Endokrynologia Pediatryczna Pediatric Endocrinology

Vol. 7/2008 Nr 2(23) Endokrynologia Pediatryczna Pediatric Endocrinology Wykorzystanie hodowli komórkowych do analizy ekspresji HLA-DR+ na powierzchni komórek pęcherzykowych tarczycy metodą cytometrii przepływowej Ampliffication of Cellular Culture to the Analysis of the HLA-DR+ Expression on Thyroid Follicular Cells Using Flow Cytometry 1 Marcin Skrzydło, 2 Artur Bossowski, 3 Elżbieta Iłendo, 4 Radosław Jaworowski, 5 Anna Stasiak-Barmuta, 2 Mirosława Urban, 6 Anna Moniuszko, 3 Barbara Jaworowska, 7 Jacek Dadan, 8 Marek Niedziela, 2 Beata Sawicka, 9 Przemysław Pawłowski. 1 Klinika Okulistyki Szpitala Klinicznego w Aue, Niemcy; 2 II Klinika Chorób Dzieci Uniwersytetu Medycznego w Białymstoku; 3 Zakład Cytogenetyki SP Dziecięcego Szpitala Klinicznego w Białymstoku; 4 I Oddział Chirurgii Ogólnej Szpitala MSW i A w Białymstoku; 5 Zakład Alergologii Dziecięcej UM w Białymstoku; 6 Klinika Chorób Zakaźnych i Neuroinfekcji UM w Białymstoku; 7 I Klinika Chirurgii Ogólnej i Endokrynologicznej UM w Białymstoku; 8 Katedra Pediatrii, Klinika Endokrynologii i Diabetologii Wieku Rozwojowego UM w Poznaniu; 9 Klinika Okulistyki UM w Białymstoku Adres do korespondencji: dr hab. n med. Artur Bossowski. II Kl. Ch. Dz. UM. w Białymstoku, ul. Waszyngtona 17,15-274 Białystok, tel.: (085) 745-07-28, fax.: (085) 745-07-30; e-mail:abossowski@hotmail.com Słowa kluczowe: tyreocyty, hodowle komórkowe, choroba Gravesa-Basedowa, HLA-DR Key words: thyrocytes, cellular culture, Graves-Basedow disease, HLA-DR STRESZCZENIE/ABSTRACT Wstęp: Ważne znaczenie w patogenezie schorzeń immunologicznych tarczycy mają wzajemne interakcje zachodzące pomiędzy napływającymi do gruczołu tarczowego limfocytami T i monocytami a powierzchniowymi markerami aktywności tyreocytów. Taką rolę odgrywają molekuły ICAM-1 a także HLA-DR, których wzrost ekspresji wskazuje na stymulację i aktywację komórek pęcherzykowych tarczycy. Celem pracy była ocena ekspresji HLA-DR w tkance gruczołu tarczowego u 15 pacjentów z chorobą Gravesa-Basedowa (GB) oraz 15 pacjentów z wolem guzkowym nietoksycznym (NTNG) w trakcie trwania hodowli komórkowej z zastosowaniem i bez stymulatorów komórkowych. Materiał i metody. Kryteria kwalifikacji pacjentów z choroba GB: wole II º, obecność oftalmopatii, TRAb > 5, dodatnie miana przeciwciał anty-tpo i anty-tg oraz utrzymujące się ponad 3 msc od początku rozpoznania TSH <0.3. Badany materiał tkankowy tarczycy oczyszczono i rozdrobniono mechanicznie a następnie inkubowano w roztworze kolagenazy z HBSS. Tak uzyskaną zawiesinę komórek przepuszczono przez filtr nylonowy. Hodowlę komórek tarczycy prowadzono w 50 ml flakonach w podłożu hodowlanym zawierającym: RPMI 1640, 10% FBS, HEPES buffer, L-glutaminę, penicylinę i streptomycynę. Po wyizolowaniu tyreocytów (3x10 5 ) hodowlę prowadzono w 6-dołkowych płytkach przez okres 5 dni. Do hodowli dodawano odpowiednio IL-1β, INF-γ, TNF-α oraz PHA. Identyfikację markerów HLA-DR na tyreocytach przy użyciu cytometru przepływowego Coulter XP wykonano 9

Praca oryginalna Endokrynol. Ped., 7/2008;2(23):9-16 w trakcie hodowli przed i po zastosowaniu stymulatorów komórkowych. Wyniki. Identyfikacja markerów HLA- DR wykazała znamienną ich ekspresję w komórkach tarczycy u pacjentów z chorobą GB (41%) w porównaniu z NTNG (13%). W trakcie hodowli wartości odsetkowe komórek z HLA-DR zmniejszyły się odpowiednio (33% w GB i 2% w NTNG). Zastosowanie natomiast stymulatorów doprowadziło do wzrostu ekspresji HLA-DR w grupie z chorobą Gravesa-Basedowa. Wnioski. Podsumowując można stwierdzić, iż zmiany ekspresji HLA-DR w komórkach pęcherzykowych tarczycy wskazują na różny stopień aktywacji i stymulacji komórkowej w trakcie rozwoju procesu chorobowego w gruczole tarczowym. Endokrynol. Ped., 7/2008; 2(23):9-16. Introduction: Interactions between ingoing to the gland lymphocytes T and monocytes and the surface markers of the thyrocytes activity play an important role in the pathogenesis of immune thyroid disorders. Such a role is played by molecules ICAM-1 and HLA-DR, whose height expression indicates the stimulation and activation of thyroid follicular cells. The aim of the study was to detect the expression of HLA-DR in the thyroid tissue in 15 patients with Graves disease (GD) and 15 with non-toxic nodular goiter (NTNG) during the cellular culture with or without cellular stimulators. Patients and methods. Criteria for qualification of Graves patients: large goitre, ophthalmopaty, TRAb > 5, positive titre of anti-tpo and anti-tg antibodies and concentration of TSH <0.3 more the 2-3 months from the onset of disease. The investigated thyroid tissue was cleaned and then mechanically partitioned, and enzymatic fragmentation using collagenase with HBSS was performed. Such an obtained suspension of cells was passed through the nylon- filter. The culture of thyroid cells managed into 50 mls phials in the basis of cultivation containing: RPMI 1640, 10% FBS, HEPES buffer, L-the glutamine, the penicillin and the streptomycin. After the isolation of thyrocytes (3x10 5 ) the culture was managed into 6-pit plates through the period of 5 days. IL-1β, INF-γ, TNF-α and PHA were added to the culture. The identification of HLA-DR markers on thyrocytes, before and after the use of cellular stimulators, was performed using flow cytometry on apparatus Coulter XP. Results. The analysis of HLA-DR marker expression on thyrocytes showed their elevation in patients with GD (41%) in comparison to patients with NTNG (13%). During the cellular culture percentage of cells with HLA-DR, the expression significantly decreased (33% in GD and 2% in NTNG, respectively). Application of cellular stimulators led to the height of the expression HLA- DR in Graves patients. Conclusion. In conclusion, changes of the expression of HLA-DR molecule on the thyroid follicular cells suggest the different degree of the activation and stimulation of the cells during the development of the pathological process within thyroid gland. Pediatr. Endocrinol., 7/2008; 2(23):9-16. Wstęp Choroby autoimmunologiczne tarczycy: choroba Gravesa-Basedowa (GB) i zapalenie tarczycy typu Hashimoto charakteryzują się reaktywnością na własne antygeny, co może wywołać destrukcyjny proces zapalny lub całkowite uszkodzenie gruczołu. Zrozumienie czynników, które wpływają na rozpoznanie autoantygenów tarczycy przez limfocytów T jest konieczne do zrozumienia patogenezy chorób autoimmunologicznych. Przypuszcza się, że głównym mechanizmem patogenetycznym jest prezentacja przez komórki tarczycy ich antygenów reaktywnym limfocytom T. Nacieczenie tarczycy jest wynikiem interakcji zachodzących pomiędzy receptorami na komórkach immunokompetentnych, a cząsteczkami adhezyjnymi na leukocyty, komórkach środbłonka i tyreocytach. [1] Choroba Gravesa-Basedowa jest związana z napływem limfocytów do tarczycy, nasiloną ekspresją receptorów przeciwko TSH, tyreoglobulinie oraz przeciwciał przeciwko peroksydazie. Śródbłonek naczyń tarczycy odgrywa istotną rolą w procesie immunizacji, a poza tym jest źródłem cytokin i cząsteczek adhezyjnych. Nasilona ekspresja tych cząsteczek związana jest z kierowaniem limfocytów do ich miejsc docelowych. Główną rolę w patogenezie choroby Gravesa-Basedowa przypisuje się cząsteczkom adhezyjnym: ICAM i VCAM oraz integrynom LFA-1 i VLA-4, odpowiedzialnym za rozwój procesu zapalnego. [2] Choroby autoimmunologiczne tarczycy wywoływane są wskutek reakcji pomiędzy czynnikami genetycznymi a środowiskowymi. Wykazano rodzinne występowanie chorób tarczycy z wyższą zapadalnością wśród płci żeńskiej oraz wśród bliźniąt monozygotycznych. Badania rodzin pacjentów z chorobą Gravesa-Basedowa wykazały związek pomiędzy obrazem klinicznym choroby a układem genów dla HLA. Rola odgrywana przez polimorficzne geny dla HLA-DR oraz HLA-DQ była badana na modelu zwierzęcym myszy z zapaleniem tarczycy. [3] Wykazano, że istotne znaczenie w patogenezie schorzeń immunologicznych tarczycy mają wzajemne interakcje zachodzące pomiędzy napływającymi do gruczołu tarczowego limfocytami T i monocytami a powierzchniowymi markerami aktywności tyreocytów. Taką rolę odgrywają molekuły ICAM-1 a także HLA-DR, których wzrost ekspresji wskazuje na stymulację i aktywację komórek 10

Skrzydło M. i inni Wykorzystanie hodowli komórkowych do analizy ekspresji HLA-DR+ na powierzchni komórek pęcherzykowych tarczycy pęcherzykowych tarczycy. Ekspresja antygenów HLA-DR klasy II kompleksu antygenów zgodności tkankowej wyrażona jest na limfocytach T, limfocytach B, monocytach i makrofagach. Antygeny HLA-DR na powierzchni tych komórek odgrywają istotną rolę w odpowiedzi immunologicznej. Początek odpowiedzi immunologicznej wymaga interakcji pomiędzy komórkami prezentującymi antygen a limfocytami T. W niektórych warunkach antygen HLA-DR mogą ulegać ekspresji na komórkach śródbłonka. [4] Hanafusa i wsp. wykazali ekspresje genów HLA-DR na powierzchni tyreocytów pacjentów z chorobami autoimmunologicznymi tarczycy. [5] Wykazano także, że interferon-γ produkowany przez aktywne limfocyty T ma zdolność indukcji ekspresji antygenów HLA-DR na powierzchni monocytów i makrofagów. [6] Matsunaga i wsp. wykazali nasiloną ekspresję antygenów HLA-DR na powierzchni tyreocytów u pacjentów z chorobą Gravesa-Basedowa. Stopień ekspresji HLA-DR na powierzchni wewnątrztarczycowych limfocytów T był wyższy niż na limfocytach T we krwi obwodowej, a proliferacja autologicznych komórek T zachodziła zarówno w tyreocytach, jak i w surowicy krwi. [4] Produkty genów dla MHC klasy II na powierzchni monocytów i makrofagów są niezbędne do prezentacji antygenu limfocytom T. Tyreocyty poddawane działaniu produktów tych genów oddziałują jako komórki prezentujące antygen. [5] Interferon-γ produkowany przez aktywne limfocyty T bierze udział w regulacji istotnych funkcji limfocytów. Reguluje ekspresje antygenów MHC klasy II. Wykazano, że interferon-γ indukuje aktywność antygenów MHC klasy II na monocytach i makrofagach, limfocytach B, komórkach tucznych, keratynocytach oraz komórkach środbłonka. [4] Belfore i wsp. wykazali ze interferon-γ wywołuje ekspresje antygenów MHC klasy II na zdrowych tyreocytach. [7] Z kolei Matsunaga i wsp. wykazali rolę interferonu-γ w indukowaniu ekspresji antygenowo MHC klasy II na powierzchni tyreocytów pacjentów z chorobą Gravesa-Basedowa. [4] Cel pracy Celem pracy była ocena ekspresji HLA-DR w tkance gruczołu tarczowego u pacjentów z chorobą Gravesa-Basedowa (GB) oraz pacjentów z wolem wieloguzkowym nietoksycznym (NTNG) w trakcie trwania hodowli komórkowej z zastosowaniem i bez zastosowania stymulatorów komórkowych. Materiał i metody Badanie przeprowadzono w grupie pacjentów z chorobą Gravesa-Basedowa (n = 15, średni wiek 17.1±4.3 lat) oraz pacjentów z wolem wieloguzkowym nietoksycznym (n = 15, średni wiek 16.0±5.2 lat), hospitalizowanych w Poradni Endokrynologicznej przy II Klinice Chorób Dzieci, Klinice Chirurgii Ogólnej i Endokrynologicznej Uniwersytetu Medycznego w Białymstoku oraz Klinice Endokrynologii i Diabetologii Wieku Rozwojowego Uniwersytetu Medycznego w Poznaniu. Pacjenci byli poddani totalnej lub subtotalnej tyreoidektomii w Klinice Chirurgii Ogólneji Endokrynologicznej Uniwersytetu Medycznego w Białymstoku oraz Klinice Chirurgii Dziecięcej Uniwersytetu Medycznego w Poznaniu. Rozpoznanie postawiono na podstawie obrazu klinicznego, badań laboratoryjnych, ultrasonograficznych gruczołu tarczowego i biopsji aspiracyjnej cienkoigłowej (FNAB). Pacjentów z nadczynnością tarczycy leczono metizolem w dawce początkowej 0,5-1 mg/ kg m.c./dobę w połączeniu z propranololem (0,5-1 mg/kg m.c./dobę). Dawki leków redukowano (do 5-10 mg/dobę) w zależności od parametrów biochemicznych i klinicznych celem doprowadzenia do stanu eutyreozy przed zabiegiem operacyjnym. Pacjenci z wolem wieloguzkowym otrzymywali L-tyroksynę w dawce 25-75 μg/dobę przez okres 3-12 miesięcy po postawieniu diagnozy. Pacjentów z chorobą Gravesa Basedowa kwalifikowano do badań na podstawie następujących kryteriów: obecność wola IIº, oftalmopatii, TRAb > 5, dodatnich mian przeciwciał anty-tpo i anty-tg oraz utrzymujących się ponad 3 miesiące od początku rozpoznania stężeń TSH <0.3. Protokół badań został zatwierdzony przez Komisję Etyczną do spraw badań naukowych przy Uniwersytecie Medycznym w Białymstoku. Krew do badań pobierano na czczo w godzinach rannych z żyły odłokciowej. Odwirowywano w wirówce przez 10 minut przy 2000 obrotów na minutę. Do chwili zebrania odpowiedniej ilości surowic do oznaczeń, przechowywano je w temperaturze -85ºC. W badanych surowicach oznaczano przeciwciała przeciwreceptorowe (TRAb) metodą radioreceptorową z użyciem zestawów TRAK human (Brahms Diagnostica GmbH, Berlin, Germany), w których wartość < 1 U/l była traktowana jako negatywna, 1.0-1.5 jako wątpliwa i >1,5 jako pozytywna. Ocenę stężeń przeciwciał p/peroksydazie (anty-tpo) i p/tyreoglobulinie (anty-tg) przepro- 11

Praca oryginalna Endokrynol. Ped., 7/2008;2(23):9-16 wadzono testem immunoenzymatycznym Varelisa (Variable Enzyme Linker Imano Sorbent Assay, Pharmacia Upjohn Diagnostics GmbH Co.KG. Freiburg, Germany). Za wartość prawidłową stężenia przeciwciał anty-tg i anty- uznano <50 IU/ml. Stężenia hormonów tarczycy oraz TSH w surowicy krwi były oznaczane w mini analizatorze firmy Bio Merieux, France na bazie testu VIDAS (Bio Merieux, France), w połączeniu metody immunoenzymatycznej z fluoroscencyjną. Wartości prawidłowe: ft4-0,71-1,55 ng/dl, ft3-2,6-5,4 ng/dl, htsh-0,32-5 μiu/ml. Badany materiał tkankowy tarczycy oczyszczono i rozdrobniono mechanicznie, a następnie inkubowano w roztworze kolagenazy (Sigma Chemical Co.) z Hanks balanced salt solution (HBSS). Tak uzyskaną zawiesinę komórek przepuszczono przez filtr nylonowy (ryc. 1a). Hodowlę komórek tarczycy prowadzono w 50 ml flakonach w podłożu hodowlanym zawierającym: RPMI 1640, 10% FBS, HEPES buffer, L-glutaminę, penicylinę i streptomycynę. Wyizolowane tyreocyty w ilości 3 x 10 5 hodowano na 6-dołkowych płytkach przez okres 5 dni w temperaturze 37ºC w atmosferze z zawartością 5-95% CO2. Do hodowli dodawano odpowiednio IL-1β, INF-γ, TNF-α oraz PHA (ryc.1b). Identyfikację markerów HLA-DR na tyreocytach przy użyciu cytometru przepływowego Coulter XP wykonano w trakcie hodowli przed i po zastosowaniu stymulatorów komórkowych. Równolegle prowadzone hodowlę bez dodatku stymulatorów jako kontrolę negatywną. a) zawiesina komórek pęcherzykowych tarczycy w podłożu RPMI 1640 b) komórki pęcherzykowe tarczycy po 5 dniach hodowli z zastosowaniem stymulatorów komórkowych Ryc. 1. Przedstawia hodowle komórek tarczycy po izolacji w podłożu RPMI-1640 (a) oraz po 5 dniach stymulacji w środowisku cytokin (b) Analiza statystyczna Otrzymane wyniki poddano analizie statystycznej, wyznaczając dla każdego parametru wartość średnią i odchylenie standardowe. Istotność różnic pomiędzy wartościami średnimi stwierdzono za pomocą testu t - Studenta potwierdzając testem U. Manna-Whitney- a. Za istotną statystycznie uznano wartość t dla której wartość p była mniejsza od 0,05. Do oceny siły współzależności pomiędzy kolejnymi parametrami zastosowano współczynniki korelacji liniowej Persona i Spearmana. Obliczenia matematyczno-statystyczne wykonano w oparciu o program Statistica 6,0 Wyniki W tabeli 1 przedstawiono charakterystykę badanych grup oraz wyniki badań laboratoryjnych pacjentów z chorobą Gravesa-Basedowa i wolem wieloguzkowym nietoksycznym. Pacjenci ze zmianami guzkowymi powyżej 1 cm w badaniu ultrasonograficznym zostali poddani biopsji aspiracyjnej cienkoigłowej, której wyniki wykazały niezłośliwe zmiany w gruczole tarczowym. Identyfikacja markerów HLA-DR wykazała znamienną ich ekspresję w komórkach tarczycy u pacjentów z chorobą Gravesa-Basedowa -41%, w porównaniu z wolem wieloguzkowym nietoksycznym -13% (p<0,001). W trakcie hodowli wartości odsetkowe komórek z ekspresją HLA-DR zmniejszyły się odpowiednio do 33% w chorobie Gravesa- Basedowa i 2% w wolu guzkowym nietoksycznym (p<0,0025) (ryc. 2). Zastosowanie z kolei czynników stymulacyjnych komórek w postaci IL-1, IL-6, TNF-α oraz PHA doprowadziło do wzrostu ekspresji 12

Skrzydło M. i inni Wykorzystanie hodowli komórkowych do analizy ekspresji HLA-DR+ na powierzchni komórek pęcherzykowych tarczycy Tabela I. Charakterystyka badanych grup pacjentów Table I. Characteristics of the examined groups of patients Grupa z chorobą Gravesa- Basedowa Grupa z wolem wieloguzkowym nietoksycznym Wiek (lata) 17.1±4.3 16.0±5.2 NS n 15 15 Waga (kg) 59±7 63±8 NS Wzrost(cm) 1.75 1.76 NS BSA (m²) 1.68 1.7 NS anty-tpo (IU/ml) anty-tg (IU/ml) 650±250 55±15 p<0.025 360±40 20±5 p<0,006 TRAb (U/l) (+) (-) ft4 (ng/dl) 2,04±0,3 1,29±0,2 NS ft3 (ng/l) 3,8±0,5 2,94±0,21 NS Ryc. 2. Ekspresja HLA-DR po izolacji tyreocytów oraz po 5 dniach hodowli (in vitro) HLA-DR u pacjentów z chorobą Gravesa-Basedowa po PHA i TNF-α do wartości 57%, natomiast po IL-1β i INF-γ do wartości 63% (ryc. 3). Ryc. 3 Ekspresja HLA-DR na powierzchni tyreocytów w badanych grupach W grupie z wolem wieloguzkowym nietoksycznym nie obserwowano istotnie statystycznego wzrostu ekspresji HLA-DR na powierzchni komórek pęcherzykowych tarczycy. W obu badanych grupach nie wykazano znamiennych statystycznie zależności pomiędzy stężeniem przeciwciał przeciwtarczycowych i hormonów tarczycy, a odsetkiem tyreocytów z ekspresją HLA-DR po izolacji i hodowli komórkowej oraz zastosowaniu stymulacji. Dyskusja Komórki pęcherzykowe tarczycy w warunkach fizjologicznych syntetyzują i nasilają ekspresję cząsteczek HLA klasy I. W tarczycy zmienionej poprzez autoimmunologiczny proces zapalny lub choroby nowotworowe dochodzi do nasilonej ekspresji cząsteczek HLA klasy II. Do pomiaru ekspresji tych cząsteczek wykorzystuje się metody bezpośredniej immunofluorescencji, cytometrii przepływowej oraz hybrydyzacji blotting. Bezpośrednia fluorescencja i cytometria przepływowa była używana do wykrywania i oceniania stopnia nasilania ekspresji subregionów dla HLA-DR, DP i DQ. Wykazano skoordynowaną ekspresję tych antygenów u pacjentów z chorobami autoimmunologicznymi tarczycy. Ekspresja HLA-DR była wyrażona najsilniej, a HLA-DQ najsłabiej. Przypuszcza się, że linie komórkowe tyreocytów mogą być przydatnym narzędziem badań regulacji genów w tyreocytach i poznania mechanizmów wywołujących zaburzenia ekspresji HLA opisywane w chorobach autoimmunologicznych i nowotworowych tarczycy. [7] Cząsteczki MHC klasy II są przezbłonowymi glikoproteinami mającymi zdolność do prezentacji peptydowych antygenów limfocytom CD 4+ i inicjacji specyficznej odpowiedzi immunologicznej. Znajdują się one na wyspecjalizowanych komórkach zdolnych do prezentacji antygenu takich jak limfocyty T, komórki dendrytyczne, makrofagi. Ponadto do ich ekspresji może dochodzić na powierzchni komórek śródbłonka, fibroblastów oraz tyreocytów, co czyni te komórki zdolnymi do prezentacji antygenu. [8] Ekspresja genów kodujących cząsteczki MHC klasy II jest ściśle kontrolowana przez elementy DNA cis-regulatorowego. Główne elementy odpowiedzialne za kodowanie tych cząsteczek zostały sklasyfikowane w trzech grupach: S (W,Z lub H), X (podzielone X1, X2) oraz Y. Oddziaływają one jako elementy docelowe dla specyficznych białek wiążących przez co regulują trans- 13

Praca oryginalna Endokrynol. Ped., 7/2008;2(23):9-16 krypcję genów odpowiedzialnych za kodowanie cząsteczek MHC klasy II. [9] Wu Z. i wsp wykazali że interferon-γ nasila funkcję promotora w grupie Y dla białek wiążących i indukuje funkcję w grupie X na tyreocytach. Wstępna charakterystyka białek wykazała, że grupa Y osiąga rozmiary 132 kda a grupa X - 116 kda. Wykazano również, że X może być związany z rolą polimerazy, a przewodzenie sygnału i aktywacja transkrypcji białka 1α (STAT1α) jest indukowana przez interferon-γ. Wyniki te mogą sugerować występowanie różnic w regulacji genów kodujących markery MHC klasy II. [10] Ekspresja markerów MHC klasy II była badana w wielu chorobach autoimmunologicznych np. cukrzycy typu I, zapalnych chorobach jelit oraz chorobach nieautoimmunologicznych, takich jak przeszczep przeciw gospodarzowi oraz nadwrażliwość kontaktowa skóry. Także w chorobach autoimmunologicznych tarczycy stwierdzono nasilenie ekspresji markerów HLA-DR. W przeprowadzonych badaniach własnych identyfikacja markerów HLA- DR wykazała znamienną ich ekspresję w komórkach tarczycy u pacjentów z chorobą Gravesa-Basedowa - 41%, w porównaniu z wolem guzkowym nietoksycznym -13%. W trakcie hodowli wartości odsetkowe komórek z HLA-DR zmniejszyły się odpowiednio - 33% w GB i 2% w NTNG. Podobnym zagadnieniem zajmowali się Zhang H i wsp., którzy analizowali liczbę i dystrybucję HLA-DR dodatnich tyreocytów w gruczołach 16 pacjentów z chorobą Hashimoto, 14 pacjentów z chorobą Gravesa-Basedowa i 6 zdrowych ochotników. Nie wykazano ekspresji antygenów HLA-DR w grupie kontrolnej. Natomiast antygeny HLA-DR znajdowano w tyreocytach pacjentów ze zmienioną chorobowo tarczycą. Liczba dodatnich HLA-DR tyreocytów była istotnie większa w grupie pacjentów z chorobą Hashimoto w porównaniu do pacjentów z chorobą Gravesa-Basedowa. Komórki z nasiloną ekspresją HLA-DR były zlokalizowane w miejscach objętych naciekiem limfocytów. Stopień ekspresji HLA-DR korelował dodatnio z mianem przeciwciał przeciwko tyreoglobulinie oraz przeciwko peroksydazie zarówno u chorych na Hashimoto, jak i w chorobie Gravesa-Basedowa. Autorzy przypuszczają, że infiltracja limfocytów może przyczyniać się do nasilonej ekspresji HLA-DR na tyreocytach. Sugerują również, iż pojawienie się przeciwciał przeciwko tyreoglobulinie oraz przeciwko peroksydazie może mieć ścisły związek z zaburzona ekspresją HLA-DR, które mają być zniszczone przez proces autoimmunologiczny. [11] Aguayo i wsp. wykazali nasiloną ekspresję HLA-DR na tyreocytach chorych z zapaleniem tarczycy typu Hashimoto i Gravesa-Basedowa. Na zdrowych tyreocytach i komórkach zmienionych nowotworowo, ekspresja HLA-DR była nieznacznie nasilona. Sugeruje to, że w przypadku wola guzkowego tarczycy i raka brodawkowatego, z uwagi na nieimmunologiczne podłoże zmian, nie obserwuje się nasilonej ekspresji HLA-DR. Podkreśla to jeszcze raz fakt, że ekspresja HLA-DR jest wynikiem wpływu limfocytów T uprzednio uwrażliwionych na antygeny tarczycy. [12] Volpe i wsp. zauważyli, że zdrowe tyreocyty stymulowane różnymi bodźcami, w takim samym stopniu stymulują ekspresję HLA-DR. W badaniach własnych wykazano, że zastosowanie stymulatorów, takich jak IL-1β, INF-γ, TNF-α oraz PHA doprowadziło do znamiennego wzrostu ekspresji HLA-DR tylko w grupie z chorobą Gravesa-Basedowa, przy nieistotnym statystycznie jego wzroście w wolu wieloguzkowym nietksycznym. Zawiesina limfocytów T uzyskana z gruczołów tarczowych wykazuje zwiększoną ekspresję HLA- DR u pacjentów z chorobą Gravesa-Basedowa stymulowanych poprzez lektynę. Wykazono, że pobudzenie ekspresji HLA-DR u pacjentów z chorobą Gravesa-Basedowa jest bardziej nasilone w przypadku, gdy reakcje zachodzące pomiędzy limfocytami a tyreocytami są bezpośrednie. Stwierdzono, że monocyty i limfocyty pomocnicze T, są niezbędne do indukcji ekspresji HLA-DR. Autorzy wnioskują, że ekspresja HLA-DR jest zjawiskiem wtórnym w stosunku do pierwotnej odpowiedzi immunologicznej. [13] Na ekspresję cząsteczek HLA-DR u pacjentów z chorobą Gravesa-Basedowa wpływ wywierają leki przeciwtarczycowe. Ograniczają one nadprodukcję hormonów tarczycy. Prawdopodobnie wywierają także wpływ immunosupresyjny poprzez redukcję krążących immunoglobulin stymulujących funkcje tarczycy. Atwa i wsp analizowali wpływ TSH-metizolu i hormonów tarczycy na ekspresję MHC klasy II na tyreocytach. Sugerują oni, że metizol w stężeniu 0,03-0,3 mmol/l nie hamuje ekspresji HLA-DR indukowanej przez interferon-γ. [14] Aguayo i wsp. wykazali znaczną redukcję ekspresji HLA-DR tylko przy stężeniu metizolu powyżej 3 mmol/l. Efekt ten był blokowany przez T3 lub T4, prawdopodobnie w skutek inhibicji syntezy hormonów tarczycy przez metizol [15]. Zantut-Wittmann i wsp. analizowali ekspresje HLA-DR w tyreocytach pacjentów z chorobą Gravesa-Basedowa w 14

Skrzydło M. i inni Wykorzystanie hodowli komórkowych do analizy ekspresji HLA-DR+ na powierzchni komórek pęcherzykowych tarczycy momencie, gdy stężenie hormonów było wysokie, a leczenie zostało wprowadzone przynajmniej 6 miesięcy wcześniej. Nasiloną ekspresję HLA-DR obserwowano u pacjentów z tyreotoksykozą w czasie pierwszych 2 miesięcy leczenia. Tłumaczy się to faktem, że w aktywnej fazie choroby komórki pęcherzykowe mają zdolność do prezentacji antygenu. Zauważono ponadto, że ekspresja HLA-DR była nasilona na błonie komórkowej. Pacjenci w stanie eutyreozy po ustabilizowanym leczeniu, nie wykazywali ekspresja HLA-DR. Wynikało to z normalizacji funkcji tyreocytów. Nie obserwowano także ekspresji HLA-DR w grupie pacjentów przyjmujących leki przeciwtarczycowe (metizol i propylotiouracyl). Autorzy sugerują, iż wprowadzone leczenie pozbawia komórki pęcherzykowe funkcji prezentacji antygenu. Ponadto wnioskują, że wprowadzenie leków przeciwtarczycowych na okres 6 miesięcy hamuje ekspresję HLA-DR. Możliwe jest także, iż ekspresja HLA-DR jest hamowana z powodu braku sprzężenia przysadka-tarczyca. Autorzy sugerują hipotezę, że ekspresja HLA-DR na komórkach pęcherzykowych tarczycy jest wtórnym zjawiskiem odpowiadającym za cechy autoimmunologiczne tarczycy, a inne czynniki immunologiczne mogą odgrywać istotną rolę w zmienności aktywności procesu chorobowego u pacjentów z chorobą Gravesa-Basedowa. [16] Wnioski 1. Zmiany ekspresji HLA-DR na komórkach pęcherzykowych tarczycy wskazują na różny stopień aktywacji i stymulacji komórkowej w trakcie rozwoju procesu chorobowego w gruczole tarczowym. 2. Zastosowanie stymulatorów komórkowych w podłożu hodowlanym zwiększa aktywność immunologiczną komórek tarczycy w chorobie Gravesa-Basedowa. 3. Najsilniejszymi stymulatorami ekspresji HLA-DR na tyreocytach są IL-1β oraz INF-γ. PIŚMIENNICTWO/REFERENCES [1] Marazuela M., De Landazuri M. O., Larranaga E., Sanchez-Madrid F.: Up-regulated beta1-integrin expression in autoimmune thyroid disorders. Clin Exp Immunol. 1997; 109(1): 107-15. [2] Urban M., Bossowski A.: Cytokins and adhesion molecules in Graves s disease. Endokrynol Diabetol Chor Przemiany Materii Wieku Rozw. 2000; 6(1): 15-9. [3] Gentile F., Conte M., Formisano S.: Thyroglobulin as an autoantigen: what can we learn about immunopathogenicity from the correlation of antigenic properties with protein structure? Immunology. 2004; 112 (1): 13-25. [4] Matsunaga M., Euguchi K., Fukuda T., Kurata A., Tezuka H., Shimomura C., Otsubo T., Ishikawa N., Ito K., Nagataki S.: Class II Major Histocompatibility Complex Antigen Expression and Cellular Interactions in Thyroid Glands of Graves Disease. Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 1986; 62, 723-728. [5] Hanafusa T., Chiovato L., Doniach D., Pujol-Borrell R., Rusell R. C. G., Bottazzo G. F.: Aberrant expression of HLA-DR antigen on thyrocytes in Graves disease: relevance for autoimmunity. Lancet 1983; 2: 1111. [6] Becker S.: Interferon as modulators of human monocyte-macrophage differentation. I. Interferon-γ increases HLA-DR expression and inhibits phagocytosis of zymosan. J Immunol. 1984; 132: 1249. [7] Belfiore A., Mauerhoff T., Pujol-Borrell R., Badenhoop K., Buscema M., Mirakian R., Bottazzo G. F.: De novo HLA class II and enhanced HLA class I molecule expression in SV40 transfected human thyroid epithelial cells. J. Autoimmun. 1991; 4(3): 397-414 [8] Glimcher L. H., Kara C. J.: Sequences and factors: a quide to MHC class II transcription. Annu. Rev. Immunol. 1992; 10:13. [9] Mach B., Stemle V., Martinez-Soria E., Reith W.: Regulation on MHC class II genes: lessons from a disease. Annu. Rev.Immunol. 1996; 14: 301. [10] Wu Z., Biro P. A., Mirakian R., Curcio F., Ambesi-Impiombato F. S., Bottazzo G. F.: Transcriptional regulation of the MHC II gene DR in untransformed human thyrocytes. Int Immunol. 2000; 12(4): 405-13. [11] Zhang H., Li D., Ouyang A.: An immunohistochemical study on human leucocyte antigen-dr in Hashimoto thyroiditis and Graves disease. Zhonghua Nei Ke Za Zhi. 1996; 35(5): 303-5. [12] Aguayo J., Perez M. V., Trincado P., Wohllk N., Pineda G.: Spontaneous expression of class II (HLA-DR) molecules in thyroid pathology. Rev Med Chil. 1991; 119(8): 867-70. [13] Volpe R.: Autoimmune thyroid disease a perspective. Mol Biol Med. 1986; 3(1): 25-51. [14] Atwa M. A., Lukes Y. D., Salata K., Abo-Hashem E. M., El-Kannishy M. H., Burman K. D: The influence of triiodothyronine, thyroxine, thyrotropin and methimazole on thyroid cell MHC class II antigen expression. Clin Immunol Immunopathol. 1995; 76:209-213. 15

Praca oryginalna Endokrynol. Ped., 7/2008;2(23):9-16 [15] Aguayo J., Inaka M., Row V. V., Volpe R.: Studies of HLA-DR expresion on cultured human thyrocytes: effect of antithyroid drugs and other agents on interferon gamma-induced HLA-DR expression. J Clin Endocrinol Metab. 1988; 66: 903-908. [16] Zantut-Wittmann D. E., Tambascia M. A., da Silva Trevisan M. A., Pinto G. A., Vassallo J.: Antithyroid Drugs Inhibit In Vivo HLA-DR Expression in Thyroid Follicular Cells in Graves` Disease. Thyroid Jun. 2001; 11(6): 575-80. 16