Badanie genotoksyczności substancji aktywnych testem Amesa Aleksandra Plotta 15 listopada 2016
http://odkrywcy.pl/gid,15139499,page,8,title,organizm-w-liczbach,galeriazdjecie.html AGENDA 1. Substancje aktywne. 2. Genotoksyczność. 3. Testy służące do wykrywania genotoksyczności. 4. Test Amesa. 5. Wady i zalety.
2. Substancje aktywne Wytyczna ICH M7 odnośnie wykrywania i kontroli DNAreaktywnych (mutagennych) zanieczyszczeń w środkach farmaceutycznych w celu ograniczenia ryzyka karcenogennego. EMA/CHMP/ICH/83812/2013
1. Substancje aktywne Grupy substancji o wysokim potencjale TTC* - aflatoxin-like, - N-nitroso compounds, - azoxy compounds TTC próg zagrożenia toksykologicznego 1.5 mcg/dzień/osobę = teoretyczne zagrożenie rakowe z 1 na 10 5 w trakcie życiowej ekspozycji Odnosi się to do mutagennych zanieczyszczeń w farmaceutykach przeznaczonych do leczenia długoterminowego (> 10 lat). Bazując na wytycznej ICH M7
http://www.mutacjegenetyczne.pl/ 2. Genotoksyczność Genotoksyczność- szerokie pojęcie odnoszące się do wszelakich szkodliwych zmian w materiale genetycznym, niezależnie od mechanizmu jakim zmiana jest indukowana. GENOTOKSYCZNOŚĆ KARCENOGENNOŚĆ
2. Genotoksyczność
3. Testy służące do wykrywania genotoksyczności 1. Test Umu (Szczep testowy TA1535/pSK1002 posiada zwielokrotniony plazmid psk1002). 2. Klasyczny Test Amesa (metoda płytkowa). 3. Test Amesa II (metoda mikropłytkowa). 4. Test wykorzystujący szczepy bakteryjne Vibrio harvey (nadaje się do oznaczania mutagenności czwartorzedowych soli amoniowych). Większość testów do badania genotoksyczności opiera się na podwalinach klasycznej metody Amesa ( lata 70. XX wieku ), jednak powstaje szereg udogodnień i usprawnień metody (np. wprowadzenie mikropłytki)
ZAŁOŻENIA TESTU 1. Test badający siłę mutagenności danej substancji. 2. Wykorzystujący auksotroficzne szczepy bakteryjne z wprowadzoną mutacją punktową w operonie danego aminokwasu. 3. Wykorzystujący szczepy z mutacją ramki odczytu bądź substytucją par zasad. 4. Wykorzystujący aktywację metaboliczną z wykorzystaniem homogenatu ssaczej wątroby, w celu sprawdzenia czy związek pod wpływem aktywacji nie przekształca się w mutagenne pochodne.
Bacterial stock -80ºC Overnight culture Assay preparation Test sample, controls Transfer to 24-well plate Exposure cultures 24-well plate Bacterial culture C- D4 C- D4 C- D4 A TAxxx Exposure Medium Transfer D1 D2 D5 D6 D1 D2 D5 D6 D1 D2 D5 D6 B C -/+ S9-mix D3 C+ D3 C+ D3 C+ D 37ºC, 11-15 h 250 rpm 37ºC, 90 min, 250 rpm (E.Coli +S9: 20 min) 384-well plates Indicator medium C- D1 D2 D3 D4 D5 D6 C+ A B C D 37 o C 48 h C- D1 D2 D3 D4 D5 D6 C+
https://www.britannica.com/science/salmonella-typhimurium 4. Test Amesa Punkty krytyczne: 1. Transport. 2. Hodowla całonocna. 3. Dodanie substancji badanej. 4. Transfer z płytki 24 - dołkowej na 384 - dołkową. 5. Stężenie 2-aminoantracenu (2 AA) w kontroli pozytywnej.
Dzień I- Założenie hodowli całonocnej 1 Warunki inkubacji: 37 C, 200 rpm, 14-16 h natlenienie Zamrażarka -70 C 2 3 4
DZIEŃ II 1. PRZYGOTOWANIE I ROZCIEŃCZENIE PODSTAWOWEGO ZWIĄZKU CHEMICZNEGO
DZIEŃ II 2. PRZENIESIENIE ZWIĄZKU CHEMICZNEGO NA PŁYTKI DO EKSPOZYCJI
DZIEŃ II 3. PRZYGOTOWANIE HODOWLI DO EKSPOZYCJI INKUBACJA: 90 minut, 200 rpm,37 C
DZIEŃ II 4. DODANIE PODŁOŻA WSKAŹNIKOWEGO
DZIEŃ II 5. PRZENIESIENIE HODOWLI PO EKSPOZYCJI Z PŁYTKI 24-DOŁKOWEJ DO PŁYTEK 384-DOŁKOWYCH
DZIEŃ IV Odczyt płytek testowych i statystyczna analiza danych E. Coli S9-
DZIEŃ IV Odczyt płytek testowych i statystyczna analiza danych E. Coli S9-
DZIEŃ IV Odczyt płytek testowych i statystyczna analiza danych E. Coli S9-
5. Podsumowanie Zalety Stosunkowo szybki czas uzyskania wyniku Wysoka dokładność Łatwe opracowanie danych statystycznie Wady Wysoki koszt odczynników Pracochłonny Wymagający specjalistycznego sprzętu