Markery biochemiczne wybranych stanów klinicznych

ROZDZIAŁ 9 Markery biochemiczne wybranych stanów klinicznych Krzysztof Siemianowicz Teresa Jurczak W praktyce lekarskiej niejednokrotnie zachodzi konieczność wykonania badania laboratoryjnego, którego wynik może potwierdzić lub wykluczyć podejrzenie określonego stanu klinicznego. Dzisiaj biochemiczne markery wybranych istotnych stanów klinicznych dzielimy na dwie duże grupy: enzymatyczne, nieenzymatyczne. Markery enzymatyczne Dla większości enzymów ważnych klinicznie oznacza się ich aktywność, a nie stężenie w osoczu. Jest to podyktowane tym, że wszystkie enzymy są białkami, wiec aby oznaczyć stężenie ściśle określonego białka (konkretnego enzymu) należy użyć specyficznych metod opartych na reakcjach immunologicznych (metody opisane w rozdziale Zastosowanie przeciwciał w diagnostyce ). Tańszym i niejednokrotnie prostszym sposobem jest oznaczanie efektów działania enzymów, które różnią się katalizowaną reakcją i jej warunkami. W ten sposób można oznaczyć aktywność wszystkich ważnych klinicznie enzymów. Na szerszą skalę oznacza się metodami immunologicznymi stężenie jedynie trzech ważnych klinicznie izoenzymów: izoenzymu sercowego kinazy keratynowej, izoenzymu kostnego fosfatazy zasadowej i izoenzymu sterczowego fosfatazy kwaśnej. 17

W celu ułatwienia oceny klinicznej zmian aktywności w osoczu poszczególnych enzymów wprowadzono podział kliniczny enzymów, zwany też podziałem diagnostycznym lub podziałem Richtericha-Hessa. Opiera się on na miejscu fizjologicznego działania enzymu i mechanizmie zmian jego aktywności w osoczu. Wyróżniamy: Enzymy sekrecyjne (wydzielnicze). One są fizjologicznie wydzielane do krwi gdzie pełnią swą fizjologiczną funkcję. Ich stężenie (i aktywność) w osoczu ulega obniżeniu wskutek upośledzenia funkcji narządu, w którym powstają. Należą do nich: esteraza cholinowa, niektóre czynniki krzepnięcia (produkowane w formie proenzymów), lipaza lipoproteinowa, ceruloplazmina. W praktyce klinicznej z tej grupy enzymów najczęściej oznacza się protrombinę. Enzymy indykatorowe (wskaźnikowe). Te enzymy fizjologicznie występują i pełnią swe funkcje wewnątrz komórki. W osoczu fizjologicznie ich stężenie (i aktywność) jest niskie. Do krwi dostają się w wyniku obumierania komórek. Jeśli dojdzie do uszkodzenia komórek zostają uwolnione do krwi i obserwuje się wzrost ich stężenia (i aktywności) w osoczu. Ze względów dydaktycznych można je podzielić na narządowo swoiste i narządowo nieswoiste. Do narządowo swoistych zaliczamy: dla wątroby: dehydrogenazę alkoholową, dehydrogenazę sorbitolową, transferazę ornitynokarbamoilową, aldolazę fruktozomonofosforanową, arginazę, dehydrogenazę glutaminianu, dla mięśni: poprzecznie prążkowanych: kinazę kreatynową (fosfokinazę keratynową), aldolazę fruktozdifosforanową. Do narządowo nieswoistych enzymów indykatorowych zaliczamy: enzymy glikolizy, enzymy cyklu pentozowego, aminotransferazy alaninową i asparaginianową, dehydrogenazę mleczanową. Wśród enzymów indykatorowych największe znaczenie kliniczne mają: kinaza keratynowa i jej izoenzymy, aminotransferaza alaninowa, aminotransferaza asparaginianowa i dehydrogenaza mleczanowa wraz z jej izoenzymami. Enzymy ekskrecyjne (wydzielnicze). Te enzymy są produkowane i wydzielane do wydzielin takich jak żółć, sok trzustkowy, ślina, sok sterczowy. Fizjologicznie ich stężenie (i aktywność) w osoczu są niewielkie. Jeśli dojdzie do upośledzenia odpływu 18

wydzieliny bogatej w dany enzym ekskrecyjny, to obserwuje się wzrost jego aktywności w osoczu. W tej grupie wyróżniamy: enzymy żółci: fosfatazę zasadową, gamma-glutamylotransferazę (gammaglutamylotranpeptydazę) i aminopeptydazę leucytową (leucyloaminopeptydazę); enzymy soku trzustkowego: alfa-amylazę, lipazę trzustkową, DNA-azę, RNA-azę, chymotrypsynę, elastazę trzustkową; enzymy śliny: alfa-amylazę; enzymy soku sterczowego: fosfatazę kwaśną. Spośród enzymów wydalniczych w codziennej praktyce klinicznej najczęściej oznacza się: fosfatazę zasadową i jej izoenzym kostny, gamma-glutamylotransferazę, alfa-amylazę i fosfatazę kwaśną. Krótki opis wybranych enzymów Aminotransferaza alaninowa (EC 2.6.1.2; AlAT, ALT, GPT, ang. glutamic pyruvic transferase, transferaza L-alanino:2-oksyglutaran). Jest transferazą, która przenosi grupę aminową z aminokwasu na alfa-ketokwas. Katalizuje odwracalna reakcję: alanina + kwas alfa-ketoglutarowy kwas pirogronowy + kwas L-glutaminowy. Koenzymem tej reakcji jest witamina B 6. Enzym posiada 2 izoenzymy. Cytoplazmatyczny należy do frakcji α-globulin, można go wytrącić riwanolem. Izoenzym mitochondrialny wędruje wolniej (z frakcją β- i γ-globulin). Oba izoenzymy można rozdzielić elektroforetycznie, a do oznaczenia ich aktywności stosuje się metodę riwanolową. Pojawienie się w osoczu izoenzymu mitochondrialnego świadczy o głębszym uszkodzeniu narządu i komórek. Oznaczanie izoenzymów aminotransferazy alaninowej nie znalazło zastosowania w praktyce klinicznej. W największej ilości aminotransferaza alaninowa występuje w wątrobie, sercu, mięśniach poprzecznie prążkowanych, nerkach, trzustce, śledzionie i płucach. Przyczyny największych wzrostów aktywności w osoczu to: uszkodzenie wątroby (wirusowe zapalenia wątroby, toksyczne uszkodzenie wątroby, marskość wątroby, nowotwory wątroby, autoimmunologiczne zapalenie wątroby), zawał mięśnia sercowego (mimo dużego wzrostu aktywności to zastosowanie diagnostyczne zostało wyparte przez inne markery), choroby i uszkodzenie mięśni poprzecznie prążkowanych (urazy, zapalenia, dystrofie, rabdomioliza, uszkodzenia polekowe niejednokrotnie po stosowaniu statyn). 19

Inne przyczyny wzrostu aktywności AlAT to: zawały płuca, mózgu, nerki, śledziony jelit, ostre zapalenie trzustki, włośnica, zapalenia mięśnia sercowego, zapalenie wsierdzia, hemoliza, stosowanie niektórych leków. Aminotransferaza asparaginianowa (EC 2.6.1.1; AspAT, AST, GOT, ang. glutamic oxeloacetic transaminase, L-asparagino: alfa-ketoglutaran aminotransferaza). Należy do transferaz. Przenosi grupę aminową w reakcji: Kwas asparaginowy + kwas α-ketoglutarowy kwas szczawiooctowy + kwas L- glutaminowy Podobnie jak w przypadku AlAT reakcja jest odwracalna, a jej koenzymem jest fosforan pirydoksalu. Występowanie narządowe, izoenzymy i metody ich rozdziału oraz przyczyny wzrostu aktywności w osoczu są analogiczne jak w przypadku aminotransferazy alaninowej z jedną różnicą. W mięśniu sercowym jest więcej AspAT niż AlAT, co powoduje, że w przypadku zawału mięśnia sercowego wzrost aktywności AspAT jest większy niż wzrost aktywności AlAT. Obie aminotransferazy wykazują wzrost aktywności zarówno w przypadku uszkodzenia wątroby, jak i zawału mięśnia sercowego. Jednak w zawale serca aktywność AspAT rośnie silniej niż aktywność AlAT, a w większości przypadków uszkodzenia wątroby wzrost aktywności AlAT jest większy niż wzrost aktywności AspAT. W przeszłości w sytuacji, gdy u pacjenta obserwowano wzrost aktywności obu transaminaz dość często wyliczano wskaźnik de Ritisa. Jest to stosunek aktywności AspAT do aktywności AlAT w osoczu. Wartości poniżej 0,8 wskazują na uszkodzenie wątroby, natomiast wartości powyżej 1,2 na choroby serca jako przyczynę wzrostu aktywności transaminaz. Należy jednak pamiętać, że w przewlekłym aktywnym zapaleniu wątroby oraz w alkoholowym zapaleniu wątroby, w przeciwieństwie do innych postaci zapalenia, wątroby wskaźnik de Ritisa może wynosić >1. 20

Kinaza kreatynowa (EC 2.7.3.2; kinaza fosfokreatynowa, CK, CPK, fosfotransferaza ATPkreatyna). Katalizuje odwracalną reakcję fosforylacji kreatyny zgodnie z reakcją kreatyna + ATP fosfokreatyna + ADP Powstająca w komórce fosfokreatyna jest zapasowym związkiem wysokoenergetycznym, który w przeciwieństwie do ATP nie hamuje dalszej syntezy ATP. Występuje w dużych ilościach w komórkach charakteryzujących się nasilonym zużyciem energii. Najwięcej kinazy kreatynowej występuje mięśniach szkieletowych, a następnie w mózgu, mięśniu sercowym, mięśniach gładkich i innych tkankach. Cząsteczka kinazy kreatynowej zbudowana jest z dwóch podjednostek: M (od ang. muscle) i B (od ang. brain). Występują 3 izoenzymy kinazy keratynowej. W mózgu i tkance nerwowej występuje izoenzym CK-BB. W mięśniach poprzecznie prążkowanych i sercu występują 2 izoenzymy: CK-MM i CK-MB, lecz w różnych stosunkach ilościowych. W mięśniach poprzecznie prążkowanych ponad 95% kinazy keratynowej stanowi izoenzym CK-MM, a reszta to CK-MB. W mięśniu sercowym całkowita aktywność CK jest ok. 10 razy mniejsza niż w mięśniach szkieletowych, z czego ok. 70% przypada na CK-MM, a ok. 30% na CK- MB. W osoczu ludzi zdrowych ok. 95% aktywności całkowitej CK przypada na CK-MM, a ok. 5% na CK-MB. Izoenzym mózgowy CK-BB pojawia się we krwi w przypadku uszkodzenia bariery krew mózg (która jest dla niego nieprzepuszczalna), np. przy udarze mózgu, urazach mózgu. Ten izoenzym może także być wydzielany ekotopowo w niektórych przypadkach nowotworów prostaty, jajnika, nerki, jajnika, sutka i pęcherzyka żółciowego. Mimo, że może być w tym kontekście rozpatrywany jako marker nowotworowy, nie znalazł jednak zastosowania klinicznego jako marker nowotworowy. W surowicy izoenzym CK-MM występuje w 3, a izoenzym MB w 2 izoformach. Izoformy CK-MM 3 i CK-MB 2 występują na terenie cytoplazmy odpowiednich komórek w postaci niezmienionej. Po uwolnieniu do osocza w wyniku działania osoczowej karboksypeptydazy dochodzi do hydrolizy C-końcowej lizyny podjednostki M dimeru i przekształcenia izoformy MB 2 w MB 1, a MM 3 kolejno w MM 2 i MM 1. Poszczególne izoformy można rozdzielić metodą elektroforezy. Izoenzym sercowy CK-MB jest charakterystyczny dla serca. Przez długi okres oznaczanie aktywności CK-MB było stosowane w wykrywaniu zawału mięśnia sercowego. Jego aktywność zaczyna rosnąć już w 3.-6. godzinie zawału serca. Ponieważ izoenzym sercowy ulega łatwo inaktywacji i w osoczu występują jego nieaktywne formy, zaleca się oznaczanie 21

stężenia tego enzymu określane jako: stężenie masy CK-MB (CK-MB mass ). Amerykańskie Towarzystwo Kardiologiczne zaleca to oznaczenie w diagnostyce zawału mięśnia sercowego. Jest również przydatne w ocenie ryzyka zawału mięśnia sercowego u osób z niestabilną chorobą wieńcową. To oznaczenie jest także wykorzystywane w kardiologii inwazyjnej jako wskaźnik reperfuzji. Wzrost stężenia CK-MB w 4. godzinie po udrażnianiu tętnicy wieńcowej świadczy o skuteczności tej interwencji. Oznaczanie aktywności całkowitej CK ma dzisiaj znaczenie głównie przy diagnostyce chorób mięśni. Aktywność CK w osoczu rośnie w przypadku uszkodzenia mięśni, po urazach, w dystrofii mięśniowej (zwłaszcza typu Duchene), rabdomiolizie. Obecnie coraz większego znaczenia nabiera oznaczanie aktywności całkowitej CK (wraz z oznaczeniem aktywności AspAT i AlAT) w monitorowaniu bezpieczeństwa leczenia statynami. Stwierdzenie wzrostów aktywności tych enzymów w osoczu może być pierwszym sygnałem ubocznego działania statyn wyprzedzającym inne objawy kliniczne uszkodzenia mięśni szkieletowych. Nieznaczne wzrosty aktywności CK mogą wystąpić po większym wysiłku fizycznym, drobnych urazach, a nawet iniekcjach domięśniowych. Dehydrogenaza mleczanowa (EC.1.1.1.27; LDH, LD, oksydoreduktaza L-mleczan: NAD) i dehydrogenza α-hydroksymaślanowa (HBDH). Dehydrogenaza mleczanowa katalizuje odwracalną reakcję redukcji kwasu pirogronowego do kwasu mlekowego, która kończy glikolityczny tor spalania glukozy w warunkach beztlenowych. Jest ona enzymem cytoplazmatycznym występującym we wszystkich tkankach. Najwyższą jego aktywność wykazuje wątroba, a następnie mięśnie szkieletowe, nerka, mięsień sercowy i płuca. Cząsteczka LDH jest tetrametrem zbudowanym z dwóch rodzajów podjednostek: H (od ang. heart) i M (od ang. muscle). Obydwa łańcuchy polipeptydowe mają podobną masę cząsteczkową i zbliżone właściwości antygenowe, natomiast różnią się nieco składem aminokwasowym i właściwościami kinetycznymi, w tym wrażliwością na hamujące działanie dużych stężeń substratu - pirogronianu. Hamowanie aktywności LDH w sercu przez pirogronian umożliwia wykorzystanie tego substratu w przemianach oksydacyjnych. Brak hamowania w wątrobie sprzyja przemianie gromadzącego się pirogronianu w mleczan. Podjednostki H i M dehydrogenazy różnią się także swoistością substratową: M katalizuje tylko wzajemną przemianę pirogronianu i mleczanu, H jest mniej swoista i katalizuje także z dużą wydajnością wzajemną przemianę α-ketomaślanu i α-hydroksymaślanu. Poszczególne 22

izoenzymy zawierają: LDH 1-4 podjednostki H, LDH 2-3H i 1M, LDH 3-2H i 2M, LDH 4-1H i 3M, LDH 5-4M. Izoenzymy LDH 1 i LDH 2 występują głównie w tkankach charakteryzujących się przemianą oksydacyjną, takich jak serce, nerki, mózg. Tkanki, w których zachodzi wydajna przemiana beztlenowa - mięśnie szkieletowe, wątroba - są bogate w LDH 4 i LDH 5. LDH 1 ma zdolność katalizowania reakcji odwodornienia alfa-hydroksymaślanu do α- ketomaslanu. Z tego powodu bywa nazywana dehydrogenazą alfa-hydroksymaślanowa (HBDH). Przyczyny wzrostu aktywności w osoczu: izolowany wzrost aktywności LDH 1 : nasieniak najądrza (seminoma), LDH 1 i LDH 2 : zawał serca, hemoliza, LDH 3 : białaczki, LDH 4 i LDH 5 : choroby wątroby, choroby mięśni. Obecnie dehydrogenaza mleczanowa jest dość rzadko oznaczana w praktyce klinicznej. α-amylaza (EC 3.3.1.1. glukanohydrolaza 1,4-α-D-glukanu, amylaza). Jest produkowana przez ślinianki, trzustkę, komórki nabłonka jajowodów, granulocyty wielojądrzaste i płuca. Każdy typ komórek wytwarza swój izoenzym alfa-amylazy. Izoenzymy można rozdzielić elektroforetycznie, chromatograficznie, a do oznaczania ich aktywności służą metody oparte na zastosowaniu odpowiednich inhibitorów. W osoczu ok. 80% aktywności całkowitej przypada na izoenzym trzustkowy. Substratami dla alfa amylazy są wielocukry należące do alfa glukanów. Powinowactwo enzymu do tych substratów wzrasta w miarę wydłużania się łańcucha cukrowego. W wyniku działania alfa amylazy powstają dekstryny, a następnie maltotrioza i maltoza. Hydroliza substratu przy udziale amylazy ustaje gdy enzym zbliży się do rozgałęzienia cząsteczki cukrowca, w efekcie czego powstają dekstryny graniczne. Cząsteczka amylazy jest niewielka i latwo ulega filtracji nerkowej. Spośród płynów ustrojowych największą aktywność wykazują sok trzustkowy i ślina, mniejszą surowica i mocz. Główną przyczyną wzrostu aktywności amylazy w osoczu jest ostre zapalenie trzustki. Wzrost ten jest bardzo wysoki (ponad 10-krotny) i gwałtowny w porównaniu z innymi jednostkami chorobowymi, w przebiegu których również wzrasta aktywność tego enzymu w surowicy. Wzrost aktywności występuje po 5-6 godzinach, a po 20-30 godzinach od wystąpienia pierwszych objawów choroby aktywność amylazy w surowicy osiąga wartości 23

maksymalne. Aktywność tego enzymu w moczu wzrasta z opóźnieniem około 6-10 godzin w porównaniu z jego aktywnością w surowicy. Normalizacja aktywności amylazy następuje po 4-10 dniach. Inne przyczyny wzrostu aktywności to zapalenie ślinianek, kamica przewodów wyprowadzających ślinianek. Mierny wzrost aktywności w osoczu można zaobserwować w zapaleniu pęcherzyka żółciowego, perforacji wrzodu żołądka, kamicy wątrobowej, zapaleniu otrzewnej, niedrożności jelit, urazach trzustki. Amylaza jest jedynym enzymem, którego aktywność rutynowo oznacza się zarówno w osoczu, jak i w moczu. Wzrostowi aktywności amylazy w osoczu zwykle towarzyszy wzrost aktywności w moczu. W przypadku niewydolności nerek można zaobserwować wzrost aktywności amylazy w osoczu, a spadek w moczu. Podobna konstelację aktywności amylazy obserwuje się w przypadku makroamylazemii. Jest to rzadkie zaburzenie, w którym immunoglobuliny (najczęściej IgA) wiążą jeden spośród izoenzymów amylazy na zasadzie reakcji antygen-przeciwciało w większe kompleksy, które w przeciwieństwie do niezwiązanej amylazy nie przesączają się przez błonę filtracyjną kłębuszka nerkowego. Aktywność amylazy w surowicy i moczu obniża się w fazie przewlekłej chorób, w których dochodzi do znacznego uszkodzenia trzustki (przewlekłe zapalenie trzustki, mukowiscydoza). γ-glutamylotransferaza (EC 2.3.2.2; GGTP, GGT, glutamylotranspeptydaza, glutamylotransferaza glutamina: D-glutamyl). Jest związana z błonami plazmatycznymi komórek, w tym także z siateczką śródplazmatyczną. Katalizuje reakcje przeniesienia grupy γ-glutamylowej z donora na odpowiedni akceptor. Donorami mogą być γ-glutamylowe peptydy, natomiast akceptorami niektóre aminokwasy, a także substraty γ-glutamylowe. Produktami reakcji są mono-, di-, trilub oligoglutamylowe peptydy. Największą aktywność GGTP stwierdza się w komórkach nabłonka dróg żółciowych, nerkach, wątrobie i trzustce. Jej obecność jest charakterystyczna dla komórek, w których zachodzi intensywny transport substancji. Przyczyną najsilniejszego wzrostu aktywności jest cholestaza, czyli zastój żółci w drogach żółciowych. Inne przyczyny wzrostu aktywności GGTP to ostre i przewlekle choroby wątroby, dróg żółciowych i trzustki. Przyczyną wzrostu aktywności może być także przyjmowanie niektórych leków oraz spożywanie alkoholu. 24

Aktywność GGTP rośnie także w przypadku zawału mięśnia sercowego. Jednakże początek wzrostu aktywności tego enzymu zaczyna się późno, dopiero w 6.-7. dobie, a normalizacja aktywności następuje w 4.-6. tygodniu po wystąpieniu zawału serca. Oznaczanie aktywności tego enzymu absolutnie nie nadaje się do diagnostyki zawału mięśnia sercowego. Może być natomiast przydatne w monitorowaniu rekonwalescencji po zawale serca. Przedłużające się utrzymywanie się podwyższonej aktywności GGTP może świadczyć o tętniaku serca. Fosfataza zasadowa (EC 3.1.3.1; FA, ALP, fosfataza alkaliczna, zasadowa fosfohydrolaza monoestrów ortofosforanowych). Enzym ten hydrolitycznie odszczepia resztę ortofosforanową z organicznych estrów kwasu fosforowego w środowisku zasadowym. Fosfataza zasadowa jest wysoce nieswoista względem części organicznej hydrolizowanego estru. Występuje głównie w błonach plazmatycznych jako białko zewnątrzbłonowe lub w kompleksie z białkami i fosfolipidami błony. W osoczu osób zdrowych występują 3 izoenzymy fosfatazy zasadowej: wątrobowy, kostny i jelitowy. U kobiet w ciąży występuje osoczu także izoenzym łożyskowy. Izoenzymy można rozdzielić elektroforetycznie lub chromatograficznie. W praktyce klinicznej istotne jest oznaczenie izoenzymu kostnego fosfatazy zasadowej. Jego stężenie można oznaczyć metodami immunologicznymi, a aktywność metodą inaktywacji termicznej. Wykorzystuje ona fakt, że izoenzym kostny łatwo ulega inaktywacji już w temperaturze 56 C po 5 minutach. Metoda termiczna polega na wykonaniu oznaczanie aktywności całkowitej fosfatazy alkalicznej w badanej próbce, następnie materiał badany jest poddawany inaktywacji termicznej, czyli ogrzewany w temp. 56 C przez 5 minut. Kolejny etap to oznaczenie aktywności fosfatazy alkalicznej po inaktywacji. Otrzymany wynik to suma aktywności pozostałych izoenzymów. Więc aby otrzymać interesujący nas wynik aktywności izoenzymu kostnego fosfatazy zasadowej należy od aktywności całkowitej odjąć aktywność oznaczoną po inaktywacji termicznej. Przyczyny wzrostu aktywności fosfatazy zasadowej dzielimy na fizjologiczne i patologiczne. Fizjologiczne obejmują: okres wzrostu podwyższona aktywność jest spowodowana fizjologicznym rozwojem i wzrostem kości, u kobiet pod koniec ciąży spowodowany produkcją w łożysku izoenzymu łożyskowego. Normalizacja aktywności następuje około 20 dni po porodzie. Przyczyny patologiczne obejmują: cholestazę 25

choroby kości związane z osteolizą i przebudową tkanki kostnej (włókniste torbielowate zapalenie kości w przebiegu nadczynności przytarczyc, zniekształcające zapalenie kości w chorobie Pageta, osteoblastyczne guzy kości, zapalenie szpiku kostnego, gruźlica kości, długotrwałe unieruchomienie, niedobór witaminy D). Izoenzym kostny fosfatazy zasadowej jest produkowany przez osteoblasty i jest markerem kościotworzenia. choroby wątroby jeśli przebiegają bez cholestazy, to wzrost aktywności będzie mniejszy niż w przypadku cholestazy, niektóre nowotwory. W przeszłości zwracano uwagę na izoenzymy nowotworowe fosfatazy zasadowej. Obecnie wobec stwierdzenia ich niewielkiej przydatności klinicznej zaprzestano ich oznaczania. Fosfataza kwaśna (EC 3.1.3.2; FAc, ACP, kwaśna hydrolaza monoestrów ortofosforanowych). Enzym ten podobnie jak fosfataza zasadowa nie jest specyficzny dla organicznej części hydrolizowanego estru kwasu fosforowego. Optimum ph fosfatazy kwaśnej leży w kwaśnym zakresie 4,5-5,0. W osoczu występuje pięć izoenzymów: kostny (nie mylić z izoenzymem kostnym fosfatazy zasadowej!), wątrobowy, nerkowy, sterczowy i płytkowy. Izoenzym kostny fosfatazy kwaśnej jest syntetyzowany przez osteoklasty (może być uważany za marker osteolizy). Większość aktywności całkowitej fosfatazy kwaśnej w osoczu przypada na ten izoenzym. Pewne znaczenie przypisuje się także izoenzymowi sterczowemu fosfatazy kwaśnej (PAP od ang. prostatic acid phosphatase). Jego znaczenie w wykrywaniu i monitorowaniu leczenia raka stercza zmalało po wprowadzeniu do powszechnego użycia oznaczania swoistego antygenu sterczowego (PSA; opisany w rozdziale Markery nowotworowe ). U zdrowych mężczyzn izoenzym sterczowy fosfatazy kwaśnej stanowi ok. 30% aktywności całkowitej. W rozróżnianiu aktywności dwóch dominujących izoenzymów fosfatazy kwaśnej, tj. izoenzymu kostnego i sterczowego wykorzystuje się wrażliwość izoenzymu sterczowego na hamowanie L-winianem i oporność na działanie formaldehydu. Oznaczając aktywność fosfatazy kwaśnej opornej na L-winian (TRAP od ang. tartarate resistant acid phospatase) oznacza się głównie izoenzym kostny. 26

Przyczyny wzrostu aktywności fosfatazy kwaśnej: rak stercza, choroby kości: osteoporoza, choroba Pageta, szpiczak mnogi, akromegalia, przerzuty nowotworowe do kości (przy przerzutach raka stercza może towarzyszyć wzrost aktywności izoenzymu kostnego fosfatazy zasadowej), niewielki wzrost aktywności może wystąpić w raku jelita, sutka, niedokrwistości hemolitycznej oraz w stanach przebiegających z tworzeniem się zakrzepów. Przy pobieraniu krwi na oznaczanie aktywności fosfatazy kwaśnej należy pamiętać, aby nie robić tego po zabiegach, które mogły spowodować masaż gruczołu krokowego (badanie per rectum, rektoskopia, sigmoidoskopia, kolonoskopia, wlew kontrastowy jelita grubego, cystoskopia, cystografia, a nawet założenie cewnika do pęcherza moczowego) gdyż można wtedy otrzymać zawyżony wynik oznaczenia aktywności fosfatazy kwaśnej. Markery nieenzymatyczne W tej grupie oznaczeń znaczenie kliniczne mają nieenzymatyczne osoczowe markery zawału mięśnia sercowego oraz markery nowotworowe (omówione w rozdziale Markery nowotworowe ). Nieezymatyczne markery zawału mięśnia sercowego W związku z wprowadzeniem procedur zmierzających do udrożnienia zamkniętego naczynia wieńcowego, uległy zmianie wymagania dotyczące rozpoznania zawału mięśnia sercowego. Skuteczność tych zabiegów jest uwarunkowana ich jak najwcześniejszym przeprowadzeniem w ciągu kilku godzin od zamknięcia światła naczynia. Dlatego w obecnie obowiązujących zaleceniach dotyczących rozpoznawania uwzględniono jedynie te czynniki, które szybko i z dużą pewnością pozwolą wyłowić osoby z ostrym zawałem mięśnia sercowego (AMI, ang. acute myocardial infarction). Substancje te uwalniane są ze zmienionych martwiczo kardiomiocytów w ognisku niedokrwienia. Ich oznaczenie ma szczególne znaczenie dla postawienia właściwego rozpoznania u pacjentów z nieswoistymi zmianami w EKG, jak również ma duże znaczenie prognostyczne odnośnie skuteczności ewentualnych zabiegów rewaskularyzacji lub trombolizy. Mioglobina. Jest cytoplazmatyczną hemoproteiną, która występuje w dużych ilościach w komórkach mięśni poprzecznie prążkowanych i kardiomiocytach. Jest wewnątrzkomórkowym rezerwuarem tlenu. Po uszkodzeniu komórek, w których występuje szybko pojawia się we krwi, a także w moczu. Mioglobina jest wczesnym i czułym markerem 27

uszkodzenia komórek mięśniowych, lecz nieswoistym dla kardiomiocytów. Zwiększone stężenie mioglobiny w osoczu pojawia się najwcześniej po dokonaniu się zawału (ok. 2 h) i w ciągu 4-8 godzin osiąga w surowicy stężenie 5-10 krotnie wyższe od prawidłowego (N: 0-116 ng/ml), po czym bardzo szybko wraca do normy. Mioglobina uwalniana z mięśnia sercowego jest identyczna z mioglobiną mięśni szkieletowych. Oznaczanie stężenia mioglobiny ma małe znaczenie w rozpoznaniu zawału mięśnia sercowego, natomiast większe w jego wykluczeniu (jeśli w czasie od 4-8 godziny od epizodu wieńcowego nie stwierdzi się wzrostu jej stężenia). Troponiny sercowe. Troponiny (Tn) wchodzą w skład zespołu troponinowotropomiozynowego w filamentach cienkich miofibryli. Występują w mięśniach szkieletowych i mięśniu sercowym. Troponiny sercowe I i T (TnI i TnT) są antygenowo odmienne od troponin mięśni szkieletowych (troponina C jest identyczna) i nie występują w osoczu ludzi zdrowych. Troponina C wiążę jony wapnia, a troponina I łączy się z aktyną i hamuje interakcje aktyny z miozyną. Troponina T łączy się z tropomiozyną przytwierdzając cały zespół do cienkiego filamentu. Pojawienie się we krwi troponin sercowych jest czułym i swoistym wskaźnikiem uszkodzenia kardiomiocytów. Ich wzrost (czyli pojawienie się we krwi) stwierdza się w 4-8 godzin po dokonaniu się zawału serca. Normalizacja stężenia występuje zwykle po około 10 dniach (od 7 dni w przypadki niewielkiego ogniska martwicy, do aż 21 dni przy rozległych zawałach pełnościennych). Z powodu długo utrzymujących się podwyższonych stężeń sercowych troponin parametry te nie nadają się do diagnostyki ponownego zawału mięśnia sercowego. Do wczesnego rozpoznania zawału mięśnia sercowego (do 6 godzin od dokonania się zawału) najlepiej nadaje się oznaczanie CK-MB. Oznaczanie sercowych troponin I i T daje najlepsze wyniki w późniejszych rozpoznaniach. Uwagi praktyczne Wybierając oznaczenie określonego parametru laboratoryjnego jako markera danego stanu klinicznego należy wziąć pod uwagę kilka faktów: Jaka konstelacja odchyleń od wyników prawidłowych jest charakterystyczna dla danego stanu klinicznego i pozwala wykluczyć inne? Czy wynik prawidłowy wybranego parametru laboratoryjnego pozwala wykluczyć podejrzenie określonego stanu klinicznego (np. brak wzrostu stężenia mioglobiny przy podejrzeniu zawału mięśnia sercowego)? W jakim czasie od wystąpienia objawów klinicznych należy się spodziewać początku zmian aktywności lub stężenia, kiedy nastąpi ich szczyt i kiedy ulegną normalizacji 28

(profil zmian aktywności lub stężenia)? Czy badanie zostało zlecone we właściwym czasie, czy za wcześnie lub za późno? Jakie mogą być inne przyczyny, poza podejrzewanym stanem klinicznym, zmian oznaczanego parametru laboratoryjnego? Czy są współistniejące choroby ograniczające przydatność diagnostyczną zlecanego badania (np. przy podejrzeniu cholestazy u kobiety w trzecim trymestrze ciąży fosfataza alkaliczna traci na znaczeniu jako marker cholestazy)? Przykładowe markery określonych stanów klinicznych Zawał mięśnia sercowego: enzymatyczne: CK-MB, AspAT i AlAT, HBDH; nieenzymatyczne: mioglobina, troponiny sercowe, Uszkodzenie wątroby: AlAT, AspAT, LDH, protrombina, Cholestaza: GGTP, FA, LAP, Uszkodzenie mięśni szkieletowych: CK, AspAT, AlAT, Ostre zapalenie trzustki: amylaza (w osoczu i w moczu), Rak stercza: PAP, PSA. 29

CZĘŚĆ PRAKTYCZNA ĆWICZENIE 1 Oznaczanie aktywności GGTP metodą punktu końcowego ZASADA METODY γ-glutamylotranspeptydaza (GGTP) w obecności substratu (L-γ-glutamylo-4-nitroanilid) przenosi resztę γ-glutamylową na akceptor jakim jest glicyloglicyna, spełniający równocześnie rolę aktywatora. W wyniku reakcji zostaje uwolniona żółto zabarwiona 4- nitroanilina. Mierzona intensywność barwy jest wprost proporcjonalna do aktywności enzymu. MATERIAŁ BADANY Surowica ODCZYNNIKI Odczynnik roboczy (substrat L-γ-glutamylo-4-nitroanilid, glicyloglicyna, bufor TRIS ph 8,2) Roztwór kwasu octowego WYKONANIE Oznaczenie wykonać wg schematu: Składnik próby (ml) Próba badana Próba wzorcowa odczynnik roboczy 0,2 0,2 Inkubować 3 min. w łaźni wodnej o temp. 37ºC surowica 0,05 - Inkubować 15 min. w łaźni wodnej o temp. 37ºC Po tym czasie przerwać reakcję dodając: r-r kwasu octowego 2,0 2,0 Wyjąć próbki z łaźni wodnej i dodać: surowica - 0,5 Zmierzyć absorbancję próby badanej względem próby ślepej przy długości fali 405 nm. 30

OBLICZENIA 6 A 10 2,25 GGTP ( U / l) A 303 15 9900 0,05 gdzie: A absorbancja próby badanej względem próby ślepej 15 czas inkubacji w minutach 2,25 końcowa objętość próbki w ml 0,05 objętość materiału badanego w ml 9900 molowy współczynnik absorpcji 4-nitroaniliny ĆWICZENIE 2 Oznaczanie aktywności fosfatazy kwaśnej ZASADA METODY Fosfataza kwaśna w środowisku kwaśnym rozkłada p-nitrofenylofosforan do p-nitrofenolu. Uwolniony p-nitrofenol po zmianie środowiska na alkaliczne przechodzi w żółto zabarwiony anion. Intensywność zabawienia jest wprost proporcjonalna do aktywności enzymu. Do oznaczania aktywności fosfatazy kwaśnej pochodzenia sterczowego wykorzystana jest właściwość całkowitego jej hamowania przez L-winiany. Wyznaczona różnica między całkowitą aktywnością fosfatazy kwaśnej, a aktywnością fosfatazy niehamowanej przez L- winiany odpowiada aktywności fosfatazy sterczowej. MATERIAŁ BADANY Osocze ODCZYNNIKI ACP Mono 1 (bufor cytrynianowy ph 5,2, p-nitrofenylofosforan) nieacp S Mono 2 (bufor cytrynianowy ph 5,2, p-nitrofenylofosforan, winian sodu) 0,1 mol/l NaOH 31

WYKONANIE Oznaczenie wykonać wg schematu: Składnik próby (ml) Całkowita aktywność fosfatazy kwaśnej (ACP) Aktywność fosfatazy niesterczowej (nieacp-s) Próba badana 1 Próba ślepa Próba badana 2 Próba ślepa r-r Mono 1 0,20 0,20 - - r-r Mono 2 - - 0,20 0,20 Inkubować w temperaturze 37 o C osocze 0,05-0,05 - Inkubować 20 minut w temperaturze w 37 o C. Po tym czasie przerwać reakcję, dodając r-r NaOH 2,0 2,0 2,0 2,0 Wyjmować próbki z łaźni wodnej, dodając osocze - 0,05-0,05 Zawartość probówek starannie wymieszać i pozostawić na 10 minut w temperaturze pokojowej, po czym zmierzyć absorbancję próby badanej względem próby ślepej przy długości fali 405 nm. OBLICZENIA Aktywność fosfatazy kwaśniej całkowitej oblicza się wg wzoru: ACP (U/l) = A próby badanej1 x 81 Aktywność fosfatazy niehamowanej winianem oblicza się wg wzoru: nieacp S (U/l) = A próby badanej2 x 81 Aktywność fosfatazy sterczowej oblicza się wg wzoru: ACP S (U/l) = ACP(U/l) nieacp S (U/l) 32