Alergia Astma ebrowska Immunologia, A., Wysoczyñska 2005, 10(4), 187-193 K., Waszczykowska E. Adamalizyny metaloproteinazy bior¹ce udzia³ 187 Adamalizyny metaloproteinazy bior¹ce udzia³ w patofizjologii chorób skóry Adamalisynes metalloproteinases implicated in patchomechanism of skin diseases AGNIESZKA EBROWSKA 1/, KATARZYNA WYSOCZYÑSKA 1/, EL BIETA WASZCZYKOWSKA 2/ 1/ Katedra i Klinika Dermatologii i Wenerologii Uniwersytetu Medycznego w odzi, 94-017 ódÿ, ul. Krzemieniecka 5 2/ Zak³ad Immunodermatologii Katedry Dermatologii i Wenerologii Uniwersytetu Medycznego w odzi, 94-017 ódÿ, ul. Krzemieniecka 5 Adamalizyny (ADAM a disintegrin and metalloproteinases domain) nale ¹ do du ej rodziny bia³ek zale nych od cynku, zwanych metyzynami. Jest to grupa przezb³onowych glikoprotein, które w swojej budowie zawieraj¹ domenê metaloproteinazow¹ oraz dezintegrynow¹, dziêki czemu ³¹cz¹ w sobie funkcjê proteaz i bia³ek adhezyjnych. Taka struktura predysponuje je do udzia³u w wielu procesach zarówno fizjologicznych, jak i patologicznych. Znana jest rola, jak¹ odgrywaj¹ w interakcjach miêdzykomórkowych, procesach adhezji i fuzji komórek oraz procesach z³uszczania bia³ek z powierzchni komórkowych. Natomiast substraty dla wielu bia³ek tej grupy pozostaj¹ jednak do dzisiaj nie poznane. Jednym z nich jest prawdopodobnie kolagen XVII i VII bêd¹cy g³ównym sk³adnikiem w³ókien zakotwiczaj¹cych w skórze. Najnowsze badania wskazuj¹, e antygen BPAG2 wystêpuje w dwóch postaciach: jako pe³nej d³ugoœci bia³ko przezb³onowe o ciê arze 180 kda oraz jako cz¹steczka rozpuszczalna o ciê arze 120 kda, bêd¹ca z³uszczon¹ z powierzchni keratynocyta domen¹ zewnêtrzn¹. W zjawisku z³uszczania, który jest procesem proteolizy, istotn¹ rolê odgrywaj¹ adamalizyny. Dane dotycz¹ce fizjologii adamalizyn sugeruj¹, e mog¹ odgrywaæ one rolê w patologicznym, zale nym od autoprzeciwcia³ niszczeniu w³ókien zakotwiczaj¹cych. Alergia Astma Immunologia, 2005, 10(4), 187-193 Adamalysins are a specific Zn+ family of metalloproteinases (ADAMs a disintegrin and metalloproteinases). This is a group of transmembrane glycoproteins containing metalloproteinase and disintegrin domain, thereby acting both as adhesion molecules and proteases. Such structure predisposes them to participation in numerous, both physiological and pathological processes. They are known to affect intercellular interactions, cell adhesion and fusion processes, and the process of protein sheedding from cellular surfaces. However, the substrates for many proteins of that group have not been studied yet in sufficient detail. Collagen XVII and VII, the main constituent of the anchoring fibres, is probably one of those proteins. The most recent reports suggest that antigen BPAG2 occurs in two forms: as full-length 180 kda transmembrane protein and as 120 kda soluble molecule, the external domain desquamated from keratinocyte surface. Adamalysins play a major role in the desquamation, representing a proteolytic process. Data on adamalysin physiology suggest their role in pathological antibody-related destruction of the anchoring fibres. Alergia Astma Immunologia, 2005, 10(4), 187-193 Key words: adamalysins, bullous skin diseases, anchoring fibres S³owa kluczowe: adamalizyny, choroby pêcherzowe, w³ókna zakotwiczaj¹ce Wstêp Adamalizyny (ADAMs a disintegrin and metalloproteinases domain), podobnie jak metaloproteinazy, nale ¹ do nadrodziny bia³ek zale nych od cynku, zwanych metyzynami. W oparciu o budowê metyzyny podzielone zosta³y na cztery odrêbne podrodziny: astracyny, matryksyny (MMP-metaloproteinazy macierzy), adamalizyny (ADAMs, MDC, reprolizyny, SVMP) i serralizyny (proteazy bakteryjne) [1,2]. Prototypem bia³ek tej grupy jest metaloproteinaza wyizolowana z jadu wê a (SVMP Snake Venom Metallo Proteases). G³ówn¹ funkcj¹ wszystkich bia³ek z rodziny metaloproteinaz jest degradacja bia³ek macierzy zewn¹trzkomórkowej, a zw³aszcza kolagenu. Zatrucie jadem wê a prowadzi do krwotoku, który spowodowany jest zdolnoœci¹ trawienia przez SVMP sk³adników macierzy zewn¹trzkomórkowej: naczyñ, kolagenu typu IV, fibronektyny, lamininy, elatyny. Do powstania martwicy tkanek dodatkowo przyczyniaj¹ siê dezintegryny, bia³ka hamuj¹ce agregacjê p³ytek krwi. SVMP wystêpuje w formie nieaktywnej. Stan spoczynku utrzymywany jest dziêki proformie, której aktywacja nastêpuje tak jak w przypadku MMPs poprzez odciêcie w procesie proteolizy N-koñcowego fragmentu bia³ka rozerwanie wi¹zania Zn-cysteina [3].
188 Alergia Astma Immunologia, 2005, 10(4), 187-193 Jak dot¹d zidentyfikowano niewiele ponad 30 bia³ek nale ¹cych do rodziny ADAMs. Bia³ka te oznaczono zarówno u ssaków, jak i u ni szych organizmów: Xenopus, Drosophila, Caenorhabditis elegans. Biologiczna rola tych bia³ek poznana jest tylko w stosunku do kilku przedstawicieli bia³ek z tej rodziny. Wiadomo, e odgrywaj¹ wa n¹ rolê w interakcjach miêdzykomórkowych, procesach adhezji i fuzji komórek oraz procesach z³uszczania bia³ek z powierzchni komórkowych. Ostatnie 15 lat to okres intensywnych badañ nad adamalizynami. Od 1990 roku, kiedy pojawi³y siê pierwsze doniesienia o bia³ku, w strukturze którego obecny jest obszar charakterystyczny dla metaloproteinaz oraz dezintegryn, do dzisiaj poznano kolejnych 29 bia³ek o podobnej budowie. Adamalizyny s¹ rodzin¹ przezb³onowych glikoprotein. Skrót ADAM (ang. a disintegrin and metalloproteinases domain) nawi¹zuje do budowy tych bia³ek. Adamalizyny znane s¹ równie pod nazw¹ MCD (metalloprotease/disintegrin/cysteine-rich protein). Budowa i funkcja adamalizyn Adamalizyny s¹ rodzin¹ bia³ek glikoproteinowych typu 1 zwi¹zanych z b³on¹ komórkow¹ o wielkoœci w przybli- eniu 750 reszt aminokwasowych [3]. Budowa strukturalna tych bia³ek jest wspólna dla ca³ej rodziny i obejmuje: N-koñcow¹ sekwencjê sygna³ow¹, prodomenê metaloproteinazow¹, domenê dezintegrynow¹, region bogaty w cysteinê (zawieraj¹cy powtórzenia sekwencji EGF), domenê przezb³onow¹ i ogon cytoplazmatyczny. Interesuj¹cy jest fakt, e spoœród 30 znanych adamalizyn, jedynie po³owa wykazuje aktywnoœæ metaloproteinaz. Jest to ta grupa, która w swojej budowie posiada charakterystyczn¹ dla metyzyn sekwencjê HEXXH, która jest obszarem katalitycznym wi¹ ¹cym cynk [4]. Bia³ka z rodziny ADAMs zaanga owane s¹ w wiele ró norakich procesów: odgrywaj¹ istotn¹ rolê w procesie po³¹czenia plemnika z komórk¹ jajow¹, bior¹ udzia³ w fuzji mioblastów, z³uszczaniu z powierzchni komórek domen zewnêtrznych bia³ek, cytokin i ich receptorów, bia³ek adhezyjnych. U Drosophila bia³ka te s¹ niezbêdne dla prawid³owego rozwoju uk³adu nerwowego oraz budowy skrzyde³, u myszy odgrywaj¹ istotn¹ rolê w kszta³towaniu skóry i w³osów. Tak du a ró norodnoœæ funkcji, jakie pe³ni¹ adamalizyny, wynika z ich z³o onej budowy. Adamalizyny s¹ bia³kami, które ³¹cz¹ w sobie funkcjê proteaz i bia- ³ek adhezyjnych. Adhezyjna funkcja ADAMs przypisywana jest aktywnoœci obszaru dezintegrynowego, który jest ligandem integryn, natomiast obszar metaloproteinazowy odpowiada za tworzenie bia³kowych ektodomen. Mechanizmy molekularne, le ¹ce u pod³o a innych procesów przebiegaj¹cych przy wspó³udziale ADAMs, takich jak na przyk³ad fuzja miêœni, pozostaj¹ do dzisiaj nieznane. Takie cechy sugeruj¹ wa n¹ rolê tych bia³ek w odzia³ywaniach miêdzykomórkowych oraz oddzia³ywaniu miêdzy komórkami a macierz¹ zewn¹trzkomórkow¹. Interakcje miêdzykomórkowe oraz miêdzy macierz¹ a komórkami s¹ wa ne dla utrzymania prawid³owej homeostazy komórek i odgrywaj¹ istotn¹ rolê w wielu procesach fizjologicznych (embriogeneza, rozwój) i patologicznych (przerzuty nowotworowe, AIDS). Zdolnoœæ zmian w ekspresji bia³ek adhezyjnych i ich receptorów, zdolnoœæ regulacji wydzielanych bia³ek, g³ównie metaloproteinaz, jest istotna dla interakcji miêdzykomórkowych i oddzia³ywaniu komórek z macierz¹ [6,7]. Rola adamalizyn w procesie z³uszczania domeny zewnêtrznej Wiele integralnych bia³ek b³onowych podlega proteolitycznemu odszczepianiu, co prowadzi do uwolnienia z³uszczonych domen zewnêtrznych do przestrzeni oko³okomórkowej. Proces ten nazywany jest z³uszczaniem i zachodzi po zewnêtrznej stronie b³ony komórkowej, prowadz¹c do wytworzenia rozpuszczalnych, aktywnych fizjologicznie bia³ek. Proces z³uszczania domen zewnêtrznych wp³ywa na interakcje miêdzykomórkowe poprzez modulacjê œrodowiska otaczaj¹cego. Czynniki z³uszczaj¹ce ektodomeny nale ¹ do rodziny metaloproteinaz zlokalizowanych na powierzchni komórek lub bêd¹cych bia³kami przezb³onowymi. Po aktywacji dzia³aj¹ one w pobli u b³ony komórkowej w przestrzeni zewn¹trzkomórkowej [8]. Do bia³ek z³uszczanych z powierzchni komórek nale ¹ cz¹steczki adhezyjne, GHMB (growth hormon binding protein), cytokiny, czynniki wzrostu i ich receptory. ADAM 17 (TACE), ADAM 9 (MDC 9) i ADAM 10 (KUZ, Kuzbanian) ze wzglêdu na zdolnoœæ z³uszczania bia³ek z powierzchni komórkowych zwane s¹ czynnikami z³uszczaj¹cymi. W tej grupie najlepiej poznan¹ adamalizyn¹ jest ADAM 17 (TACE, enzym konwertuj¹cy TNFα). ADAM 17 jest dobrze poznanym enzymem odgrywaj¹cym kluczow¹ rolê w procesie z³uszczania z powierzchni komórki rozpuszczalnej formy TNFα, cytokiny bior¹cej udzia³ w procesie zapalnym. ADAM 17 ma zdolnoœæ z³uszczania tak e wielu innych bia³ek powierzchniowych: p75, TNFR, IL-1R-II, GHMB [2,9]. Zwiêkszona ekspresja TACE obecna jest w komórkach zaanga owanych w procesy zapalne, jednak e mechanizm tej zwiêkszonej ekspresji jest dot¹d nieznany [9]. Badania dotycz¹ce kolagenu XII, buduj¹cego w³ókna zakotwiczaj¹ce, potwierdzi³y, e z³uszczanie tej cz¹steczki poprzez enzym ADAM 17 jest uwarunkowane przez sk³ad lipidowy macierzy. Stwierdzono, e stosunek cholesterolu do sfingolipidów ma wp³yw na z³uszczanie tej cz¹steczki z keratynocytów, a poprzez ten proces na ich ró nicowanie siê i migracjê. Zastosowanie czynników zmieniaj¹cych strukturê lipidow¹ macierzy mo e mieæ wp³yw na procesy patologiczne zachodz¹ce w naskórku [10].
ebrowska A., Wysoczyñska K., Waszczykowska E. Adamalizyny metaloproteinazy bior¹ce udzia³ 189 Podrodziny ADAMTs Najnowsz¹ poznan¹ podrodzin¹ ADAMs s¹ bia³ka, w budowie których, oprócz klasycznych domen, dodatkowo pojawia siê motyw trombospondyny i st¹d ich nazwa ADAMTs. Od pozosta³ych przedstawicieli rodziny ADAMTs ró ni¹ siê dodatkowo brakiem domeny bogatej w cysteinê, domeny podobnej do EGF oraz domeny przezb³onowej i cytoplazmatycznej [5]. Zidentyfikowano 11 bia³ek grupy ADAMTs oraz wykazano, e niektóre z nich posiadaj¹ okreœlone funkcje biologiczne oraz aktywnoœæ proteolityczn¹, np. ADAMTs 2 bierze udzia³ w rozwoju prawid³owej skóry. Jest to enzym znany dot¹d pod nazw¹ N-proteinazy prokolagenu. Jest to proteaza usuwaj¹ca czêœæ aminokwasów w procesie proeolizy i powoduj¹ca przejœcie prokolagenu I i II w kolagen. Niedobór tego enzymu obserwuje siê w zespole Ehlersa-Danlosa typie VIIc. ADAMTs 4 i 11 znane s¹ z kolei jako agrekanazy 1 i 2 ze wzglêdu na ich zdolnoœæ rozszczepiania agrekanów proteoglikanów utrzymuj¹cych mechaniczne w³aœciwoœci chrz¹stki. Postêpuj¹ca degradacja i wyczerpanie agrekanów powoduje rozwój chorób degeneracyjnych (zwyrodnieniowych) stawów (osteoatrtroza) i chorób zapalnych stawów (RZS). ADAMTs 1, znany jako METH-1, posiada aktywnoœæ antyangiogenn¹ i mo e odgrywaæ istotn¹ rolê w regulacji rozwoju naczyñ [1]. Aktywnoœæ ADAMTs jest regulowana poprzez wystêpuj¹c¹ fizjologicznie grupê tkankowych inhibitorów metaloproteinaz macierzy TIMPs. Jak dot¹d znanych jest 4 przedstawicieli TIMPs wyizolowanych z komórek ssaków. Wykazano, e TIMP 1 i TIMP 3 wykazuj¹ aktywnoœæ hamuj¹c¹ w stosunku do ADAM 10, natomiast inhibitorem TACE jest tylko TIMP 3 [9]. Rola adamalizyn w chorobach pêcherzowych Badania ostatnich lat wskazuj¹ na udzia³ enzymów metaloproteinaz w patogenezie podnaskórkowych chorób pêcherzowych o pod³o u autoimmunologicznym, do których nale ¹ miêdzy innymi pemfigoid (BP bullous pemphigoid) i opryszczkowate zapalenie skóry (DH dermatitis herpetiformis). Patogeneza tych dermatoz zwi¹zana jest z destrukcj¹ elementów b³ony podstawnej, prowadz¹c¹ do rozwoju zmian pêcherzowych. B³ona podstawna jest z³o on¹ struktur¹, której zadaniem jest utrzymanie integralnoœci po³¹czenia skórno-naskórkowego. Proces wi¹zania siê przeciwcia³ skierowanych przeciwko autoantygenom, zlokalizowanym w b³onie podstawnej, aktywuje szereg procesów immunologicznych i enzymatycznych prowadz¹cych do zniszczenia w³ókien zakotwiczaj¹cych. Zarówno doniesienia literaturowe, jak i wstêpne wyniki badañ w³asnych dotycz¹ce ekspresji wybranych metaloproteinaz: kolagenazy, stromielizyny i elatynaz oraz ich tkankowych inhibitorów w tkankach chorobowo zmienionych, wskazuj¹ na istotn¹ rolê tej grupy enzymów w destrukcji b³ony podstawnej i tworzeniu siê pêcherzy. W dostêpnej literaturze nie ma jednak doniesieñ na temat ekspresji i udzia³u adamalizyn specyficznej rodziny metaloproteinaz w tym procesie. Jednak e okreœlenie w ostatnim czasie ich w³aœciwoœci biochemicznych i du ego powinowactwa do elementów buduj¹cych b³onê podstawn¹, przede wszystkim kolagenu XVII i VII, daje naukowe podstawy do rozwa enia udzia³u tych bia³ek w patogenezie zmian chorobowych w podnaskórkowych chorobach pêcherzowych. Pemfigoid jest dermatoz¹ pêcherzow¹, w której obecne s¹ nacieki zapalne w skórze oraz z³ogi immunoglobulin IgG i sk³adowej C3 komplementu odk³adaj¹ce siê wzd³u b³ony podstawnej naskórka. Obecnoœæ ich stwierdza siê metod¹ immunofluorescencji bezpoœredniej (DIF direct immunofluorescence test), która ma wartoœæ diagnostyczn¹. Badania ultrastrukturalne potwierdzi³y intensywny naciek zapalny na granicy skórno-naskórkowej, destrukcjê hemidesmosomów oraz sk³adników macierzy zewn¹trzkomórkowej [11]. Autoantygenami w BP s¹ glikoproteiny o masach cz¹steczkowych 180 kd (BPAG 2) i 230 (BPAG 1). BPAG 1 nale y do rodziny bia³ek zwanych plakinami, które s¹ bia³kami wewn¹trzkomórkowymi i ³¹cz¹ filament poœredni szkieletu komórki z desmosomami i hemidesmosomami. Uwa a siê, e przeciwcia³a skierowane przeciwko temu antygenowi powstaj¹ wtórnie, po uszkodzeniu keratynocytów i uwolnieniu determinant bior¹cych udzia³ w odpowiedzi autoimmunologicznej [12]. G³ównym antygenem w tej chorobie jest BPAG 2, bia³ko przezb³onowe typu II bêd¹ce kolagenem XVII. BPAG 2 jest kluczow¹ protein¹ buduj¹c¹ w³ókna zakotwiczaj¹ce, odpowiadaj¹ce za przyleganie naskórka do b³ony podstawnej. Badania strukturalne wykaza³y, e fragment zewn¹trzkomórkowy z COOH-koñcow¹ domen¹ kolagenow¹ ³¹czy b³onê podstawn¹ z hemidesmosomami naskórka. Za najbardziej immunogenn¹ czêœæ antygenu BPAG 2 uwa a siê fragment NC16a [13]. Verraes i wsp [14] na podstawie badañ in vitro i na modelu mysim pemfigoidu wykazali proteolizê antygenu BPAG 2 za pomoc¹ elastazy neutrofilowej, wydzielanej z komórek nacieku zapalnego, g³ównie neutrofilów. Wyników tych badañ nie potwierdzaj¹ doœwiadczenia przeprowadzone in vivo, gdzie g³ównymi komórkami nacieku s¹ eozynofile, nie posiadaj¹ce zdolnoœci wydzielania tego typu metaloproteinaz. Schimdt i wsp. [15] stwierdzili, e w wyniku wi¹zania autoprzeciwcia³ z antygenem BPAG 2 nastêpuje pobudzenie keratynocytów i uwalnianie przez nie interleukiny-6 i interleukiny-8 oraz aktywacja sk³adowej C5 dope³niacza. Dochodzi tak e do aktywacji mastocytów i neutrofilów, które wydzielaj¹ specyficzne proteazy z rodzin: kolagenaz, stromielizyn i elatynaz, maj¹cych zdolnoœæ trawienia szeregu bia³ek, które tworz¹ struktury b³ony podstawnej. Uwalniane przez komórki nacieku zapalnego oraz
190 Alergia Astma Immunologia, 2005, 10(4), 187-193 keratynocyty metaloproteinazy macierzy prowadz¹ w konsekwencji do powstawania pêcherzy [16]. Sugeruje siê, e po zwi¹zaniu przeciwcia³ skierowanych przeciwko fragmentowi NC16a z antygenem dochodzi do aktywacji adamalizyn prowadz¹cej do z³uszczenia fragmentu NC16a i w efekcie powstania pêcherza podnaskórkowego [8]. W badaniach przeprowadzonych z p³ynu pobranego ze spontanicznie i sztucznie wywo³anych pêcherzy okreœlaj¹cych aktywnoœæ niektórych metaloproteinaz, miêdzy innymi kolagenazy, stwierdzono znacznie podwy szone stê enie proteaz w p³ynie pêcherzowym. Doœwiadczenia te mog¹ wskazywaæ na znacz¹c¹ rolê tych enzymów w zachowaniu integralnoœci skóry [17]. W badaniach p³ynu z pêcherzy wykazano równie obecnoœæ inhibitorów metaloproteinaz, aczkolwiek w mniejszym stê eniu. Wydaje siê wiêc, e wzrastaj¹cy poziom inhibitorów metaloproteinaz odpowiada za ograniczenie destrukcji tkanek i rozpoczêcie procesu ich naprawy [18]. W warunkach fizjologicznych procesy enzymatyczne utrzymuj¹ równowagê pomiêdzy syntez¹ i z³uszczeniem zewn¹trzkomórkowej domeny z powierzchni keratynocytów. Istotnym wydaje siê potwierdzenie zale noœci pomiêdzy stê eniem enzymów i ich inhibitorów w p³ynie, jak i w tkankach, a stopniem aktywnoœci procesu chorobowego. Ustalenie takiej korelacji mog³oby pomóc w monitorowaniu leczenia. Rutynowo oznaczane bowiem, w praktyce klinicznej kr¹ ¹ce autoprzeciwcia³a typu BMZ (basement membrane zone) metod¹ immunofluorescencji poœredniej (IIF indirect immunofluorescence test) wykrywane s¹ u oko³o 70% pacjentów i ich miano nie koreluje z aktywnoœci¹ procesu chorobowego. Chocia wprowadzone w ostatnim okresie testy immunoenzymatyczne, wykazuj¹ce obecnoœæ swoistych anty-nc16a, zwiêkszy³y wykrywalnoœæ kr¹ ¹cych przeciwcia³, to jednak istnienie korelacji pomiêdzy ich mianem a nasileniem procesu chorobowego jest zagadnieniem kontrowersyjnym [13]. Kolagen XVII jest bia³kiem przezb³onowym typu II i cz¹steczk¹ adhezyjn¹ nab³onka, jest jednym ze sk³adników buduj¹cych hemidesmosomy, wielobia³kowe kompleksy poœrednicz¹ce w adhezji keratynocytów do b³ony podstawnej. Cz¹steczka kolagenu jest trimerem zbudowanym z trzech ³añcuchów o ciê arze 180 kda z kulist¹ wewn¹trzkomórkow¹ N-koñcow¹ domen¹ o d³ugoœci 466 aminokwasów, krótk¹ przezb³onow¹ domen¹ zbudowan¹ z 23 reszt aminokwasowych i zewn¹trzkomórkow¹ C-koñcow¹ domen¹ o d³ugoœci 1008 reszt aminokwasów. G³ówn¹ rolê kolagenu XVII w utrzymaniu adhezji nab³onkowej najlepiej mo na przedstawiæ na podstawie chorób skóry. Mutacja w genie kolagenu XVII COL17A prowadzi do dysfunkcji po³¹czeñ i pêcherzowego oddzielania naskórka w chorobach pêcherzowych. Rodzinê kolagenów przezb³onowych typu II tworzy kolagen XVII, XIII oraz ektodysplazyna A. S¹ to bia³ka naskórkowe z kolagenow¹ domen¹ zewnêtrzn¹ s¹siaduj¹c¹ z integrynami na powierzchni keratynocytów warstwy podstawnej. Kolagen XVII ³¹czy siê z α6β4 integryn¹ i z filamentami poœredznimi keratyny w hemidesmosomach [8]. Kolagen XVII, inaczej cz¹steczka BP180 lub BPAG 2, jest obok BP230 najwa niejszym autoantygenem pemfigoidu. Wystêpuje on w dwóch postaciach: jako pe³nej d³ugoœci bia³ko przezb³onowe o ciê arze 180 kda oraz jako cz¹steczka rozpuszczalna o ciê arze 120 kda, bêd¹ca z³uszczon¹ z powierzchni keratynocyta domen¹ zewnêtrzn¹ [19,20,21]. Z³uszczanie jest procesem proteolizy i dotyczy odszczepienia fragmentu C-koñcowego od domeny przezb³onowej prawdopodobnie bez regionu NC16A. Schumann i wsp. wykazali, e obie cz¹steczki s¹ autoantygenami rozpoznawanymi przez przeciwcia³a IgA i IgG w ró nych chorobach pêcherzowych skóry, a w niektórych przypadkach ektodomena jest preferowanym antygenem (linijna IgA dermatoza pêcherzowa i dzieciêca przewlek³a dermatoza) [22]. W pemfigoidzie obecne s¹ przeciwcia³a skierowane przeciwko obu cz¹steczkom kolagenu XVII. Ich obecnoœæ prowadzi do zmniejszenia adhezji naskórkowej i powstania pêcherzy. Badanie Franzke i wsp. [8], dotycz¹ce uwalniania domeny zewnêtrznej kolagenu XVII i zaanga- owanych w ten proces enzymów, wykluczy³o bezpoœredni udzia³ w procesie z³uszczania kilku enzymów zwi¹zanych z powierzchni¹ keratynocytów furyny, BMP-1, MMP 2, MMP 9 i MT1 MMP. Wykazano, e proces z³uszczania nasila³o dzia³anie estrem forbolu, a zmniejsza³o siê pod wp³ywem TIMP3. Wyniki sugeruj¹, e czynnikami z³uszczaj¹cymi mog¹ byæ ADAMs. W badaniu potwierdzono czynne zaanga owanie w proces z³uszczania trzech przedstawicieli rodziny ADAMs: TACE, ADAM 10 i ADAM 9. Transfekcja cdna tych adamalizyn prowadzi³a do nasilenia procesu z³uszczania i odwrotnie, brak TACE w komórkach prowadzi³ do znacznej redukcji z³uszczania. Funkcjonalnie uwolnienie domeny zewnêtrznej wi¹za³o siê ze zmienion¹ ruchliwoœci¹ keratynocytów in vitro [23]. Opryszczkowate zapalenie skóry (choroba Duhringa) jest zespo³em skórno-jelitowym o wspólnej etiopatologii z glutenozale n¹ enteropati¹ (GE). Istniej¹ pojedyncze doniesienia, e u chorych na GE jest zwiêkszona aktywnoœæ enzymu transglutaminazy tkankowej (ttg), a preferowanym substratem dla niego jest gliadyna (produkt metabolizmu glutenu) [24]. Najnowsze badania autoimmunologicznej patogenezy glutenozale nej enteropatii wykaza³y, i kluczow¹ rolê w tym procesie odgrywa reakcja deamidacji cz¹steczki gliadyny przez enzym ttg, co w konsekwencji prowadzi do powstania cz¹steczek zawieraj¹cych nowe epitopy [25]. Potwierdzono, e g³ównym autoantygenem glutenozale nej enteropatii jest transglutaminaza tkankowa i stanowi ona de facto antygen dla dotychczas oznaczanych w tej chorobie przeciwcia³ skierowanych przeciwko endomysium miêœni g³adkich (IgAEmA) [26].
ebrowska A., Wysoczyñska K., Waszczykowska E. Adamalizyny metaloproteinazy bior¹ce udzia³ 191 Niezwykle istotne s¹ obserwacje dotycz¹ce roli transglutaminazy naskórkowej, bêd¹cej prawdopodobnie izoform¹ ttg, w patogenezie opryszczkowatego zapalenia skóry. Dowiedziono, e transglutaminazy katalizuj¹, zale n¹ od jonów wapnia, reakcjê tworzenia kowalencyjnych wi¹zañ γ-glutamylo-lizynowych [27]. Przy udziale naskórkowej transglutaminazy zachodz¹ procesy ró nicowania keratynocytów oraz stabilizacja po³¹czeñ skórno-naskórkowych w brodawkach skórnych. Wiadomo tak e, e transglutaminaza katalizuje reakcje powstawania krzy owych wi¹zañ pomiêdzy kolagenem typu VII, który jest obecny w po³¹czeniach skórno-naskórkowych, tworz¹c w³ókna zakotwiczaj¹ce [27,28]. Potwierdzono, e substratami dla tego enzymu s¹ BM-40/osteonektyna/SPARK i nidogen/entaktyna [29]. Opisano dominuj¹c¹ rolê transglutaminaz w stabilizowaniu b³ony podstawnej, zewn¹trzkomórkowej macierzy otaczaj¹cej komórki sieci w³ókien kolagenowych [30] i ich po³¹czeñ z fibronektyn¹ [31]. Ze wzglêdu na istnienie doniesieñ, i substratami dla adamalizyn s¹ prawdopodobnie kolagen VII i entaktyna, celowe wydaje siê okreœlenie ich ekspresji w skórze u chorych na opryszczkowate zapalenie skóry [8]. Najnowsze doniesienia podkreœlaj¹ rolê naskórkowej izoformy TG, przeciwko której przeciwcia³a w chorobie Duhringa osi¹gaj¹ wysokie stê enia. Dowodz¹ tego badania Sardy i wsp. [32], którzy potwierdzili znacznie wiêksze powinowactwo kr¹ ¹cych przeciwcia³ do naskórkowej ni do tkankowej transglutaminazy i stwierdzili, e wiêkszoœæ kr¹ ¹cych immunoglobulin jest skierowana przeciwko temu bia³ku. Dodatkowo autorzy ci wykazali, i powstaj¹ce kompleksy immunologiczne, odk³adaj¹ce siê w szczytach brodawek skórnych, co uznawane jest za zjawisko patognomoniczne w DH, zawieraj¹ izoformê naskórkow¹ transglutaminazy. Istniej¹ kontrowersje, czy do rozwoju zmian chorobowych konieczna jest aktywacja procesów zapalnych przez pewn¹ krytyczn¹ masê z³ogów w skórze, czy te potrzebny jest dodatkowy mediator procesu zapalnego, np. IL-1 uwalniana w naskórku czy TNF-α [33] lub zmieniona aktywnoœæ enzymów degraduj¹cych macierz. Najnowsze badania opisuj¹ce rodzinê adamalizyn wykaza³y, e jedna z adamalizyn ADAM 17, maj¹ca cechy proteazy degraduj¹cej kolagen, uaktywnia cz¹steczkê TNF-α poprzez jej z³uszczenie z powierzchni komórki. Interesuj¹cym wydaje siê ewentualne potwierdzenie równoczesnej podwy szonej ekspresji TNF-α i ADAM 17 w tkankach chorych na podnaskórkowe choroby pêcherzowe [34]. Rozwój pêcherza zapocz¹tkowany jest gromadzeniem w brodawkach skórnych neutrofilów tworz¹cych mikroropnie Pierrarda. S¹ one szybko transformowane przez obrzêk i stan zapalny w mikropêcherzyki, ³¹cz¹c siê nastêpnie i tworz¹c wiêksze pêcherze podnaskórkowe. Pojawienie siê neutrofilów poprzedza wczesna akumulacja w skórze limfocytów o profilu CD4 +, wydzielaj¹cych g³ównie INF-γ, TNF-α i IL-2, które to cytokiny powoduj¹ powstanie póÿniejszych nacieków z komórek wieloj¹drzastych [35]. Wydzielanie adamalizyn w postaci nieaktywnej, podobnie jak i innych metaloproteinaz, aktywowanych przez ró ne enzymy pod wp³ywem cytokin, czynników wzrostu i zmiany sk³adu macierzy, powoduje ich szybk¹ odpowiedÿ na zmiany œrodowiska i czynniki patogenne. Badania in vitro wykaza³y, e aktywnoœæ ADAMs, podobnie jak innych MMPs, jest pobudzana przez Il-1, co potwierdza mo liwoœæ indukcji wzrostu ekspresji tych specyficznych proteaz przez proces zapalny [36]. Wiele spoœród bia³ek, w³¹czaj¹c cytokiny, czynniki wzrostu jak i receptory dla nich oraz cz¹steczki adhezyjne s¹ syntetyzowane jako struktury przezb³onowe, z³uszczane proteolitycznie z powierzchni komórek. Uwalnianie z powierzchni komórek rozpuszczalnych cytokin i czynników wzrostu zmienia ich biologiczn¹ aktywnoœæ i powoduje, e moduluj¹ aktywnoœæ innych struktur. Enzym z grupy adamalizyn ADAM 17 uwalnia na przyk³ad z powierzchni komórek TNF-α receptor dla tej cytokiny oraz dla Il-6 i L-selektynê [36]. Badania ostatnich lat, przeprowadzone in vitro, wskazuj¹, e substratem dla ADAM 17 oraz ADAM 9 i ADAM 10, syntetyzowanych jako nieaktywne cz¹steczki w keratynocytach, mo e byæ tak e sk³adnik buduj¹cy hemidesmosomy kolagen XVII [8]. Nieprawid³owa ekspresja adamalizyn lub brak ich inhibitorów, stymulowane przez kompleksy immunologiczne obecne w strukturach b³ony podstawnej, mog¹ byæ odpowiedzialne za proces niszczenia w³ókien zakotwiczaj¹cych i tworzenie pêcherza. Proces ten mo e wynikaæ z nadmiernej ekspresji adamalizyn czy te braku ich inhibitorów i dotyczy skóry zmienionej chorobowo czy tak e pozornie zdrowej, ale z obecnoœci¹ z³ogów immunoglobulin i dope³niacza. Istotne wydaje siê wskazanie prawdopodobnych czynników aktywuj¹cych ekspresjê adamalizyn w okolicach chorobowo zmienionych i okreœlenie mo liwoœci terapeutycznego zastosowania ich inhibitorów. Bior¹c pod uwagê stale rosn¹c¹ w ostatnich latach liczbê badañ dotycz¹cych udzia³u metaloproteinaz w patologii chorób skóry, mo na siê spodziewaæ w nied³ugim czasie klinicznego zastosowania ich inhibitorów. Prawdopodobnie mo liwoœæ farmakologicznego regulowania aktywnoœci proteolitycznej poszczególnych MMPs stworzy nowe perspektywy leczenia w dermatologii. Kliniczne zastosowanie inhibitorów metaloproteinaz Prace nad specyficznoœci¹ inhibitorów proteaz wykaza³y, e mo na zablokowaæ ADAM 17, czyli enzym z³uszczaj¹cy TNF-α z komórek, wy³¹czaj¹c blokowanie innych metaloproteinaz. Mo e byæ to zjawisko wykorzystywane podczas leczenia chorób, których patogeneza jest zwi¹zana z podwy szonym stê eniem tej cytokiny. Obecnie s¹ prowadzone badania nad wyselekcjonowanym
192 Alergia Astma Immunologia, 2005, 10(4), 187-193 unieczynnianiem poszczególnych proteaz [37]. Choroby, w których dochodzi do zmian sk³adu macierzy zewn¹trzkomórkowej, s¹ spowodowane prawdopodobnie obecnoœci¹ podwy szonych poziomów MMPs i ADAMTS bêd¹cych konsekwencj¹ podwy szonego stê enia TNF-α. Dlatego te postuluje siê w tych schorzeniach terapiê preparatami obni aj¹cymi stê enie TNF-α [38]. Stwierdzono, e zmiany w podœcielisku, na przyk³ad w przeroœcie lewej komory, zwi¹zane s¹ z podwy szonymi stê eniami metaloproteinaz, szczególnie poziomem MMP 9. Sugeruje siê po wstêpnych badanich in vitro, e zastosowanie inhibitorów metaloproteinaz w przysz³oœci spowoduje mo liwoœæ zapobiegania niekorzystnym zmianom w obrêbie ECM. Wydaje siê, e zastosowanie inhibitorów MMPs w chorobach skóry ma tak e du e uzasadnienie [39,40]. Doœwiadczenia prowadzone na komórkach czerniaka in vivo i in vitro stwierdzi³y w nich niski poziom ADAM 9 i e na regulacjê tego enzymu ma wp³yw stê enie Il-1, jak te obecnoœæ kolagenu 1 w ognisku chorobowym i otoczeniu. W dermatozach pêcherzowych dochodzi do destrukcji ró nych typów kolagenów w zmianach chorobowych oraz lokalnego wzrostu stê enia Il-1; proces ten z pewnoœci¹ wp³ywa na zachwianie równowagi miêdzy proteazami i ich inhibitorami. Mo liwoœæ monitorowania stê eñ tych enzymów w p³ynie pêcherzowym da³aby szansê na zastosowanie TIMPs lub preparatów wp³ywaj¹cych na poziom Il-1 [41]. Ze wzglêdu na podobieñstwo budowy ADAMs i EGF przeprowadzono, w celu obni enia aktywnoœci ADAMs, doœwiadczenia wykorzystuj¹ce zwi¹zki hamuj¹ce dzia³anie czynnika EGF. Badania wykaza³y, e zarówno ADAMs, jak i EGF maj¹ wp³yw na progresjê nowotworów i byæ mo e inhibitory tych czynników bêd¹ mia³y miejsce w terapii ograniczaj¹cej rozwój chorób nowotworowych [42]. Praca finansowana z funduszu prac w³asnych nr 509-11-089 i KBN Nr 507-11-280. Piœmiennictwo 1. Gur P, Kaushal S, Shah V. The new kids on the block: ADAMTSs, potentially multifunctional metalloproteinases of the ADAM family. J Clin Invest. 2000; 105: 1335-1337. 2. Baumann T, Frank C. Metalloproteinases and the modulation of GH signaling. Journal of Endocrinology 2002; 174: 361-368. 3. Gomis R. Structural aspects of metzincin clan of metalloendopeptidases. Mol Biotechnol 2003; 24: 157-202. 4. Schloendorf J, Blobel C.P. Metalloprotease-disintegrins: modular proteins capable of promoting cell-cell interaction and triggering signals by protein-ectodomain shedding. Journal of Cell Science 1999; 112: 3603-3617. 5. Huang J, Bridges LC, White JM. Selective Modulation of Integrinmediated Cell Migration by Distinct ADAM Family Members. Mol Biol Cell. 2005; 3: 123-134. 6. Ohtsuka T, Shiomi T, Shimoda M. i wsp. ADAM28 is overexpressed in human non-small cell lung carcinomas and correlates with cell proliferation and lymph node metastasis. Int J Cancer. 2005; 28: 254-259. 7. Yang P, Baker KA, Hagg T. A disintegrin and metalloprotease 21 (ADAM21) is associated with neurogenesis and axonal growth in developing and adult rodent CNS. J Comp Neurol. 2005; 490: 163-179. 8. Franzke CW, Tasanen K, Schacke H i wsp.: Transmembrane collagen XVII, an epithelial adhesion protein, is shed from the cell surface by ADAMs EMBO J. 2002; 21: 5026-5035. 9. Dev K, Frank L. Expression of ADAMs (a disintegrin and metalloproteases) and TIMP-3 (tissue inhibitor of metalloproteinase-3) in human prostatic adenocarcinomas. Int J Oncology. 2003; 23: 1365-1371. 10. Zimina EP, Bruckner-Tuderman L, Franzke CW. Shedding of collagen XVII ectodomain depends on plasma membrane microenvironment. J Biol Chem. 2005; 8: 25687-25692. 11. Jordon RE. Basement zone antibodies in bullous pemphigoid. JAMA 1967; 200: 751-756. 12. Stanley JR. Cell adhesion molecules as targets of autoantibodies in pemphigus and pemphigoid, bullous diseases due to defective epidermal cell adhesion. Adv Immunol. 1992; 53: 291-325. 13. Schmidt E, Obe K, Brecker EB i wsp. Serum levels of autoantibodies to BP 180 correlate with disease activity in patients with bullous pemphigoid. Arch Dermatol. 2000; 136: 253-254. 14. Verraes S, Homebeck W, Polette M i wsp. Recpective contribution of neutrophil elastase and matrix metalloproteinase 9 in the degradation of BP 180 (type XVII) in human bullous pemphigoid. J Invest Dermatol. 2001; 117: 1091-1096. 15. Schmidt E, Reimer S, Kruse N i wsp. Autoantibodies to BP 180 associated with bullous pemphigoid relase interleukin-6 and interleukin-8 from cultured human keratynocytes. J Invest Dermatol. 2000; 115: 842-848. 16. Grando SA, Glukhenky BT, Orannik GN i wsp. Mediators of inflammation in blister fluids from patients with pemphigus vulgaris and bullous pemphigoid. Arch Dermatol. 1989; 125: 925-930. 17. Oikarinen A, Kyimaniemi M, Autjo-Harmainen H i wsp. Demonstration of 72-kDa and 92-kDa forms of type collagenase in human skin: variable expression in various blistering diseases, inducting during re-epithelialization and decrease by topical glucocorticosteroids. J Invest Dermatol. 1993; 101: 205-210. 18. Welgus HG, Bauer LA, Strieklin GP. Elevated levels of human collagenase inhibitor in blister fluids of diverse etiology. J Invest Dermatol 1989; 87: 592-596. 19. Schaecke H,Schumann H. Two Forms of Collagen XVII in Keratinocytes a full-length transmembrane protein and soluble ectodomain. J Biol Chem. 1998; 273, 25937-25943. 20. Yoshiaki H, Jiro U. Cleavage of BP180, a 180-kDa Bullous Pemphigoid Antigen, Yields a 120-kDa Collagenous Extracellular Polypeptide. J Biol Chem. 1998; 273, 9711-9717. 21. Claus-Werner F, Kaisa T i wsp. Shedding of Collagen XVII/ BP180 J. Biol. Chem. 2004; 279, 24521-24529.
ebrowska A., Wysoczyñska K., Waszczykowska E. Adamalizyny metaloproteinazy bior¹ce udzia³ 193 22. Schumann H, Baetge J, Tasanen K i wsp. The shed ectodomain of collagen XVII/BP180 is targed by autoantibodies in different blistering skin diseases. AM J Pathol. 2000; 156: 685-695. 23. Tasanen K, Tunggal L i wsp. Keratinocytes from patient lacking collagen XVII display a migratory phenotype. AM J Path. 2004; 164: 2027-2038. 24. Dietrich W, Ehnis T, Bauer M i wsp. Identification of tissue transglutaminase as the autoantigen of celiac disease. Nature Med 1997; 3: 797-801. 25. Dieterich W, Laag E, Bruckner-Tuderman L i wsp. Antibodies to tissue transglutaminase as serologic markers in patients with dermatitis herpetiformis. J Invest Dermatol. 1999; 113: 133-136. 26. Kumar V, Jarz¹bek-Chorzelska M, Sulej J i wsp. Tissue transglutaminase and endomysial antibodies diagnostic markers of gluten-sensitive enteropathy in dermatitis herpetiformis. Clin Immunol. 2001; 98: 378-382. 27. Aeschliman D, Paulsson M. Cross-lining of laminin-nidogen complexes by tissue transglutaminase. A novel mechanism for basement membrane stabilization. J Biol Chem. 1991; 266: 15308-15317. 28. Kleman J, Aeschliman D, Paulsson M i wsp. Transglutaminasecatalyzed cross-linking of fibrils of collagen V/XI in A204 rhabdomyosarcoma cells. Biochemistry 1995; 34: 13768-13775. 29. Aeschliman D, Paulsson M, Mann K. Identification of Gln 726 in nidogen as the amine acceptor in transglutaminase-catalyzed cross-links of laminin-nidogen complexes. J Biol Chem. 1992; 267: 11316-11321. 30. Aeschliman D, Kaupp O, Paulsson M. Osteonectin is a major glutaminyl substrate for transglutaminase-catalyzed cross-linking in cartilage matrix. J Cell Biol 1995; 129: 881-892. 31. Martinez J, Chalupowicz R, Roush A. Transglutaminasemediated processing of fibronectin by endothelial cell monolayers. Biochemistry 1994; 33: 2538-2545. 32. Sardy M, Karpati S, Merkl B i wsp. Epidermal transglutaminase (Tgase 3) is the autoantigen of dermatitis herpetiformis. J Exp Med 2002; 195: 747-757. 33. Zone J, Meyer L, Petersen M. Deposition of granular IgA relative to clinical lesions in dermatitis herpetiformis. Arch Dermatol. 1996; 132: 912-918. 34. Kuno K. Molecular cloning of gene encoding a new type of metalloproteinases disintegrin family protein with trombospondin motifs as an inflammation associated gene. J Biol Chem 1998; 272: 556-562. 35. Reitamo S, Reunala T, Konttinen Y i wsp. Inflammatory cells, IgA, C3, fibrin and fibronectin in skin lesions in dermatitis herpetiformis. Br J Dermatol. 1981; 105: 167-177. 36. Cerretti DP, Poindexter K, Castner BJ i wsp. Characterisation of the cdna and gene for mouse TNF alpha converting enzyme (TACE/ADAM) and its location to mouse chromosome 12 and human chromosome 2p25. Cytokine 1999; 11: 541-551. 37. Wei S, Kashiwagi M, Kota S i wsp. Reactive site mutations in tissue inhibitor of metalloproteinases-3 disrupt inhibition of matrix metalloproteinases but not TNF-alpha converting enzyme. J Biol Chem. 2005; 3: 26889-26894. 38. Seguin CA, Pilliar RM, Roughley PJ i wsp. Tumor necrosis factor-alpha modulates matrix production and catabolism in nucleus pulposus tissue. Spine. 2005; 1; 30: 1940-1948. 39. Ovechkin AV, Tyagi N, Rodriguez WE i wsp. Role of matrix metalloproteinase-9 in endothelial apoptosis in chronic heart failure in mice. J Appl Physiol. 2005; 4: 568-571. 40. Sampson M, Wall S, Baugh M i wsp. Monocyte matrix and ADAM metalloproteinase expression in type 2 diabetes after aspirin therapy. Diabetes Res Clin Pract. 2005; 13: 89-94. 41. Zigrino P, Mauch C, Fox JW i wsp. Adam-9 expression and regulation in human skin melanoma and melanoma cell lines. Int J Cancer. 2005; 116: 853-859. 42. Tanaka Y, Miyamoto S, Suzuki SO i wsp. Clinical significance of heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor and a disintegrin and metalloprotease 17 expression in human ovarian cancer. Clin Cancer Res. 2005; 11: 4783-4792.