INNOWACYJNE METODY LECZENIA TERAPEUTYCZNE ZASTOSOWANIE BAKTERIOFAGÓW

Dorota Ochońska Monika Brzychczy-Włoch Małgorzata Bulanda INNOWACYJNE METODY LECZENIA TERAPEUTYCZNE ZASTOSOWANIE BAKTERIOFAGÓW THE INNOVATIVE THERAPIES THERAPEUTIC USE OF BACTERIOPHAGES Streszczenie Wiele międzynarodowych organizacji zdrowia za największe zagrożenie w najbliższych latach uważa niepokojący wzrost liczby zakażeń wywoływanych przez wielolekooporne szczepy bakterii. Terapia fagowa jest jedną z możliwych form leczenia zakażeń bakteryjnych. W terapii tej samoreplikujące się bakteriofagi są traktowane jako konwencjonalne leki. Zainteresowanie bakteriofagami ciągle wzrasta ze względu na ich ogromną liczebność w środowisku naturalnym, a więc także istotny wpływ na funkcjonowanie organizmów żywych. Jest nadzieja, że fagoterapia okaże się skuteczną metodą zwalczania patogennych bakterii opornych na działanie antybiotyków. Summary The alarming emergence of antibiotic resistant bacteria is considered the greatest threat to human health of the new millennium to many health-caring organisations worldwide. Phage therapy is one of the alternative forms of antibacterial therapy. In phage therapy, self-replicating bacteriophages may be compared to conventional drugs. Bacteriophages (phages) are viruses specific towards bacterial strains and are natural regulators of bacterial populations in nature. Interest in the therapeutic use of phages is growing due to the emergence of antibiotic resistant pathogens. Słowa kluczowe/key words antybiotykooporność terapia fagowa bakteriofagi antibiotics resistance phage therapy bacteriophages mgr Dorota Ochońska prof. dr hab. med. Małgorzata Bulanda Zakład Epidemiologii Zakażeń, Katedra Mikrobiologii UJ CM Kraków?? Monika Brzychczy-Włoch Zakład Bakteriologii, Ekologii Drobnoustrojów i Parazytologii, Katedra Mikrobiologii UJ CM Kraków Adres do korespondencji: Dorota Ochońska ul. Czysta 18 31 121 Kraków e-mail: dorota.ochonska@uj.edu.pl tel. (12) 633 25 67 fax (12) 423 39 24 Zainteresowanie terapią fagową na świecie miało bardzo różny charakter. Po upływie zaledwie kilku lat od opisania bakteriofagów podjęto pierwsze próby zastosowania tej terapii u ludzi. Jednak odkrycie pierwszych antybiotyków i skuteczne stosowanie antybiotykoterapii w leczeniu zakażeń spowodowało, że zainteresowanie terapią fagową znacznie osłabło. Obecnie obserwuje się gwałtowny wzrost lekooporności drobnoustrojów, szybkie nabywanie i wytwarzanie przez bakterie oporności na antybiotyki, zmniejszanie się liczby nowych antybiotyków wprowadzanych do leczenia oraz wzrost kosztów badań; wszystkie te czynniki powodują, że zwiększa się zainteresowanie badaczy alternatywnymi metodami leczenia zakażeń bakteryjnych, zwłaszcza wywołanych przez wielolekooporne szczepy kliniczne, np. MRSA (Methicillin Resistant Staphylococcus aureus), VRSA (Vancomycin Resistant Staphylococcus aureus) czy MDR (Multidrug Resistant) Pseudomonas aeruginosa (ryc. 1) [1, 2, 3]. Walka z rosnącą lekoopornością drobnoustrojów oraz poszukiwanie innowacyjnych form terapii jest również priorytetem dla wielu światowych organizacji zdrowia, m.in. IDSA (Infectious Diseases Society of America) i ESCMID (European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases) (ryc. 2) [4, 5]. Terapia fagowa Terapia fagowa jest metodą leczenia zakażeń bakteryjnych, wykorzystującą jako konwencjonalne leki samoreplikujące się bakteriofagi zdolne do infekcji i lizy komórek bakteryjnych [6]. W Polsce i Belgii fagoterapia u ludzi ma status eksperymentalnej terapii, której idea wynika z Deklaracji Helsińskiej, a preparaty bakteriofagowe stosowane u pacjentów objętych leczeniem eksperymentalnym nie są zatwierdzone przez Twoje Zdrowie Sp. z o.o. 2 www.zakazenia.org.pl

klinika zakażeń Urząd Rejestracji Produktów Leczniczych, Wyrobów Medycznych i Produktów Biobójczych [7]. Natomiast są dopuszczone przez FDA (Food and Drug Administration) komercyjne preparaty bakteriofagowe przeznaczone do stosowania w przemyśle spożywczym czy weterynarii. Jednym z największych ośrodków na świecie prowadzącym badania nad preparatami fagowymi jest od 1923 roku Instytut im. Eliava w Tbilisi, działający przy Instytucie Mikrobiologii i Wirusologii w Gruzji. Ośrodek ten dysponuje ogromną kolekcją bakteriofagów i obecnie jest zaangażowany w produkcję nowoczesnych preparatów bakteriofagowych, np.: Pyo-Phage, preparat 5-składnikowy przeznaczony do leczenia i profilaktyki infekcji wywołanych przez Staphylococcus, Streptococcus, E. coli, Pseudomonas, Proteus, czy Phage-Staph przeznaczony do leczenia i profilaktyki infekcji wywołanych przez S. aureus. [8]. W Rosji, podobnie jak w Gruzji, leczenie zakażeń bakteryjnych u pacjentów standardowo jest wspomagane terapią fagową, a preparaty bakteriofagowe są sprzedawane między innymi w aptekach. Obecnie w USA, Wielkiej Brytanii, Belgii, Szwajcarii, Bangladeszu są prowadzone liczne eksperymentalne badania kliniczne (RTCs randomized trials controls) nad zastosowaniem bakteriofagów w terapii u ludzi [9]. Eksperymentalna terapia fagowa w Polsce Pierwszy w Polsce udokumentowany przypadek terapii fagowej, którą zastosowano w ropnym zapaleniu nerek u pisarki Marii Dąbrowskiej, pochodzi z przełomu 1926/27 roku z Kliniki Chirurgii Uniwersytetu Jagiellońskiego w Krakowie. Obecnie eksperymentalna terapia fagowa jest prowadzona w Polsce przez jedyny w Unii Europejskiej Ośrodek Terapii Fagowej (OTF), utworzony w 2005 roku przy Instytucie Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN we Wrocławiu. Główne zadania OTF to przygotowywanie preparatów fagowych oraz prowadzenie eksperymentalnej terapii fagowej na podstawie typowania fagowego [10]. Do fagoterapii są kwalifikowane osoby w wieku powyżej 18 lat z objawowymi zakażeniami bakteryjnymi opornymi na antybiotykoterapię, m.in.: migdałków, ucha środkowego, zatok przynosowych, skóry i tkanki podskórnej, ran, odleżyn, przetok, stawów, kości, szpiku kostnego, przewodu pokarmowego, górnych i dolnych dróg oddechowych oraz dróg moczowo-płciowych. Najczęściej czynnikami patogennymi są drobnoustroje z następujących rodzajów: Staphylococcus, w tym szczepy oporne MRSA, Enterococcus VRE (vancomycin resistant enterococcus), Escherichia coli ESβL+ (extended spectrum β-lactamase), Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella ESβL+, Shigella, Salmonella, Serratia, Proteus, Pseudomonas PDR (pandrug resistant), Stenotrophomonas, Acinetobacter, Burkholderia, Morganella [10]. Ryc. 1. Liczba nowych antybiotyków wprowadzanych do leczenia do roku 2012 (zmodyfikowano wg FDAs Center for Drug Evaluation and Research, CDER) [1]. Ryc. 2. Najnowsze trendy stosowania terapii z użyciem bakteriofagów jako metody alternatywnej wobec antybiotykoterapii i innych sposobów zwalczania wielolekoopornych zakażeń bakteryjnych [5]. www.zakazenia.org.pl 3

Sposób stosowania preparatu fagowego Miejscowo Forma aplikacji Dawka Częstotliwość dawkowania na dobę aerozol (inhalacje) 10 20 ml 1 2 razy krople do nosa lub ucha 2 3 krople, max 1 ml płyn do płukania: gardła, 10 40 ml/1 litr wody pochwy, przetok i jam, ropni; nasiadówki Doodbytniczo wlew 10 20 ml 1 2 razy Doustnie płyn 10 20 ml lizat fagowy 2 3 razy 5 10 ml oczyszczony preparat fagowy Tab. 1. Zasady stosowania preparatów fagowych w OTF, Wrocław [9]. Sposoby oraz zasady stosowania preparatów bakteriofagowych w OTF zostały przedstawione w tab. 1 [9]. Do oceny wyników eksperymentalnej terapii fagowej przeprowadzonej w OTF stosuje się siedmiostopniową skalę oznaczoną kolejnymi Ogonkowe: Siphoviridae (dsdna), Myoviridae (dsdna), Podoviridae (dsdna) Wielościenne: Leviviridae (ssrna), Microviridae (ssdna), Tectiviridae (dsdna), Corticoviridae (dsdna), Cystoviridae (dsrna) Włókienkowe: Inoviridae (ssdna), Lipothrixviridae (dsdna), Rudiviridae (dsdna) Pleomorficzne: Plasmaviridae (dsdna), Fuselloviridae (dsdna) Tab. 2. Typy morfologiczne bakteriofagów [13]. literami alfabetu A G, przy czym wyniki uzyskane w stopniu A C są klasyfikowane jako odpowiedź dobra, natomiast wyniki uzyskane w stopniu D G jako odpowiedź niewystarczająca [10]. Historia odkryć bakteriofagów Odkrycie i wprowadzenie bakteriofagów do leczenia przypisuje się kilku naukowcom. W 1915 roku brytyjski lekarz Frederick Twort zaobserwował zjawisko pojawienia się przejaśnień, tzw. łysinek, w hodowli gronkowca na podłożu stałym. Natomiast Felix d Herelle, francusko-kanadyjski mikrobiolog, w 1917 roku opisał Bacteriophagum intestinale, nieznany czynnik lityczny wyizolowany z przesączu kału chorych cierpiących na czerwonkę bakteryjną wywołaną przez pałeczki z rodzaju Shigella [11]. U ludzi bakteriofagi po raz pierwszy zostały zastosowane w 1921 roku w Belgii przez prof. Richarda Bruynoghe a w leczeniu gronkowcowych zakażeń skóry [12]. Biologia bakteriofagów Bakteriofagi to wirusy bakteryjne bardzo szeroko rozpowszechnione w przyrodzie, między innymi w powietrzu, glebie, wodach słodkich i słonych, gorących źródłach oraz ściekach. Obecne są także w hodowlach bakteryjnych, wydzielinach, wydalinach ludzi zdrowych, a także u ozdrowieńców po przebytych chorobach zakaźnych. Globalna populacja obejmuje około 10 31 bakteriofagów, a gospodarzami dla nich są mikroorganizmy ze wszystkich grup systematycznych, między innymi: Archea, Eubacteria, Cyanobacteria, Euryarchaeota, Crenarchaeota, Bacteroides, Chlamydiales, Deinococcus-Thermus, Firmicutes, Fusobacteria, Proteobacteria, Spirochetes. Taksonomia bakteriofagów została opracowana przez Międzynarodowy Komitet Taksonomii Wirusów (International Commitee on Taxonomy of Viruses, ICTV). Obecnie wyróżnia się 13 rodzin bakteriofagów, a przeszło 5300 fagów jest opisanych i scharakteryzowanych. Bakteriofagi są zbudowane z główki zawierającej kwas nukleinowy oraz otoczki białkowej (kapsydu) pokrytej kapsomerami. Ponad 96% bakteriofagów to wirusy ogonkowe. Kapsyd dzięki obecności swoistego białka wiążącego receptor Rbp (receptor-binding proteins) odgrywa ważną rolę w rozpoznaniu komórki bakteryjnej wrażliwej na zakażenie. Klasyfikacja bakteriofagów jest oparta na: rodzaju kwasu nukleinowego (jedno-, dwu niciowego DNA lub RNA), morfologii wirionu, profilu białkowym oraz morfologii łysinek [11, 13]. Według Ackermanna wyróżnia się cztery typy morfologiczne bakteriofagów (tab. 2) [13]. Bakteriofagi odgrywają ważną rolę w utrzymaniu równowagi w populacjach bakterii zasiedlających różne ekosystemy. Ich zdolność przenoszenia materiału genetycznego (między innymi genów kodujących czynniki wirulencji czy genów oporności na antybiotyki) w wyniku transdukcji bakteriofagowej pomiędzy bakteriami żyjącymi w różnych niszach ekologicznych wpływa na genetyczną zmienność bakterii [13]. 4 www.zakazenia.org.pl

klinika zakażeń Deghorain i wsp. wykazali, że około 25% genomów bakteryjnych to materiał bakteriofagowy [14]. Cykle replikacyjne bakteriofagów Namnażanie się bakteriofagów zachodzi jedynie w środowisku zawierającym młode, żywe bakterie będące w tzw. fazie logarytmicznego wzrostu. Nieaktywne są natomiast pozakomórkowe cząsteczki bakteriofagów, nazywane bakteriofagami dojrzałymi lub spoczynkowymi [15]. W komórce gospodarza bakteryjnego są możliwe różne cykle replikacyjne bakteriofagów, w tym: cykl lityczny, cykl lizogenny, zakażenie chroniczne, pseudolizogenia, restrykcja oraz zakażenie poronne (tab. 3) [2, 11, 16, 17, 18, 19]. Enzybiotyki enzymy pochodzenia bakteriofagowego Bakteriofagi są nośnikami licznych enzymów. Termin enzybiotyk został wprowadzony w 2001 roku dla enzymów litycznych pochodzenia bakteriofagowego, cechujących się zdolnością degradacji składników ściany komórkowej bakterii (hydrolazy peptydoglikanu) i mogących być stosowane jako substancje przeciwbakteryjne [20]. Endolizyny fagowe wytwarzane w końcowej fazie cyklu litycznego są zaangażowane w degradację ściany komórkowej bakterii. Stanowią one ważną grupę białek charakteryzujących się wysoką specyficznością i efektywnością katalityczną. W zależności od miejsca degradacji peptydoglikanu można wyróżnić kilka klas endolizyn, między innymi: muramidazy, amidazy, endopeptydazy oraz glukozaminidazy [20, 21]. Przykładem może być endolizyna bakteriofaga C1, pierwsza lizyna zastosowana w profilaktyce i leczeniu zapaleń gardła o etiologii Streptococcus z grupy serologicznej C, a także Streptococcus z grupy A i E [21]. Bakteriofagi a biofilm Cykl lityczny Cykl lizogenny Zakażenie chroniczne Pseudolizogenia Restrykcja Zakażenie poronne (abortive infection) Depolimerazy polisacharydów wytwarzane przez bakteriofagi degradują zewnątrzkomórkową macierz biofilmu bakteryjnego, co ułatwia bakteriofagom dostęp do powierzchni bakterii [22]. Lu i wsp. wykazali zwiększoną ekspresję dyspersyny B (DspB) u bakteriofaga T7 swoistego dla Escherichia coli. Dyspersyna B jest enzymem hydrolizującym integrynę kluczową dla biofilmu bakteryjnego β-1,6-n-acetylo- D-glukozaminę [23]. Rodzina Myoviridae. Bakteriofagi bezwzględnie lityczne, zjadliwe, wirulentne. Głównym celem cyklu litycznego jest namnażenie się cząstek bakteriofaga aż do całkowitej lizy komórek gospodarza bakteryjnego i uwolnienia nowych potomnych bakteriofagów do środowiska. Ze względu na wysoką specyficzność bakteriofagi lityczne są stosowane w terapii fagowej [2]. Rodzina Siphoviridae. Bakteriofagi łagodne, umiarkowane, synchroniczne. Reprodukują się z gospodarzem bakteryjnym przez wiele pokoleń. Zintegrowanie genomu bakteriofaga do chromosomu gospodarza bakteryjnego prowadzi do jego utajenia w postaci profaga. Profagi są dziedzicznymi determinantami lizogenii. W pewnych sytuacjach dochodzi do tzw. spontanicznej utraty profaga, a bakteria lizogenna może pozostać żywa jak komórka niezakażona. Badania dowodzą, iż wiele gatunków bakterii zawiera w swoim genomie więcej niż jeden profag. Pozbawiony profagów jest genom Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 [16]. Indukcja profaga to uruchomienie procesu litycznegopołączonego z wyzwalaniem bakteriofaga infekcyjnego. Zjawisko to może zachodzić pod wpływem działania czynników fizycznych, np. promieniowania nadfioletowego, UV, X, lub czynników chemicznych, takich jak mutageny (mitomycyna C), nadtlenek wodoru, leki. Konwersja lizogenna/lizogeniczna odbywa się z udziałem bakteriofagów niosących geny zwane moronami LCG (lysogenic conversion genes). Efektem tego jest zmiana fenotypu gospodarza bakteryjnego wskutek integracji bakteriofaga [16]. W czasie cyklu gospodarz bakteryjny zachowuje zdolność wzrostu i podziałów pomimo replikacji bakteriofagów oraz ich ciągłego uwalniania do środowiska [17]. Zachodzi, gdy bakteriofag infekuje komórkę bakteryjną, natomiast nie replikuje się w niej i nie przechodzi w stan lizogenii. Niestabilność pseudolizogenii umożliwia uruchomienie alternatywnych dróg zakażenia: lityczną, lizogenną lub chroniczną [11]. Zachodzi w dużej mierze z udziałem bakteryjnego systemu restrykcji/modyfikacji. Penetracja genomu bakteriofaga do opornej komórki bakteryjnej może doprowadzić do zniszczenia wirusa i przeżycia komórki bakteryjnej [18]. Konsekwencją wniknięcia genomu bakteriofaga jest śmierć komórki gospodarza bakteryjnego, bez towarzyszącej replikacji bakteriofaga [19]. Tab. 3. Przykłady różnych cykli rozwojowych układu bakteriofag-komórka gospodarza. www.zakazenia.org.pl 5

data przyjęcia pracy 7.01.2016 data akceptacji 27.01.2015 Podsumowanie W piśmiennictwie fachowym są dostępne opisy terapeutycznego zastosowania bakteriofagów u pacjentów z zakażeniami wielolekoopornymi szczepami bakterii, a opisane terapie zazwyczaj kończą się sukcesem klinicznym. Dlatego też duże nadzieje wiąże się z terapią fagową jako skuteczną i bezpieczną metodą leczenia zakażeń, stosowaną alternatywnie wobec antybiotykoterapii lub uzupełniająco. Autorzy deklarują brak konfliktu interesów. Piśmiennictwo: 1. CDER. The Center for Drug Evaluation and Research, http://www.fda.gov/ 2. Zhang H. T., Liu H.: Laboratory-based evaluation of MDR strains of Pseudomonas in patients with acute burn injuries, Int J Clin Exp Med 2015, 8 (9), 16512 9. 3. Rossi F., Diaz L., Wollam A., Panesso D., Zhou Y., Rincon S., Narechania A., Xing G., Di Giota T. S., Doi A., Tran T. T., Reyes J., Munita J. M., Carvajal L. P., Hernandez-Roldan A., Brandão D., van der Heijden I. M., Murray B. E., Planet P. J., Weinstock G. M., Arias C. A.: Transferable vancomycin resistance in a community-associated MRSA lineage, N Eng J Med 2014, 370 (16), 1524 31. 4. Oliveira H., Sillankorva S., Merabishvili M., Kluskens L. D., Azeredo J.: Unexploited opportunities for phage therapy, Front Farmacol 2015, 6, 180. 5. Phage Therapy @ phage-therapy.org by Stephen T. Abedon, PH.D., Assoc. Prof. Microbiol., The Ohio State University, http://www.phage-therapy.org/ 6. Zwiefka A., Weber-Dąbrowska B., Górski A.: Computer simulations of phage therapy, Adv Clin Exp Med 2003, 12 (1), 105 9. 7. Deklaracja Helsińska Światowego Stowarzyszenia Lekarzy: Etyczne zasady prowadzenia badań medycznych z udziałem ludzi, przyjęta przez 18 Zgromadzenie Ogólne Światowego Stowarzyszenia Lekarzy (WMA), Helsinki, czerwiec 1964 rok, ostatnia modyfikacja 2003 rok. 8. Kutaleladze M.: Experience of the Eliava Institute in bacteriophage therapy, Virol Sin 2015, 30 (1), 80 1. 9. Konferencja naukowo-szkoleniowa Postępy w profilaktyce i leczeniu zakażeń bakteryjnych: terapia fagowa i szczepionki nieswoiste jako alternatywa dla antybiotyków, Kraków, 22 maja 2015 roku. 10. Międzybrodzki R., Borysowski J., Weber- -Dąbrowska B., Szufnarowski K., Pawełczyk Z., Rogóż P., Kłak M., Wojtasik E., Górski A.: Clinical aspects of phage therapy, Adv Virus Res 2012, 83, 73 121. 11. Abedon S. T.: Bacteriophage ecology: Population growth, evolution and impact of bacterial viruses, Cambridge University Press, New York 2008. 12. Lavigne R., Robben J.: Professor Dr. Richard Bruynogh e. A 1951 overview of his bacteriophage research spanning three decades, Bacteriophage 2012, 2 (1), 1 4. 13. Ackermann H-W.: Bacteriophage observations and evolution, Res Microbiol 2003, 154, 245 51. 14. Deghorain M., Van Melderen L.: The Staphylococci phages family: An Overview, Viruses 2012, 4, 3316 35. 15. Ślopek S.: Mikrobiologia lekarska, Państwowy Zakład Wydawnictw Lekarskich, Warszawa 1972. 16. Canchaya C., Proux C., Fournous G., Bruttin A., Brüssow H.: Prophage genomics, Microbiol Mol Biol Rev 2003, 67, 238 76. 17. Russel M., Model P.: Filamentous phage, [w:] The bacteriophages (second edition), R. C. Calendar, ed. Oxford University Press Inc, New York 2006, 146 60. 18. Wilson G. G., Murray N. E.: Restriction and modification systems, Ann Rev Genet 1991. 19. Samson J. E., Bélanger M., Moineau S.: Effect of the abortive infection mechanism and type III toxin/ antitoxin system AbiQ on the lytic cycle of Lactococcus lactis phages, J Bacteriol 2013, 195 (17), 3947 56. 20. Hermoso J. A., Garcia J. L., Garcia P.: Taking aim on bacterial pathogens from phage therapy to enzybiotics, Current Opinion in Microbiology 2007, 10, 1 12. 21. Nelson D., Loomis L., Fischetti V. A.: Prevention and elimination of upper respiratory colonization of mice by group A streptococci by using a bacteriophage lytic enzyme, Proc Natl Acad Sci USA 2001, 98 (7), 4107 12. 22. Fu W., Foster T., Mayer O., Curtin J. J., Lehman S. M., Donlan R. M.: Bacteriophage cocktail for the prevention of biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa on catheters in an in vitro model system,. Antimicrob Agents Chemother 2010, 54 (1), 397 404. 23. Lu T. H., Collins J. J.: Dispersing biofilms with engineered enzymatic bacteriophage, Proc Natl Acad Sci USA 2007, 104 (27), 11197 202. 6 www.zakazenia.org.pl