Angiogeneza w szpiku kostnym u chorych na zespoły mielodysplastyczne

Angiogeneza w szpiku kostnym u chorych na zespoły mielodysplastyczne ARTYKUŁY ORYGINALNE Angiogenesis in bone marrow of myelodysplastic syndrome patients Krzysztof Mądry, Jadwiga Dwilewicz-Trojaczek, Wael Suleiman, Małgorzata Paszkowska-Kowalewska, Bogna Ziarkiewicz-Wróblewska Katedra i Klinika Hematologii, Onkologii i Chorób Wewnętrznych, Samodzielny Publiczny Centralny Szpital Kliniczny, Akademia Medyczna, Warszawa Katedra i Zakład Anatomii Patologicznej, Akademia Medyczna, Warszawa Streszczenie: Wprowadzenie. Angiogeneza, czyli wytwarzanie nowych naczyń krwionośnych, może towarzyszyć zarówno stanom fizjologicznym, jak i patologicznym. W ostatnich latach stwierdzono, że angiogeneza nie tylko warunkuje wzrost i rozwój guzów litych, ale towarzyszy również nowotworom krwi. Cele. Celem pracy była ocena nasilenia angiogenezy w szpiku u chorych na zespoły mielodysplastyczne. Pacjenci i metody. Badano gęstość mikronaczyń szpiku kostnego (microvessel density MVD) u 3 chorych na zespoły mielodysplastyczne (myelodysplastic syndrome MDS) i u 0 osób z grupy kontrolnej (chorzy na chłoniaki ziarnicze lub nieziarnicze bez zajęcia szpiku kostnego) metodą immunohistochemiczną z zastosowaniem przeciwciał monoklonalnych anty- CD3 i anty-cd3. Dodatkowo u chorych na MDS i 6 zdrowych ochotników określono stężenie czynnika wzrostu śródbłonka naczyń (vascular endothelial growth factor VEGF) w surowicy metodą immunoenzymatyczną. Wyniki. Stwierdzono, że wartości MVD u chorych na MDS były istotnie większe niż u osób z grupy kontrolnej (różnice były istotne statystycznie p <0,05). Największe wartości MVD odnotowano u chorych w podtypach RAEBt i CMML według FAB. Nie stwierdzono korelacji między MVD a czynnikami biologicznymi u chorych na MDS, z wyjątkiem wieku (ujemna korelacja). Wartość MVD nie korelowała w sposób istotny statystycznie z czasem całkowitego przeżycia. Stężenie VEGF w surowicy osób chorych było nieznacznie większe niż u osób zdrowych, ale nie była to różnica istotna statystycznie. Stężenie VEGF w surowicy nie korelowało z wartościami MVD szpiku kostnego. Wnioski. Z powyższych danych wynika, że u chorych na MDS dochodzi do pobudzenia angiogenezy w szpiku, chociaż nie udało się ustalić jego mechanizmu. Słowa kluczowe: angiogeneza, gęstość mikronaczyń szpiku, naczyniowo-śródbłonkowy czynnik wzrostu, zespoły mielodysplastyczne Abstract: Introduction. Angiogenesis is an element of physiological and some pathological processes. Recently various investigators have reported that angiogenesis is associated not only with solid tumors but also with hematological malignancies. Objectives. The aim of this study was to assess angiogenesis in patients with myelodysplastic syndromes. Patients and methods. We have measured bone marrow microvessel density (MVD) in 3 myelodysplastic syndrome (MDS) patients and in 0 subjects of group control 0 lymphoma patients (their bone marrow was free of disease). It was estimated by immunohistochemical method using anti-cd3 and anti- CD3 monoclonal antibodies. In MDS patients and 6 healthy donors we also measured serum vascular endothelial growth factor (VEGF) by immunoenzymatic method. Results. Higher MVD numbers were found in MDS patients when compared to control bone marrows. The highest number of MVD was in RAEBt and CMML MDS subtypes according to FAB. There was no correlation between MVD and biological features of MDS patients except for the age (negative correlation). Bone marrow microvessel density does not influenced significantly on overall survival. The serum VEGF concentration in MDS patients was higher than in healthy donors, but the difference was not statistically significant. The VEGF levels did not correlate with MVD. Conclusions. We concluded that angogenesis is enhanced in bone marrow MDS patients though its mechamism is not yet fully understood. Key words: angiogenesis, microvessel density, myelodysplastic syndromes, vascular endothelial growth factor Angiogeneza w szpiku kostnym u chorych na zespoły mielodysplastyczne 5

WPROWADZENIE Angiogeneza to proces powstawania nowych naczyń krwionośnych. Od wielu lat wiadomo, że nasilona angiogeneza warunkuje wzrost, rozwój i tworzenie przerzutów guzów litych [,]. Niektórzy badacze dowodzili, że nasilenie angiogenezy może być czynnikiem rokowniczym na przykład we wczesnych stadiach raka piersi, czerniaka złośliwego i raka gruczołu krokowego [3-5]. Ostatnio wskazywano także na potencjalną rolę angiogenezy w rozwoju nowotworów krwi szpiczaka mnogiego [6] i chłoniaków nieziarniczych [7]. Szczególnie ciekawe doniesienia pochodzą z badań nad angiogenezą w ostrych białaczkach szpikowych. Czynniki angiogenne mogą nie tylko wpływać na naczyniotworzenie, ale również działać autokrynnie i parakrynnie na komórki blastyczne []. Aguayo i wsp. stwierdzili, że stężenie czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego (vascular endothelial growth factor VEGF) w szpiku kostnym i krwi obwodowej stanowi niezależny czynnik rokowniczy u chorych na ostrą białaczkę szpikową []. Karkolopoulou i wsp. stwierdzili ujemną korelację między całkowitym obszarem naczyniowym (total vascular area TVA) w szpiku a czasem całkowitego przeżycia oraz między gęstością mikronaczyń szpiku kostnego (microvessel density MVD) a czasem wolnym od choroby u chorych na zespoły mielodysplastyczne [0]. Szczególnie interesujące i jak dotąd mało poznane zagadnienie stanowi związek angiogenezy z podtypami zespołu mielodysplastycznego (myelodysplastic syndrome MDS) według klasyfikacji francusko-amerykańsko-brytyjskiej (French-American-British classification FAB), transformacją do ostrej białaczki szpikowej i komórkowością szpiku. Angiognezę można badać metodami bezpośrednimi, oceniając ilościowo i jakościowo sieć naczyń w badanej tkance, oraz metodami pośrednimi, oznaczając poziom czynników odpowiedzialnych za angiogenezę na przykład w surowicy, osoczu, szpiku kostnym czy moczu. Celem badania była ocena nasilenia angiogenezy u chorych na MDS w porównaniu z grupami kontrolnymi przez pomiar MVD oraz VEGF w surowicy i określenie, czy obie te metody bezpośrednia i pośrednia korespondują ze sobą. Drugim celem było porównanie nasilenia angiogenezy w mniej (RA, RARS) i bardziej agresywnych (RAEB, RAEBt) typach MDS oraz określenie związku angiogenezy z biologicznymi i klinicznymi cechami pacjentów chorych na MDS. PACJENCI I METODY Naczynia krwionośne w szpiku kostnym Oceniono preparaty histologiczne szpiku kostnego 3 chorych na zespoły mielodysplastyczne będących pod opieką Kliniki Hematologii, Onkologii i Chorób Wewnętrznych Samodzielnego Publicznego Centralnego Szpitala Klinicznego w Warszawie w latach 003. Grupę kontrolną stanowiło 0 chorych na chłoniaka ziarniczego lub chłoniaki nieziarnicze, u których choroba przebiegała bez zajęcia szpiku kostnego. Rozpoznanie MDS ustalono na podstawie badania cytologicznego szpiku kostnego z zastosowaniem barwienia Maya, Grünwalda i Giemsy oraz oceny histologicznej trepanobioptatów. Bioptaty kości utrwalano w płynie oksfordzkim, a następnie przeprowadzano rutynowo do bloczków parafinowych. Skrawki grubości 0, mm barwiono hematoksyliną i eozyną oraz Gomori w kierunku obecności włókien retikulinowych. Wykonano również barwienia immunohistochemiczne z przeciwciałami CD3 IC70A oraz CD3 kl. II QBEnd/0 (DakoCytomation, En Vision kit). MVD określono następująco: oceniono całość materiału (5 7 pól w trepanobioptacie) w powiększeniu z użyciem obiektywu 0x (HPF) pod kątem obecności komórek śródbłonka tworzących mikronaczynia. Następnie wyliczono średnią liczbę naczyń przypadającą na pojedyncze pole w danej trepanobiopsji. Oznaczanie stężenia VEGF w surowicy krwi Stężenie VEGF określono w surowicy chorych na zespoły mielodysplastyczne oraz 6 zdrowych ochotników. Pobraną do probówki niezawierającej antykoagulantów krew obwodową pozostawiono na 30 minut w celu wytworzenia skrzepu, a następnie wirowano przez około 5 minut około 00 x g. Tak przygotowaną surowicę przechowywano w temperaturze 0 C. Pomiaru VEGF dokonano na podstawie ilościowego testu immunoenzymatycznego (ELISA [Qantikine; R and D Systems, Minneapolis, USA]). Analiza statystyczna Do badania korelacji wykorzystano analizę Spearmana. Różnice uznawano za istotne statystycznie, gdy wartość p wynosiła <0,05. Do oceny czasu całkowitego przeżycia w zależności od wyników MVD wykorzystano krzywe przeżycia Kaplana i Meiera. Adres do korespondencji: lek. Krzysztof Mądry, ul. Okrętowa 7a, 0-30 Warszawa, tel.: 63-35-77, e-mail: kmadry@amwaw.edu.pl Praca wpłynęła:.0.007. Przyjęta do druku: 5.06.007. Nie zgłoszono sprzeczności interesów. Pol Arch Med Wewn. 007; 7 (): 5-50 Copyright by Medycyna Praktyczna, Kraków 007 WYNIKI Podstawowe dane dotyczące badanych osób Wśród 0 z 3 chorych na MDS, u których analizowano MVD, rozpoznano podtyp RA, u RARS, u 6 RAEB, u RAEBt, a u CMML; badanie kontrolne wykonano u 0 osób chorych na chłoniaka ziarniczego lub chłoniaki nie- 6 POLSKIE ARCHIWUM MEDYCYNY WEWNĘTRZNEJ 007; 7 ()

ziarnicze bez zajęcia szpiku kostnego. U osób rozpoznano pierwotny zespół mielodysplastyczny, u osób zespół wtórny. Średni wiek chorych na zespoły mielodysplastyczne wynosił 6 lat (3 7); wśród nich było kobiet i 5 mężczyzn. Zakwalifikowanie do grup na podstawie międzynarodowego indeksu prognostycznego (IPSS) wyglądało następująco: Tabela. Charakterystyka pacjentów liczba pacjentów 3 średnia wieku 66 płeć mężczyźni kobiety FAB RA RARS RAEB RAEBt CMML pierwotny/wtórny MDS pierwotny wtórny IPSS mały średni- średni- duży komórkowość szpiku bogatokomórkowy średnio bogatokomórkowy ubogokomórkowy 6 7 0 6 5 5 CMML przewlekła białaczka mielomonocytowa (chronic mielomonocytic leukemia), FAB klasyfikacja francusko- -amerykańsko-brytyjska (French-American-British classification), IPSS międzynarodowy indeks prognostyczny (international prognostic index), MDS zespół mielodysplastyczny (myelodysplastic syndrome), RA niedokrwistość oporna na leczenie (refractory anaemia), RAEB niedokrwistość oporna na leczenie z nadmiarem blastów (refractory anaemia with excess of blasts), RAEBt niedokrwistość oporna na leczenie w okresie transformacji (refractory anaemia with excess of blasts in transformation), RARS niedokrwistość oporna na leczenie z pierścieniowatymi syderoblastami (refractory anaemia with ring sideroblasts) u pacjentów stwierdzono mały indeks (0 pkt), średnio mały indeks (0,5,0 pkt), średnio duży indeks (,5,0 pkt), a u 5 osób duży indeks (,5 pkt). U 5 osób szpik był bogatokomórkowy, u średniokomórkowy, a u ubogokomórkowy (tab. ). Badanie cytogenetyczne wykonano u 7 pacjentów; u 0 z nich stwierdzono kariotyp korzystny rokowniczo, pośredni, a u 6 niekorzystny rokowniczo. Naczynia krwionośne w szpiku kostnym Średnią gęstość mikronaczyń szpiku u chorych na MDS, a także u osób z grupy kontrolnej, określono na podstawie analizy danych z oceny preparatów barwionych z wykorzystaniem przeciwciał anty-cd3 i anty-cd3. U chorych na MDS MVD było znacznie większe niż w grupie kontrolnej i wynosiło,6 w porównaniu z,3 osób z grupy kontrolnej. Była to różnica istotna statystycznie. U chorych na MDS najmniej- wartości MVD 6 0 6 0 - RA RARS RAEB RAEBt CMML grupa kontrolna średnia średnia ±odchylenie standardowe średnia ±,6 odchylenie standardowe Ryc.. Wartości MVD w różnych typach MDS i grupie kontrolnej. Skróty: MVD gęstość mikronaczyń szpiku kostnego (microvessel density), inne patrz tabela Tabela. MVD w różnych podtypach MDS Rozpoznanie Ilość pacjentów Średnia MVD Zakres MVD Mediana MVD grupa kontrolna 0,3 0,5 3,, MDS 3,6 3,,0,3 RA/RARS,,3,, RAEB 6,0 3,,0 0, RAEBt,,,, CMML,,,, MVD gęstość mikronaczyń szpiku kostnego (microvessel density), inne patrz tabela Angiogeneza w szpiku kostnym u chorych na zespoły mielodysplastyczne 7

Tabela 3. Analizowane parametry w zależności od wyniku MVD Analizowany parametr MVD,0 MVD <,0 liczba osób FAB RA/RARS RAEB RAEBt CMML IPSS mały średni- średni- duży płeć mężczyźni kobiety 7 6 3 6 sze wartości MVD odnotowano w grupie RA/RARS,, a największe w grupie RAEBt, (tab., ryc. ). Wartości MVD w grupie chorych na RA/RARS i grupie RAEB/RAEBt nie różniły się istotnie statystycznie (p >0,05). Różnice istotne statystycznie obserwowano, porównując grupę RA/RARS z grupą RAEBt (p <0,05) oraz RA/RARS z grupą CMML (p <0,05) (tab. ). 3 0 3 5 wiek 66, 67, cytogenetyka rokowanie korzystne pośrednie niekorzytne 0 3 Hb (g/dl),,7 RBC (T/l),56,77 Ht (%),6 5,7 płytki krwi (G/l), 7,5 krwinki białe (G/l) 6,0,0 blasty szpik (%),0 6, OB (mm/h) 67, 6,7 VEGF (pg/ml) 75 LDH (U/l) 66, 6 erytropoetyna (IU/l) 6 żelazo (mg/dl), 7 witamina B (pg/ml) 7 77 KKCZ (j./mies.) 3,6, zgon/żyje zgon żyje czas całkowitego przeżycia (dni) 3 7 7 5 VEGF (vascularendothelial growth factor) czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego, inne patrz tabela. cytogenetyka rokowanie korzystne, gdy del5, del0 lub Y; niekorzystne, gdy nieprawidłowości chr 7 lub co najmniej 3 zaburzenia; pośrednie, gdy brak zmian lub inne niż wyżej wymienione Tabela. Czas całkowitego przeżycia w wybranych przedziałach wg wartości MVD Przedział wartości MVD W analizie porównawczej cech biologicznych z MVD w teście Spearmana stwierdzono ujemną korelację między wiekiem a MVD. Porównano grupę osób z hipoplastycznym szpikiem z osobami ze szpikiem średnio-/bogatokomórkowym szpik hipoplastyczny, średnia MVD 5,7 (mediana,3; min. 3,, maks.,), oraz szpik średnio-/bogatokomórkowy, średnia MVD,5 (mediana,03; min. 6, maks. ). Różnica między wynikami u osób z obu grup nie była istotna statystycznie. W grupie osób o większej gęstości mikronaczyń szpiku (MVD >) stwierdzono nieznacznie większy odsetek blastów w szpiku (odpowiednio: % i 6%), większe stężenie witaminy B (odpowiednio: 7 pg/ml i 77 pg/ml) oraz większe stężenie erytropoetyny we krwi (odpowiednio: U/l i 6 U/l) niż u osób z pozostałej grupy (MVD <). Wartości pozostałych parametrów hemoglobina, płytki krwi, białe krwinki, krwinki czerwone, hematokryt, żelazo, OB, dehydrogenaza mleczanowa oraz IPSS były w obu grupach porównywalne. Średnie stężenie VEGF w surowicy chorych ze zwiększonym MVD było nieznacznie mniejsze i wynosiło 75 pg/ml, u pozostałych zaś chorych pg/ml (p >0,05). Średni czas całkowitego przeżycia w obu grupach był porównywalny i w grupie o większej gęstości mikronaczyń szpiku wynosił 6,5 miesiąca, a w o mniejszej, miesiąca (tab. 3). Analizowano średni czas całkowitego przeżycia w przedziałach ustalonych na podstawie wartości MVD: grupa I do 7,0, grupa II 7,,0, grupa III,,0 i grupa IV MVD >,0. Całkowity czas przeżycia w wymienionych grupach nie różnił się istotnie i wynosił odpowiednio: miesięcy, 6 miesięcy, 6, miesiąca oraz 5 miesięcy (tab. ). Z kolei porównanie krzywych przeżycia Kaplana i Maiera dla chorych z powyższych grup pozwala dostrzec, że krzywe osób z mniejszą gęstością mikronaczyń szpiku układają się nad krzywymi osób z bogatszą siecią naczyń szpiku, czyli że okres przeżycia tych chorych (z mniejszym MVD) jest dłuższy. Wyjątek stanowił przedział MVD <7,0, którego krzywa znajdowała się poniżej wyższych wartości MVD 7,0 (ryc. ). VEGF w surowicy Średni OS (mies.) Mediana OS (mies.) 7,0,0, 33 Zakresy wartości OS (mies.) 7,,0 6,0, 0, 33,,,0 6,,3 3,3 >,0 5,0 3,0 5, 36, OS czas całkowitego przeżycia (overall survival), inne patrz tabela Określono stężenie VEGF w surowicy krwi u chorych na MDS, w tym u chorych z typem RA, 3 chorych z typem RAEB i z CMML (tab. 5). U wszystkich tych chorych POLSKIE ARCHIWUM MEDYCYNY WEWNĘTRZNEJ 007; 7 ()

,0 0, 0,6 0, 0, 0,0-0, kompletne ucięte 0 5 0 5 0 5 30 35 0 5 50 czas przeżycia (miesiące) MVD <7,0 MVD od 7, do,0 MVD od, do,0 MVD >,0 Ryc.. Czas przeżycia w zależności od wartości MDV wykonano również badanie MVD szpiku kostnego. Grupę kontrolną stanowiło 6 zdrowych ochotników. Stężenie VEGF w surowicy osób zdrowych wynosiły średnio 6, pg/ml, mediana 7 pg/ml (33 3), a u osób chorych na MDS 7,7 pg/ml, mediana 5 (,5 0). Duża zmienność wyników zarówno w grupie kontrolnej, jak i u osób z MDS oraz mała liczebność grup przesądziła o tym, że różnica ta nie była istotna statystycznie. Nie stwierdzono korelacji między stężeniem VEGF w surowicy a parametrami biologicznymi chorych na MDS. Wyjątkiem była dodatnia korelacja z LDH. Wartości VEGF w surowicy nie korelowały z wynikiem MVD szpiku kostnego. OMÓWIENIE Omówione badania dowiodły, że u osób z MDS dochodzi do pobudzenia angiogenezy w szpiku; podobnie jak w badaniu Pruneri i wsp., największe wartości MVD obserwowano w najbardziej agresywnych typach MDS RAEBt oraz CMML []. Podobnie jak w innych dotychczas prowadzonych badaniach, średnia gęstość mikronaczyń szpiku u chorych na MDS była większa niż w grupie kontrolnej, a mniejsza niż u chorych na ostrą białaczkę szpikową [,]. W pozostałych podtypach RA, RARS i RAEB wyniki różniły się w nieznacznym tylko stopniu. Dane te przemawiają za tym, że nasilona angiogeneza może się wiązać ze zwiększoną gotowością MDS do transformacji blastycznej. Trudno jednoznacznie ustalić, w jakim związku przyczynowo-skutkowym pozostają obydwa te zjawiska: angiogeneza i transformacja blastyczna. Bellamy Tabela 5. Stężenie VEGF w surowicy i MVD szpiku kostnego u pacjentów z MDS i w grupie kontrolnej podtypy MDS wg FAB oraz MVD Osoby badane Typ MDS wg FAB MVD VEGF (pg/ml). RA, 67. RA 7, 56 3. RA,3 7. RA, 57 5. RA, 0 6. RA,3 3 7. RA,0 50. RA, 3. RAEB,3 0. RAEB,5 7. RAEB, 0. RAEB,7 603 3. CMML, 33. CMML,. zdrowy 33. zdrowy 30 3. zdrowy. zdrowy 5. zdrowy 3 6. zdrowy 6 Skróty jak w tabelach i i wsp. wykryli, że w blastach mogą się znajdować receptory dla VEGF- Flt- i Flk- []. Hussong i wsp. za pomocą techniki PCR wykryli VEGF w liniach komórek wyizolowanych od pacjentów chorych na ostrą białaczkę szpikową [3]. Czynniki angiogenne (przede wszystkim VEGF) mogą tym samym oddziaływać nie tylko na komórki śródbłonka, ale i na blasty poprzez działanie mitogenne i(lub) hamowanie apoptozy []. Z naszych danych wynika, że u chorych ze zwiększonym MVD stwierdza się mniejsze stężenie hemoglobiny, większe stężenie erytropoetyny we krwi oraz większe zapotrzebowanie na przetaczanie koncentratu krwinek czerwonych niż u pozostałych chorych. Może to przemawiać za tezą, że nasilona angiogeneza ma charakter wtórny do hipoksji. Nie stwierdziliśmy, by gęstość mikronaczyń szpiku była czynnikiem rokowniczym przebiegu MDS. Różnice między czasem całkowitego przeżycia u pacjentów o różnych MVD były zbyt małe, by można je było uznać za istotne statystycznie. Karkolopoulou i wsp. stwierdzili, że MVD koreluje z ryzykiem transformacji blastycznej MDS, z czasem całkowitego przeżycia koreluje natomiast długość mniejszej osi naczyń szpiku im jest większa, tym dłuższy czas całkowitego przeżycia [0]. Wspomniani autorzy zauważyli, że w typach RA Angiogeneza w szpiku kostnym u chorych na zespoły mielodysplastyczne

i RARS średnica naczyń jest większa niż w pozostałych postaciach MDS. U chorych za szpikiem bogatokomórkowym stwierdziliśmy większe wartości MVD, nie były to jednak różnice istotne statystycznie. Podobne były obserwacje innych autorów [,]. Mało prawdopodobne jest, by wartość MVD w prosty sposób wynikała ze zwiększonej komórkowości szpiku. U chorych na przewlekłą białaczkę limfocytową stwierdzono wartości MVD mniejsze nawet niż w grupie kontrolnej, mimo że szpik u tych chorych był bogatokomórkowy []. W naszej pracy nie stwierdziliśmy żadnego związku między stężeniem VEGF w surowicy a MVD. Może to być następstwem tego, że wytwarzanie naczyń jest indukowane przez czynniki wydzielane miejscowo, czyli parakrynnie, i tylko w niewielkim stopniu osiągającym krążenie. Może to jednak wynikać również ze złożoności procesu angiogenezy, który jest uzależniony od wielu czynników angiogennych oraz receptorów, a wreszcie z faktu, że VEGF może być wiązany również przez inne komórki niż komórki śródbłonka, w tym przez megakariocyty i płytki krwi. Badana grupa chorych ( osób) mogła być zbyt mała, by można było wysnuć ostateczne wnioski. Doniesienia na temat VEGF są różne. Aguayo i wsp. stwierdzili zwiększone stężenia VEGF w osoczu chorych na MDS i AML; u chorych na AML stężenie VEGF w osoczu było niezależnym czynnikiem rokowniczym []. Z kolei Zorat i wsp. stwierdzili, że stężenia VEGF w surowicy chorych na MDS nie różniły się od wartości uzyskanych w grupie kontrolnej [5]. Wydaje się, że większą wartość może mieć badanie VEGF i jego receptorów w nadsączu pobranym z hodowli komórek szpiku.. Folkman J. Tumor angiogenesis: therapeutic implications. N Engl J Med. 7; 5: -7.. Ellis LM, Fiedler IJ. Angiogenesis and metastasis. Eur J Cancer. 6; 3A: 5-55. 3. Gasparini G. Clinical significance of the determination of angiogenesis in human breast cancer: update of the biological background and overview of the Vicenza studies. Eur J Cancer. 6; 3A: 5.. Graham CH, Rivers J, Kerbel RS, et al. Extent of vascularisation as a prognostic indicator in thin (<0,076 mm) malignant melanoma. Am J Pathol. ; 5: 50. 5. Weidner N, Carroll PR, Flax J, et al. Tumor angiogenesis correlates with metastasis in invasive prostate carcinoma. Am J Patol. 3; 3: 0. 6. Vacca A, Di Loreto M, Ribatti D, et al. Bone marrow of patients with active multiple myeloma. Angiogenesis and plasma cell adhesion molecules LFA-,VLA-, LAM- and CD. Am J Hematol. 5; 50: -. 7. Salven P, Teerenhovi L, Joensuu H. A high pretreatment serum vascular endothelial growth factor concetration is associated with poor outcome in non-hodgin s lymphoma. Blood. 7; 0: 367-37.. Bellamy WT, Richter L, Sirjani D, et al. Vascular endothelial cell growth factor is an autocrine promoter of abnormal localized immature myeloid precursors and leukemia progenitor formation in myelodysplastic syndromes. Blood. 00; 7: 7-3.. Aguayo A, Kantarjian HM, Estey EH, et al. Plasma vascular endothelial growth factor levels have prognostic significance in patients with acute myeloid leukemia but not in patients with myelodysplastic syndromes. Cancer. 00; 5: 3-30. 0. Korkolopoulou P, Apostolidou E, et al. Prognostic evaluation of the microvascular network in myelodysplastic syndromes. Leukemia. 00;5: 36-376.. Aguayo A, Kantarjian H, Manshouri T, et al. Angiogenesis in acute and chronic leukemias and myelodysplastic syndromes. Blood. 000; 6: 0-5.. Pruneri G, Bertolini F, Soligo D, et al. Angiogenesis in myelodysplastic syndromes. Br J Cancer. ; : 3-0. 3. Hussong JW, Rodgers GM, Shami PJ. Evidence of increased angiogenesis in patients with acute myeloid leukemia. Blood. 000; 5: 30-33.. Smolich BD, Yuem HE, West K, et al. The antiangiogenic protein kinase inhibitors SU56 and SU 666 inhibit the SCF receptor (c-kit) in human myeloid leukemia cell line and in acute leukemia blasts. Blood. 00; 7: 3-. 5. Zorat F, Shetty V, Dutt D, et al. The clinical and biological effects of thalidomide in patients with myelodysplastic syndromes. Br J Hematol. 00; 5: -. PODZIĘKOWANIA Autorzy dziękują profesorowi Wiesławowi Wiktorowi Jędrzejczakowi za krytyczną ocenę maszynopisu i pomoc w redagowaniu pracy. PIŚMIENNICTWO 50 POLSKIE ARCHIWUM MEDYCYNY WEWNĘTRZNEJ 007; 7 ()