Osteoprotegeryna czy nowy marker procesu miażdżycowego pomoże w wykrywaniu osób zagrożonych amputacją?

:1 54 Praca poglądowa Aleksandra Rumianowska Piotr Nehring Beata Mrozikiewicz-Rakowska Przemysław Krasnodębski Osteoprotegeryna czy nowy marker procesu miażdżycowego pomoże w wykrywaniu osób zagrożonych amputacją? Osteoprotegerin a new marker of atherosclerosis helpful in selecting patients at amputation risk? Katedra i Klinika Gastroenterologii i Chorób Przemiany Materii Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego w Warszawie }} Beata Mrozikiewicz-Rakowska, Katedra i Klinika Gastroenterologii i Chorób Przemiany Materii Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego, ul. Banacha 1a, 02-097 Warszawa, Tel.: (22) 599 28 38, Fax: (22) 599 18 38, e-mail: prakowski@interia.pl Wpłynęło: 15.02.2011 Zaakceptowano: 23.03.2011 Streszczenie: Spośród wielu cytokin odgrywających rolę w patogenezie procesu miażdżycowego, w ostatnim czasie wiele zainteresowania poświęca się osteoprotegerynie. Jedną z podstawowych funkcji glikoprotein układu OPG/RANKL/RANK jest regulacja procesów związanych z przebudową tkanki kostnej. W świetle najnowszych badań wydaje się, że zaburzenia równowagi pomiędzy poszczególnymi składowymi osi OPG/RANKL/RANK mogą być jedną z głównych przyczyn zjawisk, takich jak utrata gęstości mineralnej tkanki kostnej, ale także pozakostna kalcyfikacja. Wykazano, iż u osób z zespołem stopy cukrzycowej stężenie OPG w surowicy jest wyższe niż u osób bez tego zespołu oraz w grupie kontrolnej osób bez cukrzycy. Wydaje się, że układ OPG/RANK/RANKL bierze udział w kalcyfikacji naczyń, który leży u podłoża wielu powikłań, w tym zespołu stopy cukrzycowej. Stan wiedzy o mechanizmach działania układu OPG/RANKL/RANK w zmienionych chorobowo naczyniach daje wiele możliwości wykorzystania w diagnostyce, ocenie klinicznej oraz leczeniu zmian naczyniowych. Słowa kluczowe: cukrzyca osteoartropatia osteoprotegeryna staw Charcota Abstract: Among many cytokines involved in pathogenesis of atherosclerosis one of the cytokines on which the recent research concentrates is osteoprotegerin. Main role of OPG/RANKL/RANK glycoprotein complex is regulation of bone tissue remodeling process. Due to recent researches, we may presume that changes in balance between OPG/RANKL/RANK complex may be the main cause of mineral bone density loss and extraskeletal calcification. Research prove that OPG serum level is higher among patients with diabetic foot syndrome comparing to individuals without this syndrome and within regular control group. It seems that OPG/RANK/RANKL complex is involved in vascular calcification process that is a factor of diabetic foot syndrome etiopathogenesis. Knowledge about OPG/RANKL/RANK complex function in pathologically changed vessels may be potentially useful in diagnostic process, clinical evaluation and vascular abnormalities therapy. Key words: Charcot joint diabetes osteoarthropathy osteoprotegerin Wstęp Spośród wielu cytokin odgrywających rolę w patogenezie procesu miażdżycowego, w ostatnim czasie wiele zainteresowania poświęca się osteoprotegerynie. Początkowo była ona postrzegana jako jeden z elementów remodelacji tkanki kostnej. Obecnie próbuje się znaleźć zależności pomiędzy nasileniem procesu miażdżycowego a nieprawidłowościami w procesie przebudowy układu kostnego. Ogniwem łączącym te dwa procesy może być osteoprotegeryna. W ciągu ostatnich lat bardzo rozwinęła się wiedza na temat układu cząsteczek OPG/RANKL/RANK należących do rodziny czynnika martwicy nowotworów (ang. tumor necrosis factor TNF). Układ OPG/RANKL/RANK Dotychczas uważano, iż jedną z podstawowych funkcji glikoprotein układu OPG/RANKL/RANK jest regulacja procesów związanych z przebudową tkanki kostnej [1]. RANKL (ang. receptor activator of nuclear factor-β ligand) jest białkiem produkowanym m.in. przez osteoblasty i komórki zrębu szpiku [2]. Cząsteczka ta może występować

w formie związanej z błoną komórkową i rozpuszczalnej. RANKL łączy się ze znajdującym się na preosteoklastach błonowym białkiem RANK (ang. receptor activator of nuclear factor-β), co pobudza preosteoklasty do dojrzewania w kierunku osteoklastów oraz promuje osteolizę [3]. Jednocześnie z RANKL przez osteoblasty produkowana jest osteoprotegeryna (OPG). OPG jest rozpuszczalnym receptorem-pułapką dla RANKL [1 3]. Neutralizując RANKL, hamuje osteoklastogenezę i reguluje proces osteolizy (Ryc. 1) [3]. Wzajemne oddziaływanie cząsteczek zapewnia równowagę między tworzeniem i niszczeniem kości. Od niedawna wiadomo jednak, że układ OPG/RANKL/RANK prawdopodobnie nie jest związany wyłącznie z regulacją obrotu kostnego, a cząsteczki te ulegają ekspresji w wielu komórkach naszego ustroju, m.in. w fibroblastach, limfocytach, komórkach dendrytycznych oraz komórkach śródbłonka naczyniowego, sercu, jelitach [2 5]. Poza tym, osteoprotegeryna ma zdolność neutralizowania białka TRAIL (ang. TNF-related apoptosis-inducing ligand), przez co wpływa hamująco na proces apoptozy, m.in. w komórkach śródbłonka [5 7]. Rola układu OPG/RANKL/RANK w procesie kalcyfikacji naczyń W świetle najnowszych badań wydaje się, że zaburzenia równowagi pomiędzy poszczególnymi składowymi osi OPG/RANKL/RANK mogą być jedną z głównych przyczyn zjawisk, takich jak utrata gęstości mineralnej tkanki kostnej, ale także pozakostna kalcyfikacja. Prawdopodobnie układ ten odgrywa rolę w rozwoju zmian miażdżycowych w przebiegu chorób układu sercowo-naczyniowego, w tym zmian towarzyszących cukrzycy. Coraz więcej badań pokazuje, że odpowiedzi na pytanie, jak dochodzi do zmian naczyniowych w cukrzycy, należy szukać w relacjach tych powikłań z działaniem szlaku OPG/RANKL/RANK. Możliwe, że dokładniejsze poznanie procesów zachodzących z udziałem tej osi, pozwoli nie tylko poznać patofizjologię zmian, ale także poszukiwać najbardziej efektywnych sposobów ich diagnozowania i leczenia. Udział OPG/RANKL/RANK w patogenezie zespołu stopy cukrzycowej Wiele najnowszych badań dowodzi, że cytokiny układu OPG/RANKL/RANK zaangażowane są w powstawanie zmian naczyniowych, również tych odpowiedzialnych za rozwój zespołu stopy cukrzycowej, w tym osteoartropatii Charcota. Potwierdzają to m.in. wyniki badania przeprowadzonego przez Guldikena i wsp. [8]. Wykazano, iż u osób z zespołem stopy cukrzycowej stężenie OPG w surowicy jest wyższe niż u osób bez tego zespołu oraz w grupie kontrolnej osób bez cukrzycy. W tym samym badaniu oznaczono także stężenia sfas oraz sfas-ligand cząsteczek biorących udział w tzw. śmierci komórek w wyniku aktywacji (ang. AICD activation-induced cell death) [9]. Stężenia tych białek były również wyższe u pacjentów z zespołem stopy cukrzycowej i korelowały z poziomem OPG. Wyniki badania sugerują, że w rozwoju zmian miażdżycowych ma udział proces apoptozy komórek naczyń krwionośnych, a stężenie OPG związane jest z nasileniem tego procesu. Lajer i wsp. przeprowadzili prospektywne badania na grupie 573 osób z cukrzycą typu 1, w których oceniano zależność między stężeniem OPG a rozwojem zespołu stopy cukrzycowej [10]. Wykazano, że w czasie 12-letniej obserwacji, u osób z podwyższonym stężeniem OPG znamiennie Osteoblast/ komórka zrębu szpiku Preosteoklast Osteoklast RANK RANKL Ryc. 1. Schemat przedstawiający oddziaływanie między cząsteczkami układu OPG/RANKL/RANK. Zmodyfikowano wg: Uproszczony schemat roli poszczególnych składników układu RANK/RANKL/OPG w regulacji osteoklastogenezy w warunkach prawidłowych i w szpiczaku plazmocytowym [2]. OPG 30

częściej niż u osób z niskim stężeniem OPG dochodziło do rozwoju owrzodzeń stóp (RR=1,5 [1,0 2,1], p=0,04) oraz utraty tętna w ich obrębie (RR=2,2 [1,0 4,6], p=0,04). Ponadto, badanie to wykazało, iż wysokie stężenie OPG jest niezależnym czynnikiem ryzyka utraty tętna oraz rozwoju owrzodzeń stopy u pacjentów z cukrzycą typu 1. U pacjentów z wyższym stężeniem OPG częściej przeprowadzono zabiegi rewaskularyzacyjne lub amputacje (RR=2,9 [1,7 5,0], p<0,001), jednak po skorelowaniu względem innych czynników ryzyka, ryzyko względne nie było istotne statystycznie. O Sullivan i wsp. wykazali zależność pomiędzy stężeniem OPG a stopniem nasilenia choroby naczyń obwodowych (PAD ang. peripheral arterial disease) [11]. Uczestnikom badania (3 podgrupy: 1. z PAD, 2. z cukrzycą typu 2 i z PAD, 3. z cukrzycą typu 2 bez PAD) obliczano wskaźnik kostka-ramię (ABI ang. ankle-brachial index) oraz oznaczono stężenie OPG w surowicy. Wykazano, że stężenie tej cytokiny jest wyższe u osób z chorobami tętnic obwodowych niezależnie od obecności cukrzycy aniżeli u osób bez PAD. Ponadto, zaobserwowano odwrotną zależność między stężeniem OPG a wartością ABI. Do podobnych wniosków doszli Eleftheriadou i wsp. [12] oraz Edmonds i wsp. [13], którzy również badali pacjentów z cukrzycą. Wykazano, iż stężenie OPG w surowicy koreluje ze stopniem kalcyfikacji naczyniowej w tętnicach grzbietowych stóp i piszczelowych tylnych, ocenianych na podstawie zdjęć radiologicznych [12, 13]. Wyniki powyższych badań wskazują, że podczas rozwoju zmian naczyniowych w cukrzycy, dochodzi do wzrostu stężenia osteoprotegeryny. Mechanizm tego zjawiska dokładnie nie jest poznany. Wydaje się, że układ OPG/RANKL/ RANK bierze udział w kalcyfikacji naczyń procesie, który jest nasilony w cukrzycy i leży u podłoża wielu powikłań, w tym zespołu stopy cukrzycowej. Za udziałem tych białek w powikłaniach cukrzycy przemawia fakt, że u osób z neuropatią cukrzycową obserwuje się jednoczesne występowanie osteopenii i zwapnień naczyniowych [14, 15]. Teorie mechaniczne nie wyjaśniają jednak w pełni patomechanizmu tego zjawiska [3, 16 19]. U pacjentów z neuropatią cukrzycową obserwuje się podwyższone stężenie OPG, które koreluje ze stopniem osłabienia czucia wibracji (ocenianym za pomocą neurotensjometru), a więc ze stopniem nasilenia neuropatii [13]. Obecnie wydaje się, że ścieżka OPG/ RANKL/RANK jest ogniwem łączącym neuropatię cukrzycową z kalcyfikacją naczyń i nadmierną resobcją kostną, które są charakterystyczne dla zmian obserwowanych u osób ze stawem Charcota [3, 20 22]. Wiadomo, że aktywacja RANK z jednej strony reguluje obrót kostny, a z drugiej, poprzez wpływ na ekspresję białek macierzy kostnej w miocytach naczyń krwionośnych, bierze udział w wapnieniu miocytów naczyń wieńcowych i obwodowych [19]. Możliwe, że czynniki, które będą zwiększać ekspresję RANKL, będą pobudzały zarówno kalcyfikację naczyń, jak i zaburzony obrót kostny [19]. OPG, która wiąże RANKL, wydaje się mieć funkcję ochronną wobec kości i naczyń. U myszy pozbawionych ekspresji tej glikoproteiny obserwuje się osteoporozę i zwiększone ryzyko złamań kości oraz nadmierne odkładanie wapnia w warstwie środkowej i wewnętrznej ściany naczyń krwionośnych [23 25]. W ostrej postaci neuroartropatii Charcota, która pierwotnie związana jest z aseptycznym stanem zapalnym, wydzielane są cytokiny prozapalne, m.in. TNF-α i IL-1β [27, 28], które powodują wzrost ekspresji RANKL [3]. Cząsteczka RANKL pobudza receptor aktywujący NFκB (RANK), przez co wzmaga osteoklastogenezę i resorpcję kości [3]. Jednocześnie TNF-α i IL-1 (poprzez zwiększenie ekspresji NFκB, która jest już wyjściowo podwyższona u osób z neuropatią cukrzycową [27]) powodują nasilenie wydzielania OPG, która jest receptorem-pułapką dla cząsteczek RANKL i hamuje osteoklastogenezę oraz osteolizę wywoływaną przez RANKL [3, 27]. Potwierdzeniem powyższej teorii, mówiącej o udziale stanu zapalnego w inicjowaniu pobudzenia szlaku, są wyniki badania przeprowadzonego przez Jude i wsp. Naukowcy oceniali stężenia OPG i RANKL w surowicy 12 pacjentów ze stawem Charcota, najpierw w fazie ostrej, a następnie po 12 miesiącach leczenia w fazie konsolidacji. Wykazano, że poziom obu cytokin jest podwyższony w ostrej fazie choroby, natomiast znamiennie obniża się po leczeniu (stężenie RANKL 0,102±0,094 pg/ml vs 0,093±0,081 pg/ml, p=0,002 oraz stężenie OPG 9,56±3,24 pmol/l vs 9,34±3,15 pmol/l, p=0,045) [29]. Dowodzi to, że ścieżka OPG/RANKL/RANK jest szczególnie silnie aktywowana podczas rozwoju neuroartropatii Charcota. Wydaje się, że oznaczanie poziomu tych cytokin może być przydatne w określeniu, jak aktywny jest proces chorobowy i jaka jest dynamika jego rozwoju. Możliwe, że oznaczanie poziomu OPG stanie się badaniem, które pozwoli zróżnicować ostrą neuroartropatię z innymi schorzeniami przebiegającymi z objawami miejscowego stanu zapalnego. Być może blokowanie szlaków działających poprzez NF-κB stanie się ważnym elementem terapii powikłań kostnych i naczyniowych w cukrzycy. Należy dodać, że część pacjentów z neuropatią cukrzycową może być predysponowana do rozwoju zmian osteolityczych i kalcyfikacji naczyń, co przynajmniej częściowo jest związane z polimorfizmem genu osteoprotegeryny [3, 30]. Poza tym warto podkreślić, że miejscowy stan zapalny, który ma pobudzać układ OPG/RANKL/RANK, w pewnym sensie jest procesem samonapędzającym się, ponieważ pacjenci z neuropatią cukrzycową mają zaburzenia czucia bólu i przez to mogą nie oszczędzać stopy dotkniętej stanem zapalnym w ostrej fazie neuroartropatii; to natomiast prowadzi do nasilania miejscowego stanu zapalnego [3]. Raz rozpoczęty proces może rozwijać się w coraz większym tempie, dlatego ważna jest szybka, trafna diagnoza i wdrożenie odpowiedniego postępowania, by zapobiec powstawaniu nieodwracalnych deformacji [3, 16]. 31

Rola układu OPG/RANKL/RANK w promowaniu procesu miażdżycowego Układ OPG/RANKL/RANK wydaje się być zaangażowany w szeroko rozumiany proces kalcyfikacji naczyń. Obserwowana jest korelacja pomiędzy stężeniem OPG w surowicy a przebiegiem i rokowaniem w miażdżycy oraz chorobie wieńcowej, a także zwiększoną śmiertelnością z przyczyn sercowo-naczyniowych u chorych na cukrzycę w porównaniu do populacji ogólnej [31, 32]. W badaniu Schoppeta i wsp. stwierdzono związek podwyższonego stężenia tej glikoproteiny z bardziej nasilonym przebiegiem choroby niedokrwiennej serca u mężczyzn z cukrzycą [33]. Wykazano, że stężenie OPG koreluje z zaawansowaniem zmian miażdżycowych w tętnicach wieńcowych [31, 34]. W badaniach zespołu Kiechla udowodniono, że OPG stanowi niezależny czynnik ryzyka progresji miażdżycy, występowania incydentów wieńcowych i związanej z tym śmiertelności [32]. Opisywana jest także korelacja między wysokim stężeniem OPG w surowicy a śmiertelnością w grupie starszych kobiet chorych na cukrzycę [35]. Dokładny patomechanizm, w którym dochodzi do podwyższenia poziomu OPG w miażdżycy jest nieznany. U osób w początkowym stadium miażdżycy obserwuje się zwiększoną ekspresję cząsteczki RANKL w macierzy pozakomórkowej otaczającej blaszkę miażdżycową, natomiast u osób z objawową miażdżycą dochodzi w blaszkach miażdżycowych do zwiększenia ekspresji OPG, co może sugerować, że produkcja OPG jest reakcją wtórną [36]. Niewykluczone, że hipoteza dotycząca rozwoju stawu Charcota, mówiąca, że stan zapalny powoduje wzrost ekspresji RANKL, może tłumaczyć rozwój kalcyfikacji naczyniowej w całym organizmie, w tym miażdżycę dużych naczyń. Wielu schorzeniom, m.in. miażdżycy, cukrzycy, innym zaburzeniom metabolicznym i nadciśnieniu tętniczemu, towarzyszy subkliniczny stan zapalny. Przyczyną stanu zapalnego może być uszkodzenie śródbłonka. Wiele badań potwierdziło ścisłą zależność między dysfunkcją komórek endotelium a podwyższoną ekspresją OPG [37, 38]. Wiadomo, że różne cytokiny prozapalne, m.in. TNF-α i IL-1, mają udział w rozwoju kalcyfikacji naczyń, a z drugiej strony wykazują zdolność pobudzania syntezy osteoprotegeryny [27, 39 41]. Wygląda na to, że podczas wapnienia ściany naczyń, jednocześnie przez te same cytokiny uruchamiany jest mechanizm przeciwstawiający się kalcyfikacji [5]. Jednak dokładna rola osteoprotegeryny w powstawaniu zmian naczyniowych nie jest jeszcze wyjaśniona i wymaga dalszych badań. OPG zdaje się również odgrywać rolę w procesie apoptozy indukowanej przez TRAIL przekaźnik z nadrodziny TNF, który łącząc się z receptorami błonowymi komórki, rozpoczyna proces śmierci komórkowej. OPG ma możliwość blokowania ligandu TRAIL i jego łączenia z receptorami aktywującymi apoptozę, a więc także hamowania procesu śmierci komórkowej. Zaobserwowano zależność pomiędzy stosunkiem OPG/TRAIL u pacjentów z chorobą wieńcową, zawałem serca oraz powstałą wskutek niego niewydolnością serca [42]. Chorzy z chorobą niedokrwienną serca charakteryzowali się zwiększonym stosunkiem OPG/TRAIL. U pacjentów z zawałem serca stężenie OPG znacząco się podwyższyło, podczas gdy stężenie TRAIL spadło. Co więcej, stosunek OPG/TRAIL był istotnie wyższy u tych chorych, którzy rozwinęli niewydolność serca związaną z zawałem. Możliwe, że OPG reguluje proces apoptozy również przez interakcję z cytokinami Fas i Fas-ligand. Wspominaliśmy wcześniej o badaniu Guldikena i wsp., w którym wykazano, że u osób z ZSC stężenie OPG w surowicy koreluje ze stężeniami cytokin Fas i Fas-ligand, będącymi wykładnikami nasilenia procesu apoptozy [8]. Podsumowanie Odkrycie udziału szlaku OPG/RANKL/RANK w patogenezie zmian naczyniowych ma ogromne znaczenie praktyczne. Wiedza ta zmienia sposób myślenia o wielu schorzeniach. Aktualizowanie stanu wiedzy o mechanizmach działania układu OPG/RANKL/RANK w zmienionych chorobowo naczyniach daje wiele możliwości potencjalnego wykorzystania OPG i pozostałych białek tej osi w diagnostyce, ocenie klinicznej oraz leczeniu zmian naczyniowych, również wynikających z obecności cukrzycy. Próbuje się również oceniać przydatność OPG jako markera stanu zaawansowania choroby niedokrwiennej serca i czynnika predykcyjnego incydentów sercowo-naczyniowych. Piśmiennictwo 1. Lacey DL, Timms E, Tan HL et al. Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation. Cell 1998;93(2):165 176. 2. Zdzisińska B, Kandefer-Szerszeń M. Role of RANK/RANKL and OPG in multiple myeloma. Post Hig Med Dosw 2006;60:471 482. 3. Molines L, Darmon P, Raccah P. Charcot s foot: newest findings on its pathophysiology, diagnosis and treatment. Diabetes Metab 2010;36(4):251 255. 4. Schoppet M, Preissner KT, Hofbauer LC. RANK ligand and osteoprotegerin: paracrine regulators of bone metabolism and vascular function. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2002;22(4):549 553. 5. Kilińska L, Bogdański P, Szulińska M et al. Rola osteoprotegryny w chorobach sercowo-naczyniowych. Farmacja Współczesna 2009;2:151 155. 6. Emery JG, McDonnell P, Burke MB et al. Osteoprotegerin is a receptor for cytotoxic ligand TRAIL. J Biol Chem 1998;273(23):14363 14367. 7. Malyankar UM, Scatena M, Suchland KL, Yun TJ, Clark EA, Giachelli CM. Osteoprotegerin is an alpha 3-induced, NF-kappa B-dependent survival factor for endothelial cells. J Biol Chem 2000;275(28):20959 20962. 8. Guldiken S, Taskiran B, Demir M et al. Role of soluble Fas/Fas ligand pathway and osteoprotegerin levels in patients with diabetic foot. Endocrine Abstracts 2010;20:343. 9. Gołąb J, Jakóbisiak M, Lasek W, Stokłosa T. Immunologia. Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa, 2007, pp. 254. 10. Lajer M, Jorsal A, Tarnow L et al. Role of osteoprotegerin (OPG) in predicting development of foot ulcer and loss of foot pulse in type 1 diabetic patients with and without diabetic nephropathy. Diabetologia 2010;53(1):55 56. 32

11. O Sullivan EP, Ashley DT, Davenport C et al. Peripheral arterial disease is associated with higher levels of serum osteoprotegerin regardless of glycaemic status. Diabetes 2009;58:???????????. 12. Eleftheriadou I, Grigoropoulou P, Argiana V et al. The association between serum osteoprotegerin levels with lower extremity arterial calcification in patients with type 2 diabetes mellitus. Diabetologia 2010;53(3):502. 13. Edmonds ME, Korzon-Burakowska A, Chaparro RS et al. Serum levels of osteoprotegerin are raised in diabetic peripheral neuropathy and are significantly correlated with peripheral arterial calcification. Diabetologia 2009;52(1):97. 14. Rajbhandari SM, Jenkins RC, Davies C, Tesfaye S. Charcot neuroarthropathy in diabetes mellitus. Diabetologia 2002;45(8):1085 1096. 15. Jeffcoate W, Lima J, Nobrega L. The Charcot foot. Diabet Med 2000; 17(4):253 258. 16. Kamińska A, Bronisz A, Kamiński M, Junik R. Cukrzycowa neuroartropatia Charcota. Diabetologia Doświadczalna i Kliniczna 2004;4(3):175 179. 17. Jeffcoate WJ, Game FL, Cavanagh PR. The role of proinflammatory cytokines in the cause of neuropathic osteoarthropathy (acute Charcot foot) in diabetes. Lancet 2005;366(9502):2058 2061. 18. Edmonds ME, Clarke MB, Newton S, Barrett J, Watkins PJ. Increased uptake of bone radiopharmaceutical in diabetic neuropathy. Q J Med 1985;57(224):843 855. 19. Jeffcoate W. Vascular calcification and osteolysis in diabetic neuropathy is RANK-L the missing link? Diabetologia 2004;47(9):1488 1492. 20. Jeffcoate WJ, Rasmussen LM, Hofbauer LC, Game FL. Medial arteria calcification in diabetes and its relationship to neuropathy. Diabetologia 2009;52(12):2478 2488. 21. Clouse ME, Gramm HF, Legg M, Flood T. Diabetic osteoarthropathy: clinical and roentgenographic observations in 90 cases. Am J Roentgenol Radium Ther Nucl Med 1974;121(1):22 34. 22. Sinha S, Munichoodappa C, Kozak GP. Neuro-arthropathy (Charcot joints) in diabetes mellitus: a clinical study of 101 cases. Medicine (Baltimore) 1972;51(3):191 210. 23. Simonet WS, Lacey DL, Dunstan CR et al. Osteoprotegerin: a novel secreted protein involved in the regulation of bone density. Cell 1997;89(2):309 319. 24. Bucay N, Sarosi I, Dunstan CR et al. Osteoprotegerin-deficient mice develop early onset osteoporosis and arterial calcification. Genes Dev 1998;12(9):1260 1268. 25. Mizuno A, Amizuka N, Irie K et al. Severe osteoporosis in mice lacking osteoclastogenesis inhibitory factor/osteoprotegerin. Biochem Biophys Res Commun 1998;247(3):610 615. 26. Baumhauer JF, O Keefe RJ, Schon LC, Pinzur MS. Cytokine-induced osteoclastic bone resorption in Charcot arthropathy: an immunohistochemical study. Foot Ankle Int 2006;27(10):797 800. 27. Jeffcoate WJ. Abnormalities of vasomotor regulation in the pathogenesis of the acute Charcot foot of diabetes mellitus. Int J Low Extrem Wounds 2005;4(3):133 137. 28. Petrova NL, Moniz C, Elias DA, Buxton-Thomas M, Bates M, Edmonds ME. Is there a systemic inflammatory response in the acute Charcot foot? Diabetes Care 2007;30(4):997 998. 29. Jude EB, Ndip A, Boulton AJM. Serum levels of the receptor activator of nuclear factor kappa-b ligand (RANK-L) and its decoy receptor, osteoprotegerin (OPG) are high in acute phase charcot neuroarthropathy and decreased in the quiescent chase. Diabetes 2009;58:??????????. 30. Pitocco D, Zelano G, Gioffr e G et al. Association between osteoprotegerin G1181C and T245G polymorphisms and diabetic Charcot neuroarthropathy. Diabetes Care 2009;32(9):1694 1697. 31. Jono S, Ikari Y, Shioi A et al. Serum osteoprotegerin levels are associated with the presence and severity of coronary artery disease. Circulation 2002;106(10):1192 1194. 32. Kiechl S, Schett G, Wenning G et al. Osteoprotegerin is a risk factor for progressive atherosclerosis and cardiovascular disease. Circulation 2004;109(18):2175 2180. 33. Schoppet M, Sattler M, Schaefer J, Herzum M, Masch B, Hofbauer LC. Increased osteoprotegerin serum levels in men with coronary artery disease. J Clin Endocrinol Metab 2003;88(3):1024 1028. 34. Omland T, Drazner MH, Ueland T et al. Plasma osteoprotegerin levels in the general population relation to indices of left ventricular structure and function. Hypertension 2007;49(6):1392 1398. 35. Browner WS, Lui LY, Cummings SR. Associations of serum osteoprotegerin levels with diabetes, stroke, bone density, fractures and mortality in elderly women. J Clin Endocrinol Metab 2001;86(2):631 637. 36. Golledge J, McCann M, Mangan S, Lam A, Karan M. Osteoprotegerin and osteopontin are expressed in high concentrations within symptomatic carotid atherosclerosis. Stroke 2004;35(7):1636 1641. 37. Secchiero P, Corallini F, Pandolfi A et al. An increased osteoprotegerin serum release characterizes the early onset of diabetes mellitus and may contribute to endothelial cell dysfunction. Am J Pathol 2006;169(6):2236 2244. 38. Shin JY, Shin YG, Chung CH. Elevated serum osteoprotegerin levels are associated with vascular endothelial dysfunction in type 2 diabetes. Diabetes Care 2006;29(7):1664 1666. 39. Collin-Osdoby P, Rothe L, Anderson F, Nelson M, Maloney W, Osdoby P. Receptor activator of NF-kappa B and osteoprotegerin expression by human microvascular endothelial cells, regulation by inflammatory cytokines, and role in human osteoclastogenesis. J Biol Chem 2001;276(23):20659 20672. 40. Tintut Y, Patel J, Parhami F, Demer LL et al. Tumor necrosis factor-alpha promotes in vitro calcification of vascular cells via the camp pathway. Circulation 2000;102(21):2636 2642. 41. Zhang J, Fu M, Myles D et al. PDGF induces osteoprotegerin expression in vascular smooth muscle cells by multiple signal pathways. FEBS Lett 2002;521(1 3):180 184. 42. Secchiero P, Corallini F, Beltrami AP et al. An imbalanced OPG/TRAIL ratio is associated to severe acute myocardial infarction. Atherosclerosis 2009;210(1):274 277. 33