Kurs Neurogenetyka Warszawa IPiN, 30.11-04.12.2015. Interpretacja wyników badao molekularnych w chorobie Huntingtona. Wioletta Krysa Pracownia Molekularnych Podstaw Chorób Neurodegeneracyjnych Zakład Genetyki, IPiN
Choroba Huntingtona - najważniejsze fakty George Huntington - w 1872 r. artykuł On chorea w Medical and Surgical Reporter postępująca neurodegeneracyjna choroba o późnym początku monogenowy (gen HTT), autosomalny (4p16.3), dominujący wzór dziedziczenia częstość występowania 3-7 na 100.000 osób w populacji europejskiej
Podział objawów choroby Huntingtona Objawy fizyczne ruchy mimowolne, problemy z ruchami dowolnymi, zaburzenia chodu bradykinezja, dystonia, sztywność, dysfagia, dysartria Zaburzenia funkcji poznawczych demencja (otępienie podkorowe), spowolnienie myślenia i uczenia się Problemy emocjonalne i zmiany zachowania alienacja społeczna, depresja, apatia, rozhamowanie, urojenia, mania, zaburzenia schizofrenopodobne Neuropatologia w chorobie Huntingtona zaniki neuronów w obrębie jądra ogoniastego i zwojów podstawy (prążkowie)
Podłoże genetyczne choroby Huntingtona Czynnik etiologiczny: mutacja dynamiczna w obrębie genu HTT polegająca na zwielokrotnieniu mikrosatelitarnej sekwencji CAG poza zakres prawidłowy W zakresie chorobotwórczym charakteryzuje się większą niestabilnością w miarę wydłużania rejonu powtórzeń. Niestabilność w przekazywaniu następnym pokoleniom prowadzi do występowania w dziedziczeniu choroby zjawiska antycypacji.
frequency % Zakres prawidłowy liczby powtórzeń CAG w genie HTT w grupie kontrolnej z polskiej populacji 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 9 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 27 28 29 32 CAG repeats number
Rodzaje badań molekularnych w kierunku HD DIAGNOSTYCZNE wykonywane u osób z klinicznym rozpoznaniem HD PRZEDOBJAWOWE wykonywane na życzenie pełnoletnich osób z 50% jak i 25% ryzykiem zachorowania z rodziny, w której wcześniej potwierdzono HD na podstawie badań molekularnych PRENATALNE analiza DNA płodu jeżeli jedno z rodziców ma chorobotwórczy allel (poprzedzone analizą DNA matki i ojca) Badania dostępne poza IPiN PREIMPLANTACYJNE analiza DNA z komórek zarodka poprzedzająca jego transfer do macicy w procedurze zapłodnienia in-vitro
Diagnostyka molekularna w HD - PCR obszaru I eksonu przy użyciu starterów łączących się z sekwencjami flankującymi rejon powtórzeń (CAG) n - rozdział elektroforetyczny produktów PCR - ustalenie liczby powtórzeń (CAG) n Ekson 1 Ekson 67 HD1 [ CAG CAG CAG CAG CAG ] HD3 Gen HTT (CAG)n= wielkość produktu PCR (bp) - długość starterów HD1/HD3 (47 bp) 3
Uzupełniające badania molekularne w chorobie Huntingtona Ekson 1 Ekson 67 HD1 [ CAG CAG CAG CAG CAG ] HD3 HD1 [ CAG CAG CAG CAG CAG ] CAA CAG CCG CCA [CCG CCG CCG] 7-12 Hu3
Analiza liczby powtórzeń CAG w genie HTT metodami izotopowymi z wykorzystaniem znaczników fluorescencyjnych 17 / 17 15 / 20 Allele z zakresu patogennego 17 / 40 19 / 41 17 / 42 17 / 49 Alle z zakresu normy < 36 (CAG)n 22 / 38
Interpretacja wyników badań molekularnych w HD 9-26 (CAG) n - zakres prawidłowej liczby powtórzeń > 36 (CAG) n - patogenna ekspansja 27-39 (CAG) n - problematyczna interpretacja wyników allele pośrednie - zawierają 27-35 powtórzeń CAG, osoba z takim allelem może przekazać do następnego pokolenia gen ze zwiększoną, do zakresu patogennego, liczbą (CAG) n, ale nie jest zagrożona zachorowaniem na HD allele o niekompletnej penetracji - zawierają 36-39 (CAG) n wysokie ryzyko zachorowania na HD, wynik wymaga interpretacji w kontekście historii rodzinnej
RP-PCR (Repeat Primed PCR) METODA JAKOŚCIOWA CAGCAGCAG // CAGCAGCAG zmodyfikowana reakcja PCR trzy startery: HD1, P4GTC, P3R (10:1:10) potwierdzenie bądź wykluczenie ekspansji powtórzeń CAG w genie HTT 5 3 P4GTC 3 HD1 GTCGTCGTC// GTCGTCGTC P3R 3 5 5 P3R P3R P3R
RP-PCR dla HD - obraz rozdziału elektroforetycznego produktów
Zjawisko antycypacji genetycznej obserwowane w dziedziczeniu niektórych chorób genetycznie uwarunkowanych cechujące się wcześniejszym występowaniem objawów choroby i cięższym jej przebiegiem w kolejnych pokoleniach
Antycypacja odojcowska w HD * DNA * DNA II-1 II-2 II-3 II-4 II-5 43/14 41/17 * DNA * DNA * DNA * DNA * DNA * DNA III-1 III-2 III-3 III-4 III-5 III-6 III-7 III-13 44/24 24/17 47/16 77/16 17/15 43/23 49/28 * DNA IV-1 53/17
Antycypacja odmatczyna w HD I-1 I-2 * DNA II-1 II-2 II-3 II-4 62/15 * * III-1 III-2 III-3 III-4 III-5 65 / 17 85 / 17
Mutacja de novo jako wynik niestabilności (CAG)n w allelu pośrednim u ojca DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA
Charakterystyka molekularna postaci dziecięcej/młodzieńczej choroby Huntingtona (Juvenile HD) silnie zaznaczona odwrotna korelacja między liczbą powtórzeń CAG w genie HTT a wiekiem zachorowania postać młodzieńcza - wiek zachorowania poniżej 20 r.ż. - liczba powtórzeń sekwencji CAG powyżej 50
Negatywna korelacja między liczbą (CAG)n a ekspresją kliniczną w HD Wiek zachorowania CAG < 50 (r = - 0,56; p<0.000001) CAG > 50 (r = - 0,72; p<0.000001) 80 70 60 50 40 30 20 10 0 30 40 50 60 70 80 90 100 110 Liczba powt. CAG
EHDN Grupa Robocza GENETIC TESTING AND COUNSELLING GROUP jakość i standardy diagnostyki molekularnej procedury w poradnictwie genetycznym HD
Wymogi przedanalityczne badanie diagnostyczne Identyfikacja pacjenta (Zlecenie badania laboratoryjnego) nazwisko i imię imiona rodziców data urodzenia płeć rodzaj materiału do badania Wywiad kliniczny (Wskazania do wykonania badania) wiek zachorowania obraz kliniczny wywiad rodzinny rodowód, dane o innych członkach rodziny dotkniętych chorobą ŚWIADOMA ZGODA PACJENTA NA BADANIA GENETYCZNE (podpisana przez pacjenta lub jego opiekuna i lekarza) Rozporządzenie Ministra Zdrowia z 21 stycznia 2009 Zmieniające rozporządzenie w sprawie standardów jakości dla medycznych laboratoriów diagnostycznych i mikrobiologicznych. Dz.U. 09.22.128 z 11 lutego 2009 Rozporządzenie Ministra Zdrowia z dnia 19 sierpnia 2015 r. zmieniające rozporządzenie w sprawie standardów jakości dla medycznych laboratoriów diagnostycznych i mikrobiologicznych
Wymogi przedanalityczne badanie przedobjawowe REKOMENDACJE Badania przedobjawowe procedura prowadzona wyłącznie przez Poradnię Genetyczną Procedura poradnictwa w takich przypadkach: Minimum 3 wizyty (pobranie próbki na 2 wizycie), Pobranie dwóch niezależnych próbek krwi Wcześniej stwierdzona mutacja u kogoś z rodziny proband (dostęp do próbki lub wyniku z akredytowanego laboratorium)
Wymogi przedanalityczne badanie prenatalne Wymagane informacje informacja o rodzicu-nosicielu mutacji (diagnoza) kopia wyniku badania genetycznego próbki DNA od obojga rodziców zgoda na badania * laboratorium powinno otrzymać próbkę krwi po urodzeniu/usunięciu ciąży w celach wewnętrznej kontroli jakości
Rekomendacje dla laboratoriów genetycznych standardy i procedury laboratorium powinno się upewnić czy skierowanie na badania przedobjawowe pochodzi od genetyka klinicznego, który zna standardy poradnictwa w HD wynik badania powinien być zawsze wysyłany do lekarza kierującego, który podczas wizyty w Poradni Genetycznej omawia wszelkie jego aspekty
Rozporządzenie Ministra Zdrowia z 21 stycznia 2009 Zmieniające rozporządzenie w sprawie standardów jakości dla medycznych laboratoriów diagnostycznych i mikrobiologicznych. Dz.U. 09.22.128 z 11 lutego 2009 Rozporządzenie Ministra Zdrowia z dnia 19 sierpnia 2015 r. zmieniające rozporządzenie w sprawie standardów jakości dla medycznych laboratoriów diagnostycznych i mikrobiologicznych European Journal of Human Genetics (2013) 21, 480 486 EMQN/CMGS best practice guidelines for the molecular genetic testing of Huntington disease. Working Group - Genetic Testing and Counselling Clin Genet. 2013 Mar;83(3):221-31. doi: 10.1111/j.1399-0004.2012.01900.x. Epub 2012 Jul 30. Special Feature Recommendations for the predictive genetic test in Huntington's disease. MacLeod R, Tibben A, Frontali M, Evers-Kiebooms G, Jones A, Martinez-Descales A, Roos RA; Editorial Committee and Working Group Genetic TestingCounselling of the European Huntington Disease Network.
Rozporządzenie Ministra Zdrowia z 21 stycznia 2009 Załącznik 3. Standardy jakości w zakresie czynności laboratoryjnej genetyki medycznej, oceny ich jakości i wartości diagnostycznej oraz laboratoryjnej interpretacji i autoryzacji wyniku badao. 1.1. Laboratorium opracowuje, wdraża i stosuje procedurę zlecania badao laboratoryjnych oraz udostępnia ją zleceniodawcom, którzy potwierdzają zapoznanie się z tą procedurą. Wszyscy zleceniodawcy zlecają wykonanie badao przez laboratorium zgodnie z tą procedurą. 1.2. Procedury zlecania badao laboratoryjnych określają w szczególności formularze zlecenia badania laboratoryjnego. 1.3. Formularz zlecenia badania laboratoryjne zawiera w szczególności pola: - dane osobowe - wywiad rodzinny, w tym informacja o obciążeniach genetycznych w rodzinie!!!! 4.2. Laboratorium sprawdza zgodnośd danych na zleceniu z oznakowaniem materiału oraz ocenia przydatnośd materiału do badania. 4.3. W przypadku stwierdzenia przez laboratorium niezgodności otrzymanego materiału do badao z wymaganiami dotyczącymi pobierania lub transportu, lub jakiegokolwiek innego rodzaju nieprawidłowości powodującej, że materiał nie może byd wykorzystany do badania, pracownik zgłasza to kierownikowi laboratorium lub osobie przez niego upoważnionej, którzy w razie potwierdzenia niezgodności mogą zakwalifikowad materiał jako niezdatny do badania i odmówid wykonania badania. Odmowę wykonania badania odnotowuje się w dokumentacji i zawiadamia się o tym fakcie zleceniodawcę. Dalsze postępowanie z materiałem laboratorium uzgadnia ze zleceniodawcą.
7.8. Laboratorium bierze stały udział w krajowych lub międzynarodowych programach zewnętrznej oceny jakości. 7.9. Laboratorium stosuje się do następujących warunków dobrego uczestnictwa w programach zewnętrznej oceny jakości: 1) realizuje badania w otrzymanym materiale kontrolnym w sposób identyczny z normalnie przyjętą praktyką postępowania z próbkami pacjentów; 2) poddaje ocenie zewnętrznej wyłącznie wyniki uzyskane przy wykorzystaniu aparatury pomiarowo badawczej stanowiącej jego wyposażenie oraz wymienionych w procedurze metody badawczej wyrobów medycznych stosowanych do diagnostyki in vitro; 3) uczestniczy w programach zewnętrznej oceny jakości z właściwą częstością, określaną przez organizatora tych programów; 4) dokonuje oceny poprawności wszystkich rodzajów badao wykonywanych w laboratorium i dostępnych w konkretnym programie zewnętrznej oceny jakości; 5) analizuje wszystkie wyniki uzyskane w programach oceny zewnętrznej i podejmuje działania korygujące i zapobiegawcze w przypadku uzyskania niezadowalających wyników.
8.4. Laboratorium opracowuje, wdraża i stosuje procedury wydawania sprawozdao z badao laboratoryjnych ze szczególnym uwzględnieniem laboratoryjnej interpretacji wyniku. Procedury wydawania sprawozdao określają w szczególności formularze sprawozdao z badania laboratoryjnego. 8.5. Formularz sprawozdania z badania laboratoryjnego zawiera w szczególności pola: 1) data wydruku i wykonania badania oraz numer identyfikacyjny badania; 2) rodzaj badania; 3) rodzaj badanego materiału; 4) dane pacjenta: 5) miejsce przesłania sprawozdania z badania lub dane osoby upoważnionej do odbioru sprawozdania; 6) dane laboratorium wykonującego badanie; 7) data i godzina pobrania materiału do badao; 8) data i godzina przyjęcia materiału do badao; 9) wyniki badania w formie zgodnej z obowiązującym w genetyce klinicznej zapisem; 10) laboratoryjna interpretacja wyników badao; 11) informacje dotyczące widocznych zmian właściwości próbki, które mogą mied wpływ na wynik badania; 12) podpis i pieczęd osoby upoważnionej do jego autoryzacji. Dodatkowo formularz wyniku PMPCN 13.UWAGI: np. brak probanda z weryfikacją molekularną HD; pobrano próbki krwi rodzeostwa na tej samej wizycie
EMQN/CMGS best practice guidelines for the molecular genetic testing of Huntington disease. PRESYMPTOMATIC TESTING 1. According to the international guidelines, predictive testing for HD should only be requested by a clinical geneticist. 2. Presymptomatic testing can be offered to individuals at an a priori 50 or 25% risk. 3. Confirmation of HD at the molecular level in at least one family member with HD is advisable. 4. Presymptomatic testing of minors (18 years of age) is considered appropriate only in exceptional circumstances. 5. Comprehensive genetic counseling is required, and informed consent must be provided in accordance with local practices.
2. Access to the test REC. 2.8 All laboratories are expected to comply with the Organization for Economic Co-operation and Development (OECD) Guidelines for Quality Assurance in Molecular Testing by providing and practicing genetic testing under a quality assurance framework, meet rigorous standards of accuracy, participating in external quality assessment (EQA) schemes and working towards certification and accreditation. REC 2.8.1 Laboratories should be cognizant of the limitations of the methodologies used (including, e.g. the possibility of missing a very large expansion, the risk of error that might lead to a non-carrier result if an affected relative has not been tested), and should indicate these clearly in reports issued, along with margins of error. Reasons for the changes 2.8 and 2.8.1 Since 1994 several guidelines for best laboratory practice in genetic testing have been issued. Quality control and accreditation of laboratories have become essential requirements since 1994. One of the basic principles according to the OECD guidelines is that predictive genetic tests should be accompanied by genetic counselling, and laboratories should ensure that this is the case. Several limitations and an error estimate of CAG repeat sizing have been reported in the last 15 years, which should be mentioned in the report. 3. Support during the test process REC 3 The participant should be encouraged to select a companion to accompany him/her throughout all the different stages: the pre-test, the taking of the test, the delivery of the results and the post-test stage. 4. Recommendation on communication of information REC 4 Testing and counselling should be provided by genetic counselling units knowledgeable about molecular genetic issues in Huntington's disease. These centres should work in close collaboration with the lay organization(s) of the country.
Diagnostyka różnicowa GeneReviews [Internet]. Niedziedziczne choroby z objawem pląsawicy: późna dyskineza, nadczynnośd tarczycy, choroby naczyniowe mózgu, toczeo mózgu, policytemia. Dziedziczne choroby z pląsawicą w obrazie klinicznym - AD autsomal diminant, AR autosomal recessive, X-linked Huntington disease-like 1 (HDL1) (OMIM 603218) AD HDL1 is caused by a specific mutation (8 extra octapeptide repeats) in the prion protein (PrP) gene, PRNP, on chr. 20p. Huntington disease-like 2 (HDL2) AD The causative mutation is a CTG/CAG repeat expansion in the junctophilin-3 gene (JPH3). The prevalence of HDL2 is highest among (and perhaps exclusive to) individuals of African descent. Chorea-acanthocytosis (ChAc) AR VPS13A, which encodes chorein, is the only gene in which mutation is currently known to cause ChAc. McLeod neuroacanthocytosis syndrome (MLS) X-linked XK is the only gene in which mutation is known to cause MLS. Spinocerebellar ataxia type 17 (SCA17) AD - TBP gene Dentatorubral-pallidoluysian atrophy (DRPLA) AD Benign hereditary chorea (OMIM 118700) AD Hereditary cerebellar ataxia (see Ataxia Overview). Creutzfeld-Jakob disease (see Genetic Prion Diseases). Early-onset familial Alzheimer disease Familial frontotemporal dementia with parkinsonism-17 (FTDP-17)