Trichophytum mentagrophytes bioaktywność każdorazowego wyciągu na podstawie działania hamującego tego ekstraktu w %. Jako 0% oznacza się wszelką czynność hamującą wynoszącą 30% i/lub mniej. Dla wirusów opryszczki wykazano działanie hamujące dla roztworów ekstrakcyjnych >2%. Tabela 2 P. acnes B. subtilis E. coli T. rubrum T. mentagrophytes Ekstrakt 1-0,1% Ekstrakt 1-1% Ekstrakt 1-5% Ekstrakt 2-0,1% Ekstrakt 2-1% Ekstrakt 2-5% Ekstrakt 3-0,1% Ekstrakt 3-1% Ekstrakt 3-5%

9 1519-PAT-EP-PL 8 EP [0030] W dalszym teście zbadano hamowanie innych patogenów przy stosowaniu 0,5% rozpuszczonego wyciągu otrzymanego zgodnie z wynalazkiem (Tabela 3). Tabela 3 Patogen Procentowe hamowanie Propionibacterium acnes 100% Staphylococcus epidermis 100% Staphylococcus aureus 100% Pseudomonas aeruginosa 90% Aspergillus niger 80% Dermabacter 90% Brevibacter 97% Rodzaje Trichoderma 100% [0031] Sposób według wynalazku umożliwia roztwarzanie sproszkowanych Arthrospira w celu uzyskania farmaceutycznie czynnego wyciągu Arthrospira o podwyższonej czynności przeciwdrobnoustrojowej. Sposób ten pozwala na uniknięcie skomplikowanych i wymagających nakładów metod wzmożonego wytwarzania farmaceutycznie czynnych substancji przez sam organizm, lecz podwyższa wydajność tych substancji w wyciągu hodowanych w sposób znany albo też w warunkach fizjologicznego stresu cyjanobakterii Arthrospira w porównaniu z wyciągami otrzymywanymi w znany sposób. [0032] W szczególności wyciąg według wynalazku nadaje się do stosowania w przypadku chorób wywoływanych zwłaszcza przez Propionibacterium acnes, Staphylococcus epidermis,

10 1519-PAT-EP-PL 9 EP Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Aspergillus niger, Dermabacter, Brevibacter i rodzaje Trichoderma, pojedynczo lub w kombinacji. Choroby te są w szczególności chorobami skóry, na przykład trądzik, opryszczka (zwłaszcza typ I), zapalenie powiek, wewnętrzne zapalenie oka. [0033] Ponadto w niektórych badaniach można było też wykazać działanie wyciągu wytwarzanego sposobem według wynalazku przeciwko wirusom z grupy ludzkich wirusów wywołujących brodawczaki (HPV).

11 1519-PAT-EP-PL 10 EP Zastrzeżenia patentowe 1. Sposób wytwarzania farmaceutycznie czynnego wyciągu z cyjanobakterii Arthrospira spec. z następującymi etapami - wytłaczanie proszku zawierającego Arthrospira spec. z dodatkiem wody; - ekstrahowanie produktu wytłaczania za pomocą rozpuszczalnika organicznego; i - przygotowanie wyciągu jako farmaceutycznie czynnej kompozycji. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wytłaczanie prowadzi się w temperaturze pomiędzy każdorazowo włącznie pomiędzy 130 C a 160 C i pod ciśnieniem pomiędzy każdorazowo włącznie pomiędzy 8 MPa a 13 MPa. 3. Sposób według jednego z poprzednich zastrz., znamienny tym, że rozpuszczalnikiem organicznym jest octan etylu. 4. Sposób według jednego z poprzednich zastrz., znamienny tym, że ekstrahowanie prowadzi się w temperaturze 28 C w ciągu 24 godzin. 5. Sposób według jednego z poprzednich zastrz., znamienny tym, że po ekstrahowaniu prowadzi się następujące etapy: - usuwanie rozpuszczalnika; - sączenie wyciągu dla odbarwienia i/lub usunięcia zapachu wyciągu; oraz - przygotowanie przesączonego wyciągu jako farmaceutycznie czynnej kompozycji.

12 1519-PAT-EP-PL 11 EP Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że przesączony wyciąg roztwarza się w etanolu i/lub sączy przez sterylny filtr. 7. Sposób według jednego z poprzednich zastrz., znamienny tym, że wytłacza się wodny roztwór proszku zawierającego Arthrospira spec.. 8. Sposób według jednego z poprzednich zastrz., znamienny tym, że do proszku podczas wytłaczania o zdolności przepustowej 40 kg proszku na godzinę dodaje się 2l do 4l wody na godzinę. 9. Sposób według jednego z poprzednich zastrz., znamienny tym, że ekstrahowanie prowadzi się za pomocą 10 ml octanu etylu na 1 g produktu wytłaczania. 10. Sposób według któregokolwiek z poprzednich zastrzeżeń, znamienny tym, że cyjanobakterią jest Arthrospira maxima, Arthrospira fusiformis albo Arthrospira platensis.