Zestaw do izolacji DNA z wymazów oraz nasienia. Nr kat. EM06 Wersja zestawu:

Transkrypt

1 Zestaw do izolacji DNA z wymazów oraz nasienia Nr kat. EM06 Wersja zestawu:

2

3 Nr kat. EM06 I. PRZEZNACZENIE ZESTAWU Zestaw EXTRACTME DNA SWAB & SEMEN przeznaczony jest do szybkiej i wydajnej izolacji genomowego DNA o wysokiej czystości z ludzkich oraz zwierzęcych wymazów z błon śluzowych (m.in. z policzka, nosa, gardła, pochwy), krwi, śliny oraz nasienia. Protokół izolacji i składy buforów zostały zoptymalizowane w celu osiągnięcia zarówno wysokiej wydajności, jak i czystości izolowanego DNA. Produkt przeznaczony jest wyłącznie do zastosowań badawczo-rozwojowych. II. SKŁAD I PRZECHOWYWANIE ZESTAWU Liczba izolacji 25 izolacji 100 izolacji 250 izolacji 3 izolacje (DEMO) Nr katalogowy EM EM EM EM06-D SSL Buffer (Tissue Lysis Buffer) 8,8 ml 35,2 ml 88 ml 1,1 ml Proteinase K (lyophilized) 1 szt. 2 szt. 5 szt. 1 szt. Proteinase Buffer 200 µl 640 µl 1,6 ml 200 µl DTT 1 szt. 1 szt. 1 szt. 1 szt. SSB Buffer 8,8 ml 35,2 ml 88 ml 1,1 ml SSW1 Buffer 15 ml 60 ml 150 ml 1,8 ml SSW2 Buffer 10 ml 40 ml 100 ml 1,2 ml Elution Buffer 5 ml 2 x 10 ml 5 x 10 ml 0,8 ml DNA Purification Columns 25 szt. 2 x 50 szt. 5 x 50 szt. 3 szt. Collection Tubes (2 ml) 25 szt. 2 x 50 szt. 5 x 50 szt. 3 szt. Proteinaza K dostarczana jest w postaci liofilizowanej. Liofilizat proteinazy K należy przechowywać w temp. +4 C. Przed pierwszym użyciem liofilizat należy rozpuścić w odpowiedniej ilości buforu do proteinazy (Proteinase Buffer), zgodnie z zaleceniami na etykiecie probówki. Roztwór proteinazy K należy przechowywać w temp. -20 C! DTT należy przechowywać w temp. -20 C. Przed pierwszym użyciem DTT należy rozpuścić w jałowej wodzie zgodnie z zaleceniami na etykiecie probówki. Roztwór DTT należy przechowywać również w temp. -20 C!

4 Pozostałe składniki zestawu należy przechowywać w temp. pokojowej (15 25 C). Wszystkie roztwory z zestawu należy przechowywać szczelnie zamknięte, aby uniknąć zmiany stężeń w wyniku parowania. Odpowiednio przechowywany zestaw zachowuje stabilność przez okres minimum 12 miesięcy. III. WYMAGANE MATERIAŁY I SPRZĘT jałowe pałeczki wymazowe etanol % cz.d.a jałowe probówki wirownicze typu Eendorf (1,5 2 ml) pipety automatyczne oraz odpowiednie końcówki do pipet rękawiczki jednorazowe mikrowirówka z rotorem na probówki o poj. 1,5 2 ml (> 12 tys. rpm) termoblok lub łaźnia wodna (do 70 C) worteks IV. ZASADA IZOLACJI Procedura oczyszczania DNA składa się z 4 etapów i jest przeprowadzana z wykorzystaniem minikolumn wirowniczych, zawierających odpowiednie złoże wydajnie i selektywnie wiążące kwasy nukleinowe. Próbka wymazu lub nasienia poddawana jest lizie enzymatycznej z wykorzystaniem zoptymalizowanego buforu SSL Buffer oraz silnej proteazy (proteinazy K), a w przypadku izolacji DNA z nasienia dodatkowo DTT. Na tym etapie degradacji ulegają błony oraz wszystkie białka komórkowe. Po dodaniu soli chaotropowych i etanolu, lizat przenoszony jest do minikolumny ze złożem. Dwuetapowe przemywanie DNA związanego do złoża ma na celu usunięcie pozostałych zanieczyszczeń i/lub inhibitorów reakcji enzymatycznych. Oczyszczone DNA eluowane jest z minikolumny buforem o niskiej sile jonowej (Elution Buffer) lub wodą (ph 7,0 9,0) i jest gotowe do bezpośredniego wykorzystania w technikach biologii molekularnej (takich jak PCR, qpcr, Southern blotting, sekwencjonowanie DNA, trawienie enzymami restrykcyjnymi, ligacja DNA itp.) lub może być przechowywane do późniejszego użycia. V. KONTROLA jakości Każda partia produkcyjna (LOT) zestawu EXTRACTME DNA SWAB & SEMEN testowana jest według wewnętrznych procedur. Wydajność, czystość oraz stabilność wyizolowanego DNA analizowane są metodami spektrofotometrycznymi

5 Nr kat. EM06 oraz elektroforetycznymi. Dodatkowo funkcjonalna jakość oczyszczonego DNA sprawdzana jest w reakcji PCR, QPCR oraz reakcji trawienia enzymami restrykcyjnymi. VI. SPECYFIKACJA PRODUKTU Materiał wyjściowy Wymazy (m.in. z policzka, nosa, gardła, pochwy, krwi, śliny) lub nasienie. Wydajność izolacji Zależy od rodzaju i ilości pobranego materiału. Do 3 µg DNA dla próbki wymazu oraz 2 7 µg DNA dla 150 µl próbki nasienia. Pojemność złoża ok. 25 µg DNA Czas izolacji minut Czystość DNA A 260 /A 280 = 1,7 2,0 VII. ŚRODKI OSTROŻNOŚCI Próbki wymazów oraz nasienia są materiałami niebezpiecznymi ze względu na potencjalną zawartość mikroorganizmów patogennych lub substancji zagrażających zdrowiu, bądź życiu człowieka. Przy pracy z próbkami wymazów/nasienia należy stosować się do wymogów dotyczących biologicznych materiałów niebezpiecznych. Zaleca się przeprowadzać całą procedurę izolacji w komorze klasy II bezpieczeństwa biologicznego, używać ochronnej odzieży laboratoryjnej oraz rękawiczek jednorazowych. Zalecane jest używanie jałowych końcówek do pipet z filtrami. Należy unikać dotykania ścianek minikolumn pipetą, aby nie przenosić śladów DNA pomiędzy kolejnymi minikolumnami. Odpady zawierające sole guanidyny mogą tworzyć wysoce reaktywne związki w połączeniu z substancjami utleniającymi. W przypadku rozlania buforu, powierzchnię zmyć wodą z detergentem.

6 VIII. SZCZEGÓLNE ZALECENIA I UWAGI Elucja DNA ze złoża Optymalną objętość buforu elucyjnego (Elution Buffer) należy dobrać w zależności od ilości i rodzaju materiału użytego do izolacji oraz od wymaganego poziomu stężenia DNA w eluacie. Zaleca się stosowanie μl Elution Buffer. Ilość oczyszczonego DNA zależy od rodzaju próbki oraz ilości komórek w próbce (jakości wymazu, specyfiki miejsca skąd pobrano materiał oraz zróżnicowania osobniczego). Zwykle wydajność izolacji z 1 próbki wymazu z policzka wynosi 1 3 µg DNA, natomiast z 150 µl nasienia wynosi 2 7 µg DNA. Jeśli pożądane jest otrzymanie DNA o wysokim stężeniu, objętość buforu elucyjnego można zmniejszyć nawet do 20 μl. Należy mieć jednak na uwadze, że obniży to wydajność odzysku DNA. Istotne w tym przypadku jest dodanie buforu elucyjnego centralnie na powierzchnię złoża. W celu uzyskania maksymalnej wydajności elucji DNA, bufor elucyjny należy podgrzać do temp. 80 C i wydłużyć czas inkubacji złoża z buforem do 10 minut. Maksymalny odzysk DNA można uzyskać poprzez przeprowadzenie dodatkowej elucji (200 μl). W tym przypadku należy powtórzyć punkty Protokołu izolacji, umieszczając minikolumnę w nowej probówce 1,5 ml typu Eendorf. Elution Buffer nie zawiera EDTA, którego obecność może niekorzystnie wpływać na niektóre reakcje enzymatyczne. Zanieczyszczenia RNA Obecność śladowych ilości RNA może niekorzystnie wpływać na niektóre reakcje enzymatyczne, ale nie wpływa na inhibicję PCR. Jeśli niezbędne jest otrzymanie oczyszczonego preparatu genomowego DNA wolnego od RNA należy dodać 4 μl roztworu RNazy A (10 mg/ml; nr kat. RP14, RP145) do próbki po dodaniu SSL Buffer (pkt. 2 Protokołu izolacji). Wymieszać i inkubować przez 5 min w temp. 37 C, a następnie dodać odpowiednią ilość Proteinase K, a w przypadku izolacji DNA z nasienia dodatkowo 1M DTT i kontynuować izolację zgodnie z Protokołem izolacji. IX. PRZYGOTOWANIE PRÓBKI A. Nasienie Próbkę nasienia należy pobrać do jałowego pojemnika. Zestaw pozwala na izolację DNA zarówno z materiału świeżo pobranego, jak i mrożonego. Nasienie można przechowywać w temp. +4 C przez krótki okres czasu, lub w postaci zamrożonej (preferowana temp. -80 C) przez dłuższy czas. Należy unikać częstego rozmrażania i zamrażania próbek przed izolacją.

7 Nr kat. EM06 Przed pobraniem odpowiedniej objętości nasienia do izolacji należy dokładnie wymieszać próbkę, z której materiał ma zostać pobrany. Gdy objętość próbki nasienia jest mniejsza niż 150 µl, należy dodać buforu elucyjnego (Elution Buffer: 10 mm Tris-HCl, ph 8,5) lub roztworu PBS (brak w zestawie) do całkowitej objętości 150 µl, a następnie przejść do pkt. 1 Protokołu izolacji z nasienia (sekcja XIA). Należy jednak mieć na uwadze, że wydajność takiej izolacji DNA będzie niższa. B. Wymazy W celu pobrania wymazu z błon śluzowych jamy ustnej należy co najmniej 10 razy mocno potrzeć pałeczką wymazową wewnętrzną stronę policzka, a następnie końcówkę z pobranymi komórkami nabłonka umieścić w probówce 1,5 2 ml typu Eendorf i odciąć wystający patyczek. Jakakolwiek forma osuszania wymazu nie jest konieczna. Należy upewnić się, że osoba, od której pobierano wymaz nie spożywała pokarmów oraz płynów przez co najmniej 30 minut przed pobraniem próbki. Użycie niskiej jakości materiału wyjściowego znacząco wpływa na obniżenie wydajności izolacji DNA. Do wykonania wymazu można użyć każdej komercyjnie dostępnej jałowej pałeczki wymazowej. Próbkę wymazu można przechowywać w temp. +4 C przez krótki okres czasu, lub w postaci zamrożonej (preferowana temp. -80 C) przez dłuższy czas. X. PRZED PRZYSTĄPIENIEM DO IZOLACJI 1. Każdy z odczynników zestawu należy wymieszać. 2. Należy pamiętać o rozpuszczeniu liofilizatu Proteinase K w odpowiedniej ilości buforu do proteinazy (Proteinase Buffer) oraz DTT w wodzie, zgodnie z zaleceniami na probówkach. 3. W przypadku wytrącenia się osadu w roztworze SSB Buffer, butelkę z roztworem należy ogrzać do temp C i inkubować, aż do całkowitego rozpuszczenia osadu, mieszając co kilka minut, a następnie schłodzić do temp. pokojowej. 4. Nagrzać termoblok lub łaźnię wodną do temp. 56 C. 5. Można ogrzać odpowiednią ilość buforu elucyjnego do temp. 70 C. 6. Należy pamiętać, żeby wszystkie etapy izolacji przeprowadzać w temp. pokojowej, jeśli nie zalecono inaczej. 7. Wszystkie etapy wirowania zostały zoptymalizowane z wykorzystaniem mikrowirówki Eendorf 5417C. Prędkości wirowania podane w jednostkach rpm odnoszą się do tej mikrowirówki.

8 XI. PROTOKÓŁ IZOLACJI dna A. Nasienie 1. Do 1,5 2 ml probówki typu Eendorf pobrać 150 µl nasienia. Sposób pobierania próbki opisano w sekcji IXA. Przygotowanie próbki. 2. Dodać 350 µl buforu do lizy SSL Buffer, 6 µl Proteinase K oraz 20 µl 1M DTT, worteksować 3 s. 3. Przejść do pkt. 3 Protokołu izolacji DNA z wymazów (sekcja XIB). B. Wymazy 1. Końcówkę pałeczki wymazowej z pobranym materiałem biologicznym umieścić w 1,5 ml probówce typu Eendorf, a następnie odciąć wystająca część pałeczki tak, aby możliwe było swobodne zamknięcie probówki. Sposób pobierania wymazu opisano w sekcji IXB. Przygotowanie próbki. 2. Dodać 350 µl buforu do lizy SSL Buffer oraz 6 µl Proteinase K, worteksować 3 s. 3. Inkubować przez 30 min w temp. 56 C. Podczas inkubacji kilka razy mieszać poprzez odwracanie probówki. 4. Dodać 350 µl buforu wiążącego SSB Buffer i worteksować 3 s. 5. Inkubować przez 6 min w temp. 70 C. 6. Dokładnie wycisnąć o ściankę probówki końcówkę pałeczki wymazowej tak, aby odzyskać jak największa ilość lizatu. Odrzucić pałeczkę wymazową. Można nie usuwać pałeczki wymazowej z probówki, jednakże wpłynie to na obniżenie wydajności izolacji DNA ze względu na niecałkowite naniesienie lizatu na minikolumnę. 7. Dodać 200 µl % etanolu (brak w zestawie), wymieszać poprzez kilkukrotne odwracanie probówki.

9 Nr kat. EM06 8. Przenieść 700 µl lizatu na złoże minikolumny umieszczonej w probówce odbierającej. 9. Wirować 1 min przy tys. rpm (11 15 tys. x g). 10. Wylać przesącz z probówki odbierającej i umieścić w niej z powrotem minikolumnę. 11. Nanieść całą pozostałą objętość lizatu na złoże minikolumny. 12. Wirować 1 min przy tys. rpm (11 15 tys. x g). 13. Przenieść minikolumnę do nowej probówki odbierającej (2 ml). 14. Dodać do minikolumny 600 μl buforu płuczącego SSW1 Buffer i wirować 30 s przy tys. rpm (11 15 tys. x g). 15. Wylać przesącz z probówki odbierającej i umieścić w niej z powrotem minikolumnę. 16. Dodać do minikolumny 400 μl buforu płuczącego SSW2 Buffer i wirować 2 min przy tys. rpm (15 21 tys. x g). Bufory płuczące zawierają alkohol, który może powodować inhibicję niektórych reakcji enzymatycznych, a także obniżenie wydajności elucji, dlatego istotne jest jego całkowite usunięcie przed etapem elucji. W tym celu po drugim etapie płukania można dodać etap wirowania na sucho. Po opróżnieniu probówki odbierającej, należy wirować suchą kolumnę przez 1 min przy tys. rpm (15 21 tys. x g). 17. Ostrożnie wyjąć suchą minikolumnę z probówki odbierającej i umieścić ją w jałowej probówce 1,5 ml typu Eendorf. 18. Nanieść μl Elution Buffer podgrzanego do temp. 70 C centralnie na złoże w minikolumnie. 19. Inkubować kolumnę z buforem przez 2 min. 20. Wirować 1 min przy tys. rpm (11 15 tys. x g). 21. Minikolumnę usunąć, a wyizolowane DNA przechowywać w temp. +4 C lub -20 C do czasu dalszych analiz.

10 XII. MOŻLIWE PROBLEMY I ICH ROZWIĄZYWANIE Problem Prawdopodobna przyczyna Rozwiązanie Złoże minikolumny zapycha się. Niska wydajność izolacji DNA. Wyizolowane DNA jest niskiej czystości. W próbce wymazu znajdują się resztki pokarmów. Nieprawidłowo wykonany wymaz. Wymaz pobrany z miejsca o małej liczbie złuszczających się komórek. Materiał pobrany od oligospermicznego mężczyzny. Niecałkowita liza komórek. Niecałkowita elucja DNA. Niewłaściwe ph buforu elucyjnego lub wody (ph <7,0). Niecałkowite wysuszenie kolumny z resztek buforu płuczącego. Pobrany wymaz jest bardzo niskiej czystości. Niecałkowita degradacja białek w związku z obniżoną aktywnością proteinazy K. Pominięto jeden z dwóch etapów płukania. Niecałkowite wysuszenie minikolumny z resztek buforu płuczącego. Należy powtórzyć izolację, zwracając szczególną uwagę, aby osoba, od której zostanie pobrany wymaz z jamy ustnej nie spożywała pokarmów przez co najmniej 30 min (patrz sekcja IXB. Przygotowanie próbki). Podczas pobierania materiału upewnić się, że pałeczka wymazowa mocno trze o nabłonek (patrz sekcja IXB. Przygotowanie próbki). Do izolacji DNA z nasienia użyć większą objętość ejakulatu, zwiększając proporcjonalnie objętości poszczególnych roztworów (SSL Buffer, Proteinase K, DTT, SSB Buffer) oraz etanolu. Lizat nanosić na to samo złoże minikolumny partiami po 700 µl. Po każdorazowym naniesniu lizatu, kolumnę należy wirować 1 min przy tys. rpm (11 15 tys. x g) i odrzucić supernatant. Wydłużyć czas inkubacji w temp. 56 C, mieszając próbkę poprzez odwracanie probówki. Podgrzać Elution Buffer do temp. 80 C. Nanieść centralnie na powierzchnię złoża. Wydłużyć czas inkubacji z Elution Buffer (nawet ponad 10 minut). Przeprowadzić powtórną elucję. Do elucji użyć Elution Buffer. Izolację należy powtórzyć, a po drugim płukaniu minikolumny należy przeprowadzić etap wirowania na sucho. Podczas drugiego etapu płukania (pkt. 16 Protokołu izolacji) nanieść 600 µl SSW2 Buffer, wirować 1 min przy tys. rpm (11 15 tys. x g), a następnie przeprowadzić etap wirowania na sucho. Upewnić się, że osoba, od której zostanie pobrany wymaz z jamy ustnej nie spożywała pokarmów i płynów przez co najmniej 30 min. Sporządzić świeży roztwór proteinazy K. Należy upewnić się, że roztwór proteinazy K jest przechowywany w temp. -20 C. Izolację należy powtórzyć, pamiętając o obu etapach płukania. Izolację należy powtórzyć, a po drugim płukaniu minikolumny należy przeprowadzić etap wirowania na sucho.

11 Nr kat. EM06 Wyizolowane DNA jest podegradowane. Obecność RNA wyizolowanym DNA. Niewłaściwe przechowywanie materiału. Kolumna związała zarówno DNA, jak i RNA. Zalecane jest przechowywanie wymazów i próbek nasienia w temp. -80 C. Należy unikać częstego rozmrażania i zamrażania próbek. Jeśli obecność RNA przeszkadza w dalszych aplikacjach przeprowadzić trawienie RNA przy użyciu RNazy A (patrz sekcja VIII. Szczególne zalecenia i uwagi). XIII. BEZPIECZEŃSTWO I POSTĘPOWANIE Z PRODUKTEM SSB, SSW1 BUFFERS Niebezpieczeństwo H302, H315, H318, H319, H411, P273, P280, P305+P351+P338 Proteinase K Niebezpieczeństwo H315, H319, H334, H335, P261, P305+P351+P338, P342+P311 DTT Uwaga H302, H315, H319, H335, P261, P305+P351+P338 SSW2 BUFFER Niebezpieczeństwo H225, H319, H336, P210, P261, P305+P351+P338 H225 Wysoce łatwopalna ciecz i pary. H302 Działa szkodliwie po połknięciu. H225 H225 Wysoce łatwopalna ciecz i pary. H302 Działa szkodliwie po połknięciu. H315 Działa drażniąco na skórę. H318 Powoduje poważne uszkodzenie oczu. H319 Działa drażniąco na oczy. H334 Może powodować objawy alergii lub astmy lub trudności w oddychaniu w następstwie wdychania. H335 Może powodować podrażnienie dróg oddechowych. H336 Może wywoływać uczucie senności lub zawroty głowy. H411 Działa toksycznie na organizmy wodne, powodując długotrwałe skutki. P210 Przechowywać z dala od źródeł ciepła/ iskrzenia/ otwartego ognia/ gorących powierzchni. Palenie wzbronione. P261 Unikać wdychania pyłu/ dymu/ gazu/ mgły/ par/ rozpylonej cieczy. P273 Unikać uwolnienia do środowiska. P280 Stosować rękawice ochronne/ odzież ochronną/ ochronę oczu /ochronę twarzy. P305 + P351 + P338 W PRZYPADKU DOSTANIA SIĘ DO OCZU: Ostrożnie płukać wodą przez kilka minut. Wyjąć soczewki kontaktowe, jeżeli są i można je łatwo usunąć. Nadal płukać. P342 + P311 W przypadku wystąpienia objawów ze strony układu oddechowego: Skontaktować się z OŚRODKIEM ZATRUĆ lub z lekarzem.

12 BLIRT S.A., ul. Trzy Lipy 3/1.38, Gdańsk, T: F: E: