ĆWICZENIA Z MIKROBIOLOGII DLA STUDENTÓW PIELĘGNIARSTWA

ZAKŁAD MIKROBIOLOGII FARMACEUTYCZNEJ I DIAGNOSTYKI MIKROBIOLOGICZNEJ Katedra Biologii i Biotechnologii Farmaceutycznej Wydziału Farmaceutycznego ĆWICZENIA Z MIKROBIOLOGII DLA STUDENTÓW PIELĘGNIARSTWA POD REDAKCJĄ ELIGII M. SZEWCZYK Łódź 2015

AUTORZY : Paweł Lisiecki Maria Sobiś-Glinkowska Marcin Ciszewski Eligia M. Szewczyk Wydanie pierwsze. ISBN: 978-83-939877-7-1

Spis treści Rozdział 1 Drobnoustroje i ich właściwości... 3 Rozdział 2 Podstawy identyfikacji drobnoustrojów dla celów klinicznych... 17 Rozdział 3 Mikrobiota człowieka a bakterie chorobotwórcze... 29 Rozdział 4 Znaczenie badań mikrobiologicznych dla leczenia zakażeń... 41 Rozdział 5 Sterylizacja, dezynfekcja i antyseptyka... 61 1

2

Rozdział 1 Drobnoustroje i ich właściwości Część teoretyczna Drobnoustroje, którymi zajmuje się mikrobiologia to organizmy, które widoczne są pod mikroskopem. Zaliczamy do nich wirusy, bakterie, archeony, grzyby mikroskopowe, liczne glony i pierwotniaki. Pod względem taksonomicznym klasyfikowane są do różnych domen świata żywego. Bakterie należą do domeny Bacteria, archeony do domeny Archea a grzyby, glony i pierwotniaki do domeny Eukarya. W zależności od budowy komórki drobnoustroje dzielimy na: prokariotyczne, do których należą bakterie i archeony i eukariotyczne, do których zaliczamy grzyby, glony i pierwotniaki. Podziałom tym nie podlegają wirusy, które nie mają organizacji komórkowej. Wśród drobnoustrojów dużą, choć niedominującą grupę stanowią te, które związane są z człowiekiem i mogą wywoływać u niego choroby. 1.1. Elementy budowy komórek bakterii Strukturami anatomicznymi występującymi w każdej komórce bakteryjnej są nukleoid, rybosomy, cytoplazma i błona cytoplazmatyczna. Rybosomy bakterii to ośrodki syntezy białek. Wykazują stałą sedymentacji 70S i składają się z dwóch podjednostek 30S i 50S. Mechanizm działania wielu antybiotyków stosowanych w leczeniu infekcji u ludzi polega na wiązaniu się ich z odpowiednim miejscem receptorowym na rybosomie, co skutkuje hamowaniem syntezy białek bakteryjnych. Większość bakterii ma ścianę komórkową, która między innymi decyduje o kształcie komórki. Różnice w budowie tej struktury pozwalają podzielić bakterie na dwie grupy: bakterie gramdodatnie i bakterie gramujemne. Ściana komórkowa bakterii gramdodatnich jest gruba i względnie jednorodna, zaś gramujemnych cienka i wielowarstwowa. Wspólnym składnikiem ściany obu tych grup bakterii jest polimer peptydoglikan (mureina), który 3

w większej ilości występuje u bakterii gramdodatnich. Mechanizm działania wielu antybiotyków polega właśnie na hamowaniu syntezy tej ważnej dla komórki bakteryjnej struktury. Polimerami związanymi ze ścianą komórkową tylko bakterii gramdodatnich są kwasy tejchojowe, a ze ścianą bakterii gramujemnych lipopolisacharyd (LPS). LPS to niebiałkowa toksyna bakterii i ich ważny czynnik chorobotwórczości, uwalniany z komórki w trakcie jej rozpadu. Jego aktywność biologiczna nie jest niszczona w procesie sterylizacji (jest termooporny). Wykazuje on działanie pirogenne i powoduje wstrząs septyczny, który występuje w przebiegu sepsy. Różnice w budowie ściany komórkowej bakterii wpływają na różnice w ich wrażliwości na antybiotyki, środki dezynfekcyjne i zdolność do przeżywania i rozprzestrzeniania się bakterii w środowisku szpitala czy ambulatorium. Niektóre gatunki bakterii wytwarzają otoczki, przetrwalniki, ziarnistości zapasowe oraz rzęski lub włókno osiowe, które warunkują ruch komórek. Obecność tych struktur można także wykorzystać w identyfikacji bakterii. Tworzone przez niektóre bakterie otoczki to najczęściej polisacharydowe polimery wydzielane na zewnątrz ściany komórkowej. Są one istotnym czynnikiem zjadliwości bakterii, nadającym ich komórkom silniejsze właściwości adhezyjne i chroniącym je przed aktywnością układu immunologicznego gospodarza. Przetrwalniki w odróżnieniu od komórek wegetatywnych bakterii charakteryzują się uśpionym metabolizmem i większą opornością na czynniki fizyko-chemiczne. Przetrwalniki mogą być tworzone pod wpływem niesprzyjających warunków środowiskowych. Wytworzony przetrwalnik zachowuje swoją żywotność, czyli zdolność do przejścia w komórkę wegetatywną przez długi czas. Proces przekształcania komórki wegetatywnej w przetrwalnik określany jest jako sporulacja. Jedna komórka wytwarza jeden przetrwalnik. Przetrwalniki tworzone są przez bakterie gramdodatnie. Z klinicznego punktu widzenia ważne są przetrwalniki laseczek z rodzaju Bacillus i Clostridium. Oporność przetrwalników wynika z ich unikatowej budowy: obecności płaszcza zewnętrznego i wewnętrznego, które decydują o oporności na czynniki chemiczne i kory, która wpływa na oporność na wysoką temperaturę. Nieprawidłowo przeprowadzone procedury dezynfekcji 4

i sterylizacji w szpitalu lub ambulatorium mogą nie niszczyć form przetrwalnych bakterii co skutkuje skażeniem środowiska i stwarza zagrożenie dla pacjentów. Ziarnistości zapasowe gromadzone są w cytoplazmie komórek. Mają one charakter polimerów, które syntetyzowane są w komórce w czasie jej wzrostu w warunkach nadmiaru substancji odżywczych, a zużywane w warunkach głodu. Wśród bakterii związanych z człowiekiem, najważniejsze są ziarnistości polimetafosforanowe (wolutyna) występujące u bakterii z rodzaju Corynebacterium, których obecność ma istotne znaczenie w identyfikacji ich gatunków. Niektóre bakterie wykazują zdolność poruszania się w środowisku płynnym, półpłynnym a nawet w cienkiej warstwie płynu na podłożu stałym. Warunkowane jest to obecnością rzęsek, które mają budowę białkową. Różnice w strukturze białek tworzących rzęski wykorzystuje się w identyfikacji serologicznej pałeczek z rodzaju Salmonella wywołujących u ludzi dur brzuszny lub inwazyjne zatrucia pokarmowe (toksykoinfekcje). Z medycznego punktu widzenia szczególnie niebezpieczną cechą bakterii jest zdolność do tworzenia biofilmu czyli rodzaju społeczności drobnoustrojów. Biofilm to zespół wzajemnie komunikujących się w mechanizmie quorumsensing komórek osiadłych na określonym podłożu, przylegających do siebie i osłoniętych macierzą zewnątrzkomórkową zbudowaną głównie z polisacharydów i białek. Biofilm może być tworzony w organizmie człowieka na powierzchni błon śluzowych oraz powierzchni tworzyw sztucznych i metali, z których wykonane są protezy i implanty, sztuczne zastawki czy cewniki. Może on być także tworzony na kamieniach moczowych lub żółciowych. Bakterie żyjące w biofilmie, w porównaniu z bakteriami z nim niezwiązanymi, charakteryzują się większą opornością na antybiotyki i środki dezynfekcyjne. Stwarza to ogromne problemy w leczeniu infekcji powodowanych przez bakterie tworzące biofilm. Utrudnia to także eliminację tak żyjących bakterii ze środowiska szpitalnego. 5

1.2. Oglądanie komórek drobnoustrojów Bakterie wykazują znaczną rozpiętość wymiarów. Wymiar większości komórek bakteryjnych wynosi 1-10 μm. Przeciętna długość komórki bakteryjnej to 1-5 μm, a średnica 1-2 μm. Komórki grzybów są większe od komórek bakteryjnych (2-40 μm). Wielkość komórek drożdży i grzybów drożdżopodobnych waha się zależnie od gatunku i warunków hodowli, od 2 do 8 μm średnicy i od 1 do 8 μm długości. Średnica komórki strzępki grzybów nitkowatych wynosi od 1 do 1,5 μm. Wielokomórkowe strzępki mogą być różnej długości, zarówno krótkie jak i dochodzące do kilku metrów. Małe rozmiary komórek bakterii i grzybów chorobotwórczych sprawiają, że do ich obserwacji wykorzystuje się mikroskop. W rutynowej pracy laboratorium mikrobiologicznego sprawdza się mikroskop świetlny z jasnym polem widzenia, dla oglądania bakterii wyposażony w obiektyw immersyjny, którego soczewki powiększają 100-krotnie i okulary o soczewkach powiększających 10-krotnie. W ten sposób powiększenie takiego mikroskopu jest 1000-krotne. Promienie świetlne, po przejściu przez szkiełko, na którym znajduje się rozmaz z drobnoustrojów, wpadając do warstwy powietrza ulegają załamaniu i większość z nich omijałaby soczewkę obiektywu immersyjnego. Aby temu zapobiec przestrzeń pomiędzy preparatem a obiektywem wypełnia się olejkiem immersyjnym, którego współczynnik załamania światła jest zbliżony do współczynnika załamania światła szkła. Zdolność rozdzielcza mikroskopu świetlnego (czyli wielkość obiektów, które można rozpoznać) w zależności od zastosowanej długości fali świetlnej waha się w granicach od 0,1 do 0,2 μm. Komórki grzybów można oglądać pod mniejszym powiększeniem (100-400-krotnym), które nie wymaga zastosowania olejku immersyjnego. Wirusy, których wielkość waha się od 18 do 600 nm można obserwować tylko w mikroskopie elektronowym, w którym zamiast wiązki światła wykorzystuje się wiązkę elektronów. Bezbarwność komórek bakterii oraz mała zdolność do załamywania światła wynikająca z podobnej do wody gęstości optycznej cytoplazmy sprawia, że bakterie w mikroskopie świetlnym ogląda się najczęściej w preparatach barwionych. 6

W preparatach barwionych lepiej można ocenić cechy morfologiczne komórek, takie jak wymiar, kształt, sposób układania się komórek i nieliczne struktury anatomiczne. Barwienie pozwala także na różnicowanie bakterii między sobą i odróżnienie ich od składników otoczenia, w którym się znajdują. Kształt bakterii może być kulisty, cylindryczny lub spiralny. Bakterie kuliste, nazywane także ziarenkowcami, mogą być ułożone pojedynczo lub tworzyć charakterystyczne układy komórek. Powstanie układów związane jest z płaszczyzną i liczbą podziałów poprzecznych komórek w trakcie ich rozmnażania oraz brakiem ich rozdziału po podziale. Wśród bakterii kulistych wyróżnić można: dwoinki i paciorkowce (Streptococcus), gronkowce (Staphylococcus). Wśród form cylindrycznych spotykamy: pałeczki (Bacterium), laseczki (Bacillus), maczugowce (Corynebacterium), prątki (Mycobacterium), wrzecionowce (Fusobacterium). Do bakterii spiralnych zaliczamy: przecinkowce (Vibrio) z sierpowato zagiętą komórką, śrubowce (Spirillum), które tworzą pełną spiralę, krętki (Borrelia, Treponema, Leptospira), różniące się między sobą liczbą skrętów, grubością komórki i wyglądem jej biegunów. Komórki drożdży mogą mieć kształt: kulisty lub elipsoidalny. Ich kształt nie jest cechą diagnostyczną, bo zależy od wieku komórki i warunków hodowli. Drożdże mogą tworzyć łańcuszki powstałe w wyniku podziału komórek - pączkowania. Komórki grzybów nitkowatych tworzą strzępki. W mikroskopie widoczne są one jako nitkowate, cylindryczne twory, proste lub rozgałęzione. U niektórych gatunków strzępki są jednokomórkowe, u innych poprzecznie porowate przegrody dzielą je na szereg komórek. Barwienie komórek bakterii metodą Grama jest metodą powszechnie wykorzystywaną w laboratoriach mikrobiologicznych. Jest to barwienie złożone, ponieważ wykorzystuje kilka barwników, jest też różnicujące, ponieważ pozwala dzielić bakterie na gramdodatnie i gramujemne, które w różny sposób reagują na barwniki wykorzystywane w tej metodzie. Komórki bakterii gramdodatnich barwią się na kolor fioletowy a komórki bakterii gramujemnych na kolor różowy. Do często używanych różnicujących bakterie metod barwienia należą także: metoda Ziehla-Neelsena pozwalającą barwić prątki (Mycobacterium), które są 7

kwasooalkoholooporne i metoda Neissera, uwidaczniająca polimetafosforanowe ziarnistości zapasowe maczugowców (Corynebacterium). Grzyby metodą Grama najczęściej barwią się na fioletowo, jednak metoda ta nie jest rekomendowana do wybarwiania ich komórek. W przypadku grzybów nitkowatych szerokie zastosowanie znajdują preparaty przyżyciowe w kropli spłaszczonej. Pozwalają one ocenić cechy mikroskopowe grzybni istotne z diagnostycznego punktu widzenia. 1.3. Hodowla drobnoustrojów Wzrost i rozmnażanie drobnoustrojów w warunkach naturalnych i w warunkach laboratoryjnych zależą od tych samych czynników. Skład wykorzystywanych podłoży i warunki hodowli powinny być możliwie najbardziej zbliżone do warunków naturalnych, w których żyją drobnoustroje. Hodowla drobnoustrojów zapewniająca szybkie i efektywne ich mnożenie wymaga spełnienia kilku warunków: obecności substancji pokarmowych w podłożu spełniających zapotrzebowania pokarmowe namnażanych drobnoustrojów, odpowiedniej wilgotności, ph i ciśnienia osmotycznego podłoża, właściwego składu atmosfery gazowej hodowli i temperatury hodowli. Podłoża hodowlane wykorzystywane w laboratorium muszą być także jałowe (sterylne). Jałowość oznacza, że pożywka jest pozbawiona wszelkich żywych organizmów, form wegetatywnych i przetrwalnych. Najczęściej jałowość podłoża uzyskuje się poddając je autoklawowaniu działaniu wysokiej temperatury w podwyższonym ciśnieniu. Warunki sterylizacji opisane są w rozdziale 5 tego skryptu. Bakterie różnią się wymaganiami pokarmowymi. Minimalne wymagania wzrostowe bakterii obejmują dostarczenie węgla, azotu, energii, wody oraz soli mineralnych. W zależności od potrzeb pokarmowych bakterii, związki chemiczne będące dla nich źródłem węgla, azotu i energii mogą mieć naturę organiczną lub nieorganiczną. Bakterie związane z ciałem człowieka i te powodujące infekcje, w sztucznej hodowli wymagają dostarczenia szeregu związków organicznych obecnych w składnikach podłoży, które stanowią ekstrakty mięsa czy drożdży. Najczęściej źródłem węgla i energii są dla nich 8

węglowodany, a źródłem azotu aminokwasy czy peptydy. Wiele z nich jest auksotrofami i wymaga dodatku witamin, surowicy lub bardziej złożonych związków. Wzrost drobnoustrojów zależny jest także od obecności soli mineralnych. Jony Mg 2+, Fe 2+, Ca 2+, Mn 2+, Zn 2+ są aktywatorami niektórych reakcji enzymatycznych lub grupami prostetycznymi enzymów. Utrzymywanie odpowiedniego ph podłoża podczas hodowli drobnoustrojów ma także duże znaczenie. Dla rozwoju większości bakterii optymalne ph pożywki wynosi 7,2-7,4 czyli takie jak płynów ustrojowych człowieka - krwi i limfy. Niektóre bakterie ewolucyjnie przystosowały się do mnożenia w warunkach ph kwaśnego wynoszącego 4-5 co umożliwia im życie np. w żołądku lub pochwie. Komercyjnie dostępne są częściowo przygotowane pożywki w postaci odwodnionych granulatów ewentualnie proszków, z których należy przygotować pożywkę. Jednak nieliczne diagnostyczne laboratoria mikrobiologiczne przygotowują je we własnym zakresie. Gotowe jałowe podłoża mikrobiologiczne są przygotowywane przez wyspecjalizowane firmy. Każda seria pożywki zamawiana przez laboratorium posiada certyfikat, w którym wytwórca potwierdza jej jakość. Drobnoustroje w warunkach laboratoryjnych hodujemy na stałych lub w płynnych pożywkach, które umieszczone zostały w naczyniach hodowlanych (płytki Petriego, kolby Erlenmayera, probówki). Konsystencję stałą podłoża uzyskuje się przez dodanie agaru, który nie stanowi źródła pokarmu dla bakterii. Podłoża stałe, najczęściej w postaci płytek są częściej wykorzystywane w rutynowej diagnostyce mikrobiologicznej niż podłoża płynne. Z praktycznego punktu widzenia przydatny jest podział podłoży ze względu na ich zastosowanie. Pod tym względem podłoża dzielimy na: namnażające lub namnażająco-wybiórcze, wybiórcze (selektywne), diagnostyczne (różnicujące) i transportowe. Znajomość cech podłoży odpowiednich dla danych drobnoustrojów i umiejętność wyboru właściwych podłoży dla posiewu określonych materiałów klinicznych jest niezwykle ważna dla prawidłowego przeprowadzenia diagnostyki mikrobiologicznej. O niektórych związanych z nią aspektach będzie mowa w dalszych rozdziałach. 9

Temperatura hodowli to kolejny czynnik determinujący wzrost drobnoustrojów. Bakterie mogą namnażać się w szerokim zakresie temperatur. Dla pełnej aktywności enzymów biorących udział w procesach metabolicznych komórek wymagana jest ich optymalna temperatura wzrostu. Większość bakterii związanych z człowiekiem to mezofile (tabela 1.1). Tabela 1.1. Wpływ temperatury na wzrost bakterii Grupa Temperatura wzrostu bakterii Mezofile Rosną w zakresie temperatur 25-40 C. Optymalna temperatura wzrostu 37 C (temperatura ciała człowieka). Psychrofile Rosną dobrze w temperaturze 20 C, ale mogą namnażać się w temperaturze 0 C. Termofile Najlepiej rosną w temperaturze 55-80 C. Krótka charakterystyka Do tej grupy należy większość bakterii powodujących infekcje u ludzi. Rozwijają się w warunkach chłodniczych w nieprawidłowo przechowywanej żywności. Powodują jej psucie i mogą być przyczyną infekcji u ludzi. Żyją w glebie, w kompoście, nawozach organicznych, wodach termalnych. Enzymy niektórych gatunków są wykorzystywane w biologii molekularnej. Istotnym czynnikiem warunkującym rozwój bakterii jest też tlen. Pod względem zapotrzebowania na tlen bakterie związane z człowiekiem różnią się znacznie, ale większość z nich to względne beztlenowce lub mikroaerofile (tabela 1.2). Najwięcej problemów w warunkach laboratoryjnych stwarza hodowla bakterii bezwzględnie beztlenowych. Powszechnie wykorzystuje się słoje lub worki do hodowli bakterii beztlenowych, w których atmosferę wolną od tlenu uzyskuje się na drodze reakcji chemicznej wkładając do ich wnętrza specjalne saszetki inicjujące ten proces. 10

Tabela 1.2. Wymagania tlenowe bakterii Grupa bakterii Krótka charakterystyka Bezwzględne Mnożą się tylko w obecności tlenu. Wytwarzanie energii tlenowce u tej grupy bakterii zależne jest od tlenu cząsteczkowego, który jest końcowym akceptorem elektronów w łańcuchu Bezwzględne beztlenowce Względne beztlenowce Mikroaerofile oddechowym. Nie mogą rosnąć w obecności tlenu. Nie mają katalazy, peroksydazy, dysmutazy nadtlenkowej lub wszystkich trzech enzymów. Niektóre bakterie z tej grupy mogą rosnąć w obecności tlenu tylko w warunkach obniżonego potencjału oksydacyjno-redukcyjnego. Mnożą się zarówno w obecności tlenu jak i przy jego braku. Produkują energię w procesie oddychania tlenowego lub procesie fermentacji, który jest niezależny od tlenu. Mnożą się najlepiej w warunkach obniżonego stężenia tlenu (< 20%) Grzyby to heterotrofy wymagające do wzrostu związków organicznych. Podłoża wykorzystywane do ich hodowli zawierają duże stężenia węglowodanów, które są dobrze tolerowane przez ich komórki i mają niższe niż dla bakterii ph. Grzyby to mezofile, ale dla większości optymalną temperaturą wzrostu jest 25-30 C. Hodowle grzybów prowadzimy w warunkach tlenowych. Czas potrzebny na wyhodowanie bakterii na pożywce tak, aby ich wzrost był widoczny gołym okiem zależy od rodzaju podłoża wzrostowego oraz warunków hodowli. Dla większości bakterii chorobotwórczych wynosi on 18-24 godziny, ale prątki gruźlicy wymagają hodowli przez kilka tygodni. Bakterie rosnące na pożywce stałej lub płynnej stanowią hodowlę. Na podłożach płynnych bakterie rosną najczęściej w postaci jednolitego zmętnienia. Bardzo częstym celem posiewu na podłoża stałe umieszczone w płytkach Petriego jest uzyskanie wzrostu w postaci pojedynczych kolonii. Kolonią nazywamy widoczne makroskopowo na powierzchni lub w głębi pożywki stałej skupisko bakterii wyrosłe z jednej komórki lub jednej jednostki wzrostowej (nierozłączonego po podziale skupiska lub przetrwalnika). 11

Kolonię uważa się zatem za odpowiednik jednej komórki bakterii lub jednostki wzrostowej i zasadę tę wykorzystuje się w określaniu ich liczby (np. w moczu). Mówimy wtedy o jednostkach tworzących kolonie w skrócie jkt, czasem z angielskiego CFU colony forming units. W stałych warunkach hodowli kolonie charakteryzują się względnie stałymi cechami: wymiarem, kształtem, zabarwieniem. W opisie morfologii kolonii zwracamy także uwagę na: brzeg kolonii, wzniesienie i powierzchnię kolonii a także zmiany wokół niej. Hodowla grzybów chorobotwórczych musi być prowadzona dla grzybów drożdżopodobnych przez 48-72 godziny, ale grzyby pleśniowe wymagają hodowli przez 1-2 tygodnie. Wirusy są bezwzględnymi pasożytami wewnątrzkomórkowymi i nie można ich hodować na sztucznych pożywkach bezkomórkowych, a jedynie w żywych komórkach. Wirusy chorobotwórcze dla człowieka w warunkach laboratoryjnych namnaża się w komórkach specjalnie prowadzonych hodowli tkanek zwierzęcych lub nowotworowych. Metody Przygotowanie rozmazów do preparatów trwałych Rozmazy z bakterii wykonuje się na odtłuszczonych w płomieniu palnika szkiełkach podstawowych. Jeśli sporządza się rozmaz z bakterii zebranych z hodowli stałej, na szkiełko należy nanieść 1 oczko ezy wody, a następnie zawiesić w niej bardzo niewielką ilość zebranej ezą masy bakteryjnej. Powstała zawiesina powinna lekko opalizować. Nie może być ona zbyt gęsta, gdyż nie uzyskamy wtedy obrazu pojedynczych komórek, co jest warunkiem prawidłowej oceny ich morfologii. Przygotowane rozmazy suszy się w powietrzu lub w strumieniu ciepłego powietrza, trzymając szkiełko w palcach nad palnikiem. Utrwalenie preparatu osiąga się przez trzykrotne przeciągnięcie spodu szkiełka przez płomień palnika. Można też zalać szkiełko np. alkoholem metylowym i pozostawić do jego całkowitego odparowania. 12

W trakcie wykonywania rozmazu wszystkie czynności należy wykonywać w pobliżu palnika, pamiętając o opalaniu ezy i wylotów probówek w trakcie pobierania materiału. Barwienie metodą Grama Barwienie metodą Grama jest podstawowym barwieniem różnicującym stosowanym w mikrobiologii, dzielącym bakterie na dwie grupy: gramdodatnie i gramujemne. W metodzie tej wykorzystuje się kolejno następujące odczynniki: - barwnik podstawowy fenolowy roztwór fioletu krystalicznego (gencjana); - zaprawę w postaci roztworu jodu w jodku potasu (płyn Lugola); - odbarwiacz alkohol etylowy; - barwnik kontrastowy alkoholowo-wodny roztwór fuksyny zasadowej (fuksyna 1:10) lub safranina. Wykonanie barwienia - Na utrwalony preparat należy nalać świeżo przesączony przez bibułę roztwór gencjany na 2 minuty; - preparat spłukać wodą; - nalać płyn Lugola na 1 minutę; - spłukać wodą; - odbarwiać alkoholem przez 15-20 sekund; - spłukać wodą; - dobarwić przez zalanie na 20 sekund roztworem fuksyny; - spłukać wodą; - osuszyć lekko odciskając w bibule. Wynik barwienia: Bakterie gramdodatnie fioletowogranatowe, gramujemne - różowe. O wyniku barwienia w metodzie Grama decyduje grubość warstwy peptydoglikanu ściany komórkowej. Warstwa peptydoglikanu bakterii gramdodatnich jest grubsza niż u bakterii gramujemnych. Fiolet krystaliczny przedostaje się do wnętrza komórki i łącząc się z jodem tworzy nierozpuszczalny w wodzie kompleks, który zabarwia ją na kolor fioletowy. Alkohol stosowany jako odbarwiacz, rozpuszcza błonę cytoplazmatyczną 13

bakterii gramdodatnich oraz błonę cytoplazmatyczną i błonę zewnętrzną bakterii gramujemnych. Powoduje on również odwodnienie peptydoglikanu, uszczelniając w ten sposób ścianę komórkową. Grupa warstwa peptydoglikanu bakterii gramdodatnich skutecznie zatrzymuje barwny kompleks jodu z fioletem krystalicznym, który przez cienką warstwę peptydoglikanu bakterii gramujemnych wydostaje się na zewnątrz. Fuksyna jako barwnik kontrastowy zabarwia komórki bakterii gramujemnych na różowo. Mikroskopowanie preparatów barwionych Oglądanie bakterii w preparatach barwionych wymaga zastosowania obiektywu immersyjnego i olejku immersyjnego, w którym należy zanurzyć soczewkę obiektywu przed przystąpieniem do ich oglądania. Promienie świetlne po przejściu przez szkło preparatu, wpadając do warstwy powietrza, ulegają załamaniu i większość z nich omijałaby soczewkę obiektywu immersyjnego. Wykorzystanie olejku immersyjnego niweluje to niekorzystne zjawisko. Po zakończeniu mikroskopowania z obiektywu należy usunąć pozostałości olejku bawełnianą szmatką. W przypadku zaschnięcia olejku na obiektywie, co grozi jego uszkodzeniem, usuwamy olejek specjalnym zmywaczem. Na jakość obrazu, jaki uzyskujemy w mikroskopie istotny wpływ ma oświetlenie oglądanego preparatu. Posługując się światłem dziennym, należy zastosować lusterko płaskie, a przy świetle sztucznym lusterko wklęsłe. Preparaty trwałe należy oglądać przy maksymalnie podniesionym kondensorze. 14

Zadania do wykonania Zadanie 1. Przygotowanie i barwienie preparatów Otrzymujesz hodowlę stałą Pseudomonas aeruginosa lub Staphylococcus aureus na płytce Petriego. Bakterie posiane zostały w sposób pasmowy. - Wykonaj preparat z hodowli jednego z tych drobnoustrojów i zabarw go metodą Grama. - Nastaw i obejrzyj go pod mikroskopem wykorzystując obiektyw immersyjny. Narysuj obraz mikroskopowy. - Określ powiększenie oglądanego preparatu, kształt i sposób układania się komórek bakteryjnych. - Czy badane przez ciebie drobnoustroje to bakterie gramdodatnie czy gramujemne? 15

16

Rozdział 2 Podstawy identyfikacji drobnoustrojów dla celów klinicznych Część teoretyczna Materiał kliniczny, który trafia bo pracowni mikrobiologicznej laboratorium diagnostycznego może być badany różnymi technikami i dlatego niezwykle ważny jest opis w dokumentacji wskazujący oczekiwany, wynikający z obserwacji klinicznych kierunek badań. Ważny jest wiek pacjenta i informacja o przyjmowanych lekach przeciwdrobnoustrojowych. Badane materiały przesyłane są czasem w podłożu transportowym. Podłoża transportowe pozwalają na utrzymanie żywotności drobnoustrojów pobranych od pacjentów w szpitalu lub ambulatorium podczas ich transportu do laboratorium mikrobiologicznego. Nie zawierają one składników stymulujących wzrost drobnoustrojów. Niekiedy badane próbki (krew, płyn mózgowo-rdzeniowy) trafiają do laboratorium już w podłożu namnażającym o specjalnie dobranym składzie, które dostarczono wcześniej na oddział. Wybór podłoża posiewowego ma kluczowe znaczenie. Początkowym etapem identyfikacji bakterii podejrzanych o wywołanie infekcji, jest zwykle zbadanie cech morfologicznych komórek i ich zdolności do barwienia się metodą Grama. Determinuje to wybór podłoży hodowlanych, na które w następnym etapie badań posiane zostaną próbki (tabela 2.1). 17

Tabela 2.1. Podstawowe podłoża hodowlane wykorzystywane w laboratoriach mikrobiologicznych Nazwa podłoża Typ podłoża Zastosowanie Podłoża stałe Agar odżywczy Agar z krwią Podłoże Chapmana Agar czekoladowy Podłoże MacConkey a Agarowe podłoże Muellera-Hinton Agarowe podłoże Sabouraud Bulion odżywczy Płynne podłoże Sabouraud Woda peptonowa z 1% dodatkiem cukru Podłoże namnażające Podłoże namnażające i diagnostyczne Podłoże diagnostycznowybiórcze Podłoże namnażające Podłoże diagnostycznowybiórcze Podłoże namnażające Podłoże namnażające Podłoża płynne Podłoże namnażające Podłoże namnażające Podłoże diagnostyczne Podłoże ogólnego stosowania. Umożliwia wzrost większości bakterii. Podłoże zawierające krew baranią. Najpowszechniej wykorzystywane podłoże wzrostowe. Umożliwia wzrost większości bakterii w tym tych o dużych wymaganiach pokarmowych. Pozwala badać cechy hemolityczne bakterii. Podłoże dla bakterii z rodzaju Staphylococcus. Pozwala zbadać zdolność do rozkładu mannitolu. Podłoże zawierające termicznie zdenaturowaną krew baranią. Dedykowane szczególnie bakteriom z rodzaju Haemophilus i Neisseria, które charakteryzują się dużymi wymaganiami pokarmowymi. Służy do izolacji pałeczek gramujemnych szczególnie z rodziny Enterobacteriaceae. Pozwala badać ich zdolność do rozkładu laktozy. Powszechnie wykorzystywane do badania wrażliwości drobnoustrojów na antybiotyki i chemioterapeutyki metodą dyfuzyjnokrążkową. Podłoże dedykowane grzybom. Uzupełnienie podłoża antybiotykami przeciwbakteryjnymi i obniżenie ph czyni je wybiórczym dla grzybów. Podłoże ogólnego stosowania. Umożliwia wzrost większości bakterii. Podłoże dedykowane grzybom. Podłoże do badania zdolności rozkładu cukrów przez bakterie o małych wymaganiach pokarmowych. 18

Podstawą diagnostyki jest posiew na podłoża stałe w postaci płytek, na których można ocenić morfologię kolonii a tym samym różnorodność obecnych w materiale bakterii oraz zdecydować o dalszym postępowaniu. Techniką mikrobiologiczną pozwalająca uzyskać wzrost bakterii w postaci pojedynczych kolonii jest posiew redukcyjny. Hodowla na pierwszym podłożu, po posiewie materiałów pobranych z okolic ciała naturalnie skolonizowanych bakteriami (np. gardło, skóra) jest zazwyczaj hodowlą mieszaną i zawiera wiele różnych kolonii. Pomocne w ograniczeniu wzrostu na takich płytkach kolonii bakterii nie będących czynnikiem etiologicznym infekcji są podłoża diagnostyczno-wybiórcze lub wybiórcze. Posiew redukcyjny próbek na kolejne podłoża stałe pozwala uzyskać czystą hodowlę patogenu, co jest niezbędnym warunkiem zakończenia jego identyfikacji poprzez zbadanie jego właściwości biochemicznych i określenie wrażliwości na antybiotyki i chemioterapeutyki. W identyfikacji wielu gatunków bakterii istotne znaczenie mają ich własności hemolityczne, które można zauważyć już na wczesnym etapie diagnostyki po posiewie na podłoże diagnostyczno-namnażające jakim jest agar z krwią baranią i określić typ hemolizy α, β lub jej brak. Powszechnie w identyfikacji patogenów bakteryjnych bada się ich właściwości biochemiczne. Wykorzystuje się przede wszystkim reakcje kataboliczne zachodzące w komórkach, a więc zdolność rozkładu szeregu substratów, uzależnioną od obecności odpowiednich enzymów. Określamy w ten sposób charakterystyczny profil biochemiczny drobnoustroju. Różnice w aktywności enzymatycznej pozwalają na odróżnienie rodzajów, gatunków a nawet szczepów bakterii w obrębie gatunku. W praktyce określa się następujące właściwości biochemiczne bakterii: związane z metabolizmem azotowym (badanie zdolności rozkład białek i aminokwasów), związane z metabolizmem węglowodanowym (badanie zdolności rozkład cukrów i szlaków ich rozkładu), związane z metabolizmem lipidowym (badanie rozkładu lipidów) i związane z procesami oddechowymi komórki (wykrywanie enzymów redukująco-utleniających). Identyfikację biochemiczną prowadzi się w oparciu o wiele, zwykle kilkanaście prób, które dobrane zostały pod kątem identyfikacji określonych bakterii. Podłoża wykorzystywane w określaniu właściwości biochemicznych należą do grupy pożywek diagnostycznych. 19

W celu przyspieszenia procesu identyfikacji w laboratoriach mikrobiologicznych stosowane są gotowe, standaryzowane numeryczne zestawy testów biochemicznych. W Polsce i Europie powszechnie wykorzystywany jest francuski system API. Testy te mają postać paska z tworzywa sztucznego z przezroczystymi pojemniczkami wypełnionymi substratami dla enzymów i wskaźniki reakcji biochemicznej, których zestaw umożliwia identyfikację danej grupy bakterii. Po posianiu testu zawiesiną badanego szczepu i inkubacji, analizujemy zmianę barwy zawartości pojemniczków. Odnotowujemy je na numerycznej karcie odczytowej testu. Otrzymany w ten sposób numeryczny profil drobnoustroju porównujemy z numerycznymi profilami szczepów wzorcowych danego gatunku. Możemy tego dokonać przy użyciu książki kodów lub skorzystać z internetowych baz danych udostępnianych przez producenta testów. Stopień zgodności pomiędzy profilami zwykle umożliwia zidentyfikowanie badanego szczepu do poziomu gatunku. W niektórych przypadkach wykorzystanie podłoży chromogennych może przyspieszyć diagnostykę. Podłoża chromogenne pozwalają wykrywać aktywność enzymatyczną drobnoustrojów. W zależności od produkowanych enzymów drobnoustroje rosnące w płytkach z podłożem chromogennym rozkładają odpowiednie substraty chromogenne, co powoduje zabarwienie rosnących kolonii na odpowiednie kolory. Zastosowanie tej metody nie zwalnia jednak laboratorium z konieczności wykonania przynajmniej jednego testu diagnostycznego charakterystycznego dla zidentyfikowanego na podłożu chromogennym patogenu. Coraz większe zastosowanie w identyfikacji czynników etiologicznych infekcji u ludzi znajdują szybkie testy immunochromatograficzne. W Polsce ciągle jeszcze zbyt rzadko wykorzystywane. Mogą być one bezpośrednio wykonywane przy łóżku pacjenta przez lekarza lub personel pielęgniarski. Są one dobrym narzędziem wspomagającym szybkie postawienie diagnozy i wszczęcie właściwego leczenia. Można nimi diagnozować zakażenia bakteryjne, wirusowe i grzybowe. W testach immunochromatograficznych wykorzystywane są znakowane przeciwciała monoklonalne skierowane przeciwko specyficznym antygenom drobnoustrojów. Typowe, dostępne komercyjne testy mają najczęściej postać plastikowych kasetek. Na powierzchni kasetki znajduje się okienko do nanoszenia badanej próbki. Wewnątrz płytki znajduje się specjalna membrana i znakowane przeciwciała. 20

Zasada działania testu polega na przemieszczaniu się wykrywanego antygenu wzdłuż membrany. W czasie tej wędrówki tworzy się kompleks antygenu ze znakowanymi przeciwciałami. Wizualnym efektem powstania takiego kompleksu jest pojawienie się dwóch kolorowych kresek. Powstanie tylko jednej kreski świadczy o braku poszukiwanego antygenu. Test można wykonać korzystając z wymazów z gardła, z pochwy, z próbki kału, moczu czy płynów ustrojowych człowieka krwi, płynu mózgowo-rdzeniowego. Odczyny serologiczne to ważna grupa metod, które wykorzystuje się w identyfikacji czynników etiologicznych zakażeń u ludzi. Przy ich pomocy można stwierdzić obecność albo ocenić wzrost miana swoistych przeciwciał w surowicy pacjenta, które zostały wytworzone w odpowiedzi na kontakt układu immunologicznego z określonym patogenem. Wykorzystuje się je przede wszystkim do identyfikacji patogenów bakteryjnych, których hodowla w warunkach laboratoryjnych jest trudna albo niemożliwa, a także, szeroko, w diagnostyce wirusologicznej. W diagnostyce serologicznej infekcji najszersze zastosowanie znajduje odczyn immunoenzymatyczny (ELISA ang. enzyme linked immunosorbent assay) wykorzystujący antygeny lub przeciwciała znakowane znacznikiem w postaci aktywnego enzymu. Enzymy te katalizują reakcje, których produkt, przy odpowiednim doborze substratu (zwanego chromogenem), jest barwny. Pozwala to zauważyć wiązanie przeciwciał z antygenami, a także określić ich ilość, gdyż natężenie barwy jest wprost proporcjonalne do stężenia enzymu. Odczyn jest bardzo czuły, pozwala na oznaczenia ilościowe, jest w pełni zautomatyzowany, co znacznie przyspiesza diagnostykę. Metodami serologicznymi możemy także wykrywać cechy antygenowe bakterii. Najszersze zastosowanie znajduje odczyn aglutynacji szkiełkowej wykorzystywany w identyfikacji bakterii z rodzaju Salmonella i Shigella. Antygenami w tym odczynie są całe komórki bakterii, które łączymy z surowicami zawierającymi specyficzne przeciwciała. O komplementarności antygenu z przeciwciałem świadczy zlepianie się komórek, co można łatwo zaobserwować gołym okiem. Testy lateksowe to także skuteczne narzędzie w procesie identyfikacji bakterii. Wykorzystujemy w nich cząsteczki lateksu, którymi opłaszczono przeciwciała monoklonalne, skierowane przeciwko specyficznym antygenom drobnoustrojów. W teście wykorzystuje się całe komórki bakterii lub roztwory 21

wyekstrahowanych wcześniej antygenów. Można też tą techniką poszukiwać rozpuszczalnych antygenów bakterii w hodowlach czy płynach ustrojowych (płyn mózgowo-rdzeniowy). Powstanie komplementarnego kompleksu antygen-przeciwciało manifestuje się zlepianiem cząstek lateksu, co można łatwo zaobserwować gołym okiem. W różnicowaniu drożdży i grzybów drożdżopodobnych wykorzystuje się przede wszystkim ich cechy metaboliczne: zdolność przyswajania węgla lub azotu z różnych źródeł. Dla zbadania tej cechy wykonuje się auksanogram. Wykorzystuje się też ich zdolność do fermentacji rożnych węglowodanów co badamy w teście określanym jako zymogram. W identyfikacji grzybów nitkowatych badanie ich właściwości metabolicznych nie ma większego znaczenia. Różnicuje się je na podstawie cech mikroskopowych grzybni oraz hodowli i ocenie wyglądu makroskopowego grzybni. Nową grupą metod pozwalającą identyfikować drobnoustroje są techniki oparte na identyfikacji kwasów nukleinowych. Znajdują one coraz szersze zastosowanie w rutynowej diagnostyce zakażeń bakteryjnych, grzybowych i wirusowych. Pozwalają identyfikować DNA patogenów bezpośrednio w materiale pobranym od pacjenta lub po ich namnożeniu. Dostępność wielu gotowych do zastosowania komercyjnych zestawów znacznie zwiększyła wykorzystanie tych metod. Najbardziej użyteczną metodą jest technika łańcuchowej reakcji polimerazy PCR. Technika ta pozwala na powielenie (amplifikację) specyficznej dla danego patogenu sekwencji DNA, która znajduje się w jego genomie. W tym celu wykorzystuje się tak zwane startery, które są krótkimi jednoniciowymi fragmentami DNA, komplementarnym do sekwencji poszukiwanej. Po przyłączeniu się starterów, polimeraza DNA wydłuża każdy ze starterów dobudowując drugą nić DNA na nici matrycowej, do której dołączył się starter. Cały proces zachodzi w termocyklerze, w którym programuje się temperaturę i czas trwania poszczególnych etapów reakcji oraz liczbę cykli. Powielone w reakcji PCR fragmenty DNA analizuje się następnie rozdzielając je elektroforetycznie w żelu agarozowym. Takie techniki stają się już standardem w dobrych laboratoriach diagnostycznych. 22

Metody Posiewy na podłoża Posiewu na podłoża stałe w płytkach Petriego dokonuje się w różny sposób zależnie od celu takiego posiewu. Ważnym, bardzo często stosowanym przy izolacji i identyfikacji bakterii sposobem, prowadzącym do otrzymania pojedynczych kolonii jest posiew redukcyjny. Posiew ten wykonujemy tak, aby w kolejnych sektorach na powierzchni płytki znajdowało się coraz mniej bakterii. W poszczególnych etapach posiewu raz naniesiony materiał jest rozprowadzany na kolejne sektory płytki. Każdorazowe opalanie ezy przed rozsianiem bakterii w kolejnych strefach powoduje redukcję ich liczby do takiej ilości, przy której w ostatniej strefie uzyskany zostanie wzrost w postaci pojedynczych kolonii (Ryc. 1). Czasem istnieje potrzeba zasiania całej powierzchni płytki i uzyskania wzrostu w postaci jednolitej murawy. Takiego posiewu można dokonać wacikiem (tzw. wymazówką). Inokulum (porcję zakażającą) stanowi zwykle próbka pobrana nim z podłoża płynnego, którą rozprowadza się równomiernie na powierzchni podłoża w płytce. Taki typ posiewu znajduje zastosowanie w badaniu wrażliwości bakterii na antybiotyki i chemioterapeutyki metodą dyfuzyjno-krążkową. Ryc. 1. Schemat wykonania posiewu redukcyjnego 23

Morfologia kolonii W opisie morfologii kolonii, który wykorzystywany jest do celów diagnostycznych należy wziąć pod uwagę następujące jej elementy: - wielkość - średnica (mm); - kształt - okrągła, owalna, nitkowata, rozgałęziona nieregularna,..; - brzeg - równy, postrzępiony, falisty, ząbkowany,... ; - powierzchnię - gładka, lśniąca, matowa, pomarszczona, grudkowata,... ; - wzniesienie (profil kolonii) - płaska, wypukła, pępkowata, wrastająca w podłoże,... ; - przejrzystość - przezroczysta, opalizująca, mętna,... ; - barwę - biała, kremowa, szara, czerwona,... ; - otoczenie kolonii - zabarwienie, zmiana cech podłoża. KSZTAŁT KOLONII MORFOLOGIA KOLONII okrągła nieregularna nitkowata rozgałęziona promienisty POWIERZCHNIA gładka PROFIL KOLONII nitkowata szorstka nieregularna pofałdowana wypukła płaska soczewkowata pępkowata wrastająca w podłoże Ryc. 2. Cechy morfologiczne kolonii bakteryjnych 24

Badanie właściwości biochemicznych bakterii Do grupy licznych enzymów, których obecność u bakterii ma istotne znaczenia diagnostyczne należą katalaza i oksydaza cytochromowa. Wykrywa się je w prosty sposób a wynik oznaczeń uzyskujemy w czasie krótszym niż 1 minuta. Katalaza to enzym szeroko rozpowszechniony wśród bakterii. Występuje ona u większości bakterii tlenowych i względnie beztlenowych i niektórych beztlenowców. Enzym ten rozkłada toksyczny dla bakterii nadtlenek wodoru (H 2 O 2 ) do wody i tlenu. Badanie w kierunku obecności katalazy jest szczególnie przydatne w różnicowaniu ziarenkowców i pałeczek gramdodatnich. W rutynowej diagnostyce bardzo często obecność tego enzymu wykorzystuje się w odróżnianiu gronkowców (Staphylococcus) od paciorkowców (Streptococcus). Oksydaza cytochromowa to końcowy enzym łańcucha oddechowego u bakterii oddychających tlenowo. Przenosi ona elektrony na tlen atmosferyczny z wytworzeniem wody. Próba na obecność tego enzymu ma duże znaczenie w różnicowaniu wielu grup bakterii w tym z rodziny Enterobacteriaceae zwyczajowo określanych jako pałeczki jelitowe, które są oksydazoujemne. Zadania do wykonania Zadanie 1. Charakterystyka kolonii bakteryjnej - Obejrzyj płytkę z podłożem agarowym, na której wyrosły pojedyncze kolonie. Powstały one w wyniku rozmnożenia się komórek bakterii i przetrwalników, które opadły na podłoże (sedymentowały) z powietrza. - Wybierz jedną kolonię i opisz ją uwzględniając wszystkie jej cechy. Opis kolonii: 25

Zadanie 2. Posiew redukcyjny Otrzymujesz hodowlę stałą bakterii na płytce Petriego. Drobnoustrój posiany został w sposób pasmowy, w którym nie można zaobserwować pojedynczych kolonii i zbadać czystości badanej hodowli. - Materiał z otrzymanej hodowli posiej redukcyjnie na płytkę agarową. - Podpisz płytkę, inkubuj w cieplarce (37 C, 24 godziny). - Obejrzyj posiew zwracając szczególną uwagę na pojedyncze kolonie w trzeciej i czwartej strefie posiewu. - Opisz każdy z widocznych rodzajów kolonii. - Oceń czy badana przez ciebie próbka bakterii była hodowlą czystą czy mieszaną. Opisy kolonii: 26

Zadanie 3. Wykrywanie obecności katalazy Otrzymujesz hodowlę stałą Staphylococcus epidermidis na płytce Petriego. Drobnoustrój posiany został w sposób pasmowy. - Na środek szkiełka podstawowego nanieś kroplę 3% wody utlenionej. - Za pomocą ezy zawieś badane bakterie w odczynniku. - Zaobserwuj wydzielanie się pęcherzyków tlenu, które świadczy o próbie dodatniej. Zadanie 4. Wykrywanie obecności oksydazy cytochromowej Otrzymujesz hodowlę stałą Pseudomonas aeruginosa na płytce Petriego. Drobnoustrój posiany został w sposób pasmowy. - Nalej na wyrosłe bakterie kroplę odczynnika 1 % wodny roztwór chlorowodorku tertrametylo-p-fenylenodiaminy. - Pojawienie się w ciągu 1 minuty granatowego zabarwienia bakterii świadczy o obecności enzymu powstaje błękit indolofenolowy. 27

28

Rozdział 3 Mikrobiota człowieka a bakterie chorobotwórcze Część teoretyczna 3.1. Bakterie zasiedlające ciało zdrowego człowieka Organizm człowieka zasiedlają bardzo liczne drobnoustroje. Ich liczba wielokrotnie przewyższa liczbę komórek ciała. Drobnoustroje normalnie kolonizujące organizm człowieka nazywane były do niedawna jego normalną lub fizjologiczną (mikro)florą. Ta zwyczajowa nazwa pochodzi jeszcze z czasów, gdy bakterie i grzyby zaliczane były do roślin. Obecnie drobnoustroje te określa się mianem mikrobiota, które powoli wypiera stare określenie flora. Bakterie na naszym ciele żyją tylko w niektórych jego rejonach, są obecne na skórze, w przewodzie pokarmowym, na błonach śluzowych jamy ustnej, górnych dróg oddechowych, narządów moczowo-płciowych i spojówkach. Zasiedlanie ciała człowieka przez drobnoustroje zaczyna się w chwili narodzin. Przewód pokarmowy Najwięcej drobnoustrojów kolonizuje błony śluzowe przewodu pokarmowego (do 10 12 jtk/g treści jelitowej). Metodami genetycznymi zidentyfikowano wśród nich kilkaset gatunków, z których większości nie udało się wyhodować. W początkowych odcinkach przewodu pokarmowego przełyku, żołądku, dwunastnicy i początkowym odcinku jelita cienkiego panują warunki niesprzyjające bytowaniu bakterii: niskie ph, szybka perystaltyka jelit, obecność żółci i enzymów trzustkowych. Drobnoustroje zasiedlają dopiero końcowe odcinki przewodu pokarmowego, pojawiają się w końcowym odcinku jelita cienkiego, licznie występują w jelicie krętym i najliczniej w jelicie grubym. 29

Właściwy skład mikrobiota przewodu pokarmowego ma istotny wpływ na funkcjonowanie organizmu. Metabolity wydzielane przez bakterie hamują rozwój drobnoustrojów chorobotwórczych i uniemożliwiają im kolonizację jelit, enzymy bakterii wspomagają trawienie pokarmów. Bakterie zasiedlające jelita odgrywają też znaczącą rolę w krążeniu i biotransformacji kwasów żółciowych, mają również udział w syntezie witamin: z grupy B (B 2, B 6, B 12 ), witaminy K, kwasu foliowego i niektórych aminokwasów. Dzięki syntezie kwasów organicznych (masłowego, octowego i propionowego) wspomagają energetycznie komórki nabłonka jelita grubego kolonocyty. W wieku 7-10 lat ustala się skład mikrobiota jelit i pozostaje niezmienny do starości. Wśród bakterii jelita grubego zdecydowanie dominują bezwzględne beztlenowce (około 90% bakterii), a wśród nich rodzaje Bacteroides, Bifidobacterium, Clostridium. Pozostałe to bakterie względnie beztlenowe: pałeczki Enterobacteriaceae rodzaje Escherichia (występuje u wszystkich zdrowych ludzi), Proteus, Enterobacter, Klebsiella i inne, paciorkowce kałowe (enterokoki) Enterococcus i wiele innych rodzajów. W przewodzie pokarmowym mogą bytować, nieraz przez długie okresy czasu bez szkody dla gospodarza, ulokowane tam po przebyciu czerwonki czy duru brzusznego lub salmonelloz, chorobotwórcze pałeczki: Shigella lub Salmonella. Obecnie zdarza się to już bardzo rzadko. Zjawisko to nazywane jest nosicielstwem i podlega kontroli sanitarnej w przypadku osób zatrudnionych w służbie zdrowia czy gałęziach gospodarki związanej z żywnością. Skóra Skóra jest największym organem organizmu człowieka, bezpośrednio łączącym go z otoczeniem. Drobnoustroje, które zasiedlają ją stale, w sposób niemożliwy do usunięcia, nazywamy rezydentami. Pojawiają się też na skórze drobnoustroje pochodzące ze środowiska, od innych ludzi czy zwierząt, kolonizujące ją przejściowo. Można je usunąć stosując zabiegi higieniczne. Mikrobiota skóry jest mniej liczna niż przewodu pokarmowego - około 10 6 jtk/cm 2 skóry, należących do 15-20 gatunków bakterii i grzybów. Warunki panujące na skórze determinują rodzaj żyjących tam drobnoustrojów. Mała wilgotność, kwaśny odczyn, duże stężenie soli, obecność kwasów tłuszczowych i substancji o działaniu przeciwdrobnoustrojowym 30

(np. bakteriocyny, lizozym), złuszczanie warstwy rogowej naskórka sprawiają, że wśród drobnoustrojów skóry dominują bakterie gramdodatnie łatwiej pokonujące niekorzystne warunki środowiska. One także decydują o tzw. odporności kolonizacyjnej chroniąc skórę przed osiedlaniem się bakterii chorobotwórczych. Największą populację bakterii skóry stanowią gronkowce Staphylococcus zasiedlające suche miejsca, kolejna co do wielkości grupa to gramdodatnie pałeczki z rodzaju Corynebacterium występujące w miejscach bogatych w gruczoły potowe, trzecią grupę tworzą beztlenowe pałeczki Propionibacterium zasiedlające rejony skóry obfitujące w gruczoły łojowe. Zdecydowanie mniejsze populacje tworzą na skórze bakterie gramujemne czy grzyby. Górne drogi oddechowe Na mikrobiota jamy ustnej i gardła składa się kilkaset gatunków bakterii zidentyfikowanych metodami genetycznymi, wielu z nich nie udało się dotąd wyhodować. Ekosystem jamy ustnej i gardła ulega zmianom w czasie życia człowieka a jego skład zależy od diety, dbałości o higienę i wieku. W jamie ustnej i gardle występują paciorkowce z rodzaju Streptococcus, pałeczki Haemophilus, Lactobacillus, ziarenkowce Neisseria, Veillonella, Staphylococcus, beztlenowce Bacteroides, a także nieliczne grzyby z rodzaju Candida. Nos i jama nosowo-gardłowa zasiedlane są mniej licznie bakteriami z rodzaju Staphylococcus (S. epidermidis), Streptococcus, Moraxella, Haemophilus, Corynebacterium. W tych przestrzeniach także stosunkowo często spotkać można drobnoustroje w sposób długotrwały je kolonizujące bez szkody dla gospodarza choć uznawane są za chorobotwórcze. Zjawisko to nazywamy nosicielstwem i w tych przestrzeniach dotyczy takich bakterii jak: Staphylococcus aureus, Neisseria meningitidis czy Corynebacterium diphtheriae. To nosicielstwo nie wymaga jednak rejestracji, więc nie podlega formalnej kontroli sanitarnej. W niższych odcinkach dróg oddechowych liczba drobnoustrojów jeszcze maleje w tchawicy są bardzo nieliczne i występują sporadycznie, a oskrzela, oskrzeliki i pęcherzyki płucne u zdrowych ludzi są wolne od drobnoustrojów. 31

Pochwa Mikrobiota pochwy stanowią liczne drobnoustroje a jej skład zmienia się w ciągu życia kobiety i zależy głównie od aktywności estrogenów. Pochwę kobiety w wieku rozrodczym zasiedlają głównie (ok. 96%) pałeczki kwasu mlekowego z rodzaju Lactobacillus (pałeczki Doederleina) fermentujące glikogen komórek nabłonka. W wyniku fermentacji powstaje kwas mlekowy zakwaszający środowisko pochwy do ph 3,6-4,6. Zapobiega to osiedlaniu się i namnażaniu drobnoustrojów chorobotwórczych. Po menopauzie ekosystem pochwy jest podobny do ekosystemu dziewcząt przed okresem pokwitania i tworzą go Staphylococcus epidermidis oraz bakterie z rodzajów Enterococcus, Corynebacterium, Bacteroides, Gardnerella. 3.2. Patogeny oportunistyczne Obniżenie ogólnej lub miejscowej odporności gospodarza, uszkodzenie skóry czy błon śluzowych lub naruszenie równowagi zasiedlających organizm drobnoustrojów może prowadzić do kolonizacji gatunkami potencjalnie chorobotwórczymi lub do nadmiernego rozmnożenia się pojedynczych gatunków mikrobiota. Może to skutkować infekcjami oportunistycznymi. Drobnoustroje je wywołujące nazywamy patogenami oportunistycznymi. Szczególnie niebezpieczne są te z nich, które bytując w środowisku szpitalnym nabyły wielorakiej oporności na antybiotyki i środki antyseptyczne. Mają one duży udział w infekcjach pacjentów leczonych antybiotykami, obciążonych schorzeniami metabolicznymi (np. cukrzyca) lub immunologicznymi (np. leczonych osłabiającymi odporność steroidami), dzieci z niedojrzałym układem immunologicznym, osób starszych i innych pacjentów szpitalnych. Względem takich pacjentów szczególną ostrożność muszą zachować osoby, które są nosicielami na skórze czy błonach śluzowych nosa. Jeśli wśród personelu medycznego są nosiciele drobnoustrojów chorobotwórczych mogą, nie stosując szczególnie rygorystycznie zasad higieny i postępowania aseptycznego, być źródłem zakażeń u pacjentów. Oporne na wiele antybiotyków i środków antyseptycznych i dezynfekcyjnych patogeny oportunistyczne stanowią szczególne niebezpieczeństwo w szpitalach. Nazywane są patogenami alarmowymi (alertpatogenami) i jest 32

o nich mowa w dalszej części tego rozdziału. Drobnoustroje te w szybki sposób, w ciągu kilkudziesięciu godzin, mogą skolonizować pacjentów przyjętych do szpitala, zastępując ich naturalne mikrobiota. W oczywisty sposób kolonizują też ciało personelu. Tak długo, jak występują w naturalnych dla danego gatunku proporcjach z innymi drobnoustrojami, nie stanowią jednak zagrożenia dla zdrowej osoby. Są jednak śmiertelnym zagrożeniem dla osób z zaburzoną odpornością lub leczonych antybiotykami, szczególnie szerokowidmowymi. 3.3. Bezwzględne patogeny. Chorobotwórczość bakterii Chorobotwórczość bakterii określa się jako potencjalną zdolność do wywoływania choroby. Za miarę chorobotwórczości uważa się zjadliwość, którą określa liczba bakterii niezbędnych do wywołania określonej choroby. Chorobotwórczość jest cechą gatunku i wynika z jego zdolności do wytwarzania substancji (białek powierzchniowych, enzymów, toksyn) określanych jako czynniki chorobotwórczości. W obrębie jednego gatunku mogą występować szczepy różniące się zjadliwością i wytwarzaniem czynników chorobotwórczości. Najważniejsze, najczęściej występujące czynniki chorobotwórczości bakterii to: - adhezyny bakteryjne struktury komórkowe umożliwiające bakteriom wiązanie się z odpowiednimi komórkami gospodarza i kolonizację; adhezyny pozwalają na późniejsze rozrastanie się tzw. biofilmów bakteryjnych struktur zbudowanych z komórek i otaczających je glikoprotein, w których populacje bakterii (zarówno naturalnie zasiedlających ciało, jak i chorobotwórczych), bytują w organizmie. Była o nich mowa w rozdziale 1. - substancje warunkujące inwazyjność bakterii: enzymy odpowiedzialne za rozprzestrzenianie się bakterii w głąb tkanek kolagenaza i inne proteazy, hialuronidaza; otoczki chroniące bakterie przed fagocytozą przez komórki układu immunologicznego gospodarza. - toksyny: niebiałkowe, jak lipopolisacharydy (LPS) stanowiące element ściany komórkowej bakterii gramujemnych uwalniane po rozpadzie komórki, które mają działanie pirogenne, powodują leukopenię, hipoglikemię, hipotensję i w odpowiedniej dawce powodują wstrząs endotoksyczny; białkowe, które ze względu na mechanizm działania można podzielić na: 33