WPŁYW STĘŻENIA GLUKOZY NA SYNTEZĘ KWASU SZCZAWIOWEGO PRZEZ ASPERGILLUS NIGER1

Acta Sci. Pol., Biotechnologia 13 (4) 2014, 19-28 ISSN 1644 065X (print) ISSN 2083 8654 (on-line) WPŁYW STĘŻENIA GLUKOZY NA SYNTEZĘ KWASU SZCZAWIOWEGO PRZEZ ASPERGILLUS NIGER1 Ewa Walaszczyk, Karol Dawidowicz, Elżbieta Gąsiorek, Waldemar Podgórski Uniwersytet Ekonomiczny we Wrocławiu Streszczenie. Celem pracy było zbadanie wpływu stężenia glukozy, jako jedynego źródła węgla, na tworzenie produktu w procesie syntezy kwasu szczawiowego przez Aspergillus niger we wgłębnej hodowli okresowej. Badania prowadzono w podłożach syntetycznych zawierających glukozę rozcieńczoną do poziomu 100, 125, 150 i 175 g dm -3. Najwyższe stężenie produktu, wynoszące 64,2 g dm -3, uzyskano w podłożu zawierającym glukozę w ilości 150 g dm -3. W wariancie tym stwierdzono także obecność kwasów towarzyszących: cytrynowego w stężeniu 15,4 g dm -3 i glukonowego w stężeniu 28,7 g dm -3. Współczynnik homofermentatywności procesu wyniósł 59,2%. Najwyższą szybkość tworzenia -1 produktu i najwyższą wydajność substratową, wynoszące odpowiednio 2,9 g dm-3 d i 61,6%, uzyskano w podłożu ze stężeniem substratu na poziomie 100 g dm -3. Uznano, że optymalne stężenie glukozy w podłożu, ze względu na maksymalizację stężenia produktu, wynosi 150 g dm -3. Słowa kluczowe: kwas szczawiowy, Aspergillus niger, biosynteza, glukoza WSTĘP Kwas szczawiowy jest najprostszym dikarboksylowym kwasem organicznym występującym w każdym produkcie spożywczym pochodzenia roślinnego [Massey 2007]. Jest kwasem mocnym, łatwo kompleksującym metale, tworzącym nietoksyczne produkty rozkładu. Ze względu na właściwości redukujące i chelatujące znajduje zastosowanie w wielu gałęziach przemysłu [Gadd i in. 2014]. W przemyśle spożywczym jest czynnikiem zapobiegającym enzymatycznemu brązowieniu warzyw i owoców [Zheng i Tian 2006, Yoruk, Marshall 2009] oraz opóźniającym starzenie się owoców przechowywanych zarówno chłodniczo [Jin i in. 2014, Li i in. 2014], jak i w temperaturze pokojowej Copyright by Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu Adres do korespondencji Corresponding author: Ewa Walaszczyk, Katedra Bioutylizacji Odpadów Rolno-Spożywczych, Instytut Chemii i Technologii Żywności, Uniwersytet Ekonomiczny we Wrocławiu, ul. Komandorska 118-120, 53-345 Wrocław, e-mail: ewa.walaszczyk@ue.wroc.pl

20 E. Walaszczyk i in. [Zheng i in. 2012, Huang i in. 2012]. W przemyśle włókienniczym kwas szczawiowy stosuje się do farbowania odzieży, usuwania przebarwień, wywabiania plam oraz wybielania m.in. skór, drewna, słomy i piór. W przemyśle metalurgicznym znajduje zastosowanie do usuwania rdzy, polerowania metali i tworzenia powłok anodowych [Sawada i Murakami 2000]. W ostatnich latach duże zainteresowanie wśród badaczy budzi możliwość wykorzystania kwasu szczawiowego pochodzącego z hodowli Aspergillus niger do wybielania kaolinu [Aghaie i in. 2009, Musiał i in. 2011] oraz biologicznego ługowania metali [Behera i in. 2011, Biswas i in. 2013]. Metody te uznawane są za tańsze niż tradycyjnie stosowane, a ponadto przyjazne środowisku. Kwas szczawiowy na skalę przemysłową jest obecnie produkowany tylko metodami chemicznymi. Możliwe jest jednak syntezowanie go na drodze mikrobiologicznej. Jest on wtórnym metabolitem wielu gatunków grzybów, wśród których za najlepszego producenta uznaje się pleśnie z gatunku Aspergillus niger [Podgórski i Leśniak 2003, Foryś i Podgórski 2004, Musiał i in. 2008, 2011]. W poszukiwaniu najlepszego źródła węgla testowano przydatność szeregu substratów węglowodanowych, a w tym m.in.: glukozę [Bomstein i Johnson 1952, Cleland i Johnson 1956, Mandal i Banerjee 2005], cukier biały [Foryś i Podgórski 2004, Podgórski i in. 2004], serwatkę [Cameselle i in. 1998, Santoro i in. 1999], melasę [Podgórski i Leśniak 2003, Podgórski i in. 2004], a także surowce odpadowe z produkcji biodiesla: glicerol [Andre i in. 2010, Musiał i in. 2011, Walaszczyk i in. 2011], porafinacyjne kwasy tłuszczowe [Musiał i in. 2005, 2006, 2008, 2011], olej rzepakowy [Rymowicz i Lenart 2003] czy makuchy: rzepakowy [Gąsiorek i in. 2007] i słonecznikowy [Gąsiorek i in. 2013]. Spośród cukrów najszybciej przyswajanym źródłem węgla jest glukoza, zużywana zazwyczaj w pierwszej kolejności przez Aspergillus niger do wzrostu i syntezy metabolitów [Strasser i in. 1994, Musiał i in. 2005]. Pierwsze badania dotyczące tworzenia kwasu szczawiowego przez A. niger zaprezentowano w latach 50. ubiegłego wieku. Stężenie produktu osiągało wartości największe dla najwyższego stężenia glukozy, wynoszącego 162 g dm -3 [Bomstein i Johnson 1952, Cleland i Johnson 1956]. W latach 90. lepsze wyniki uzyskano, stosując sacharozę i laktozę [Strasser i in. 1994, Cameselle i in. 1998, Santoro i in. 1999]. Natomiast w procesie produkcji kwasu cytrynowego przez A. niger, w którym kwas szczawiowy jest produktem ubocznym, sacharozę uznano za korzystniejszy substrat niż glukozę ze względu na represję kataboliczną glukozy w obecności cytrynianu. Stwierdzono ponadto, że najkorzystniejsze stężenie substratów węglowodanowych do produkcji kwasu cytrynowego mieści się w granicach 13 18%, dochodząc nawet do 22% [Podgórski 2002, Papagianni 2007]. W opisywanych w literaturze badaniach nad biosyntezą kwasu szczawiowego stężenie glukozy lub sacharozy w podłożu wynosi zazwyczaj 100 lub 150 g dm -3 [np. Strasser i in. 1994, Cameselle i in. 1998, Foryś i Podgórski 2004, Mandal i Banerjee 2005, Musiał i in. 2005]. Jedyne opracowania dotyczące wpływu początkowego stężenia glukozy w podłożu na syntezę tego metabolitu były prowadzone w połowie XX w. [Bomstein i Johnson 1952, Cleland i Johnson 1956]. Od tamtej pory znacznie poszerzono wiedzę w zakresie identyfikacji szlaków metabolicznych prowadzących do nadprodukcji kwasu szczawiowego przez A. niger [Kubicek i in. 1988, Ruijter i in. 1999, Pedersen i in. 2000]. Pozyskano także nowe, bardziej wydajne szczepy tej pleśni [Foryś i Podgórski 2004, Walaszczyk i in. 2011, Gąsiorek i in. 2013]. Acta Sci. Pol.

Wpływ stężenia glukozy... 21 Celem badań, których wyniki przedstawiono w niniejszej pracy, było określenie wpływu początkowego stężenia glukozy w podłożu, jako źródła węgla i energii, na ilość kwasu szczawiowego syntezowanego przez szczep Aspergillus niger W78C we wgłębnej hodowli okresowej. MATERIAŁ I METODY Drobnoustroje. W badaniach stosowano szczep Aspergillus niger W78C pochodzący z kolekcji Instytutu Chemii i Technologii Żywności Uniwersytetu Ekonomicznego we Wrocławiu. Szczep przechowywano na słupkach ziemniaczanych w temperaturze 4 C i pasażowano co 6 miesięcy. Podłoże i warunki hodowli. Hodowle prowadzono na podłożach syntetycznych, w których glukozę rozcieńczano wodą destylowaną do stężeń: 100, 125, 150 i 175 g dm -3. Na podstawie przeprowadzonych wcześniej badań i po ustaleniu optymalnego składu podłoża [dane niepublikowane], uzupełniano je źródłami makro- i mikroelementów w ilości: NH 4 NO 3 1,89 g dm -3, KH 2 PO 4 0,32 g dm -3, MgSO 4 7H 2 O 0,64 g dm -3, ZnSO 4 7H 2 O 0,97 mg dm -3, CuSO 4 5H 2 O 0,86 mg dm -3, FeSO 4 7H 2 O 1,64 mg dm -3 i MnSO 4 H 2 O 1,02 mg dm -3. Procesy prowadzono w temperaturze 30 C w kolbach o pojemności 750 cm 3 wypełnionych 125 cm 3 podłoża, umieszczonych na wstrząsarce posuwisto-zwrotnej. Moment zakończenia procesu ustalano na podstawie braku przyrostu wartości kwasowości ogólnej mierzonej poprzez miareczkowanie 2 cm 3 płynu hodowlanego, za pomocą 0,1 M KOH. Hodowle ze stężeniem glukozy na poziomie 100 g dm -3 trwały 22 dni, z substratem w stężeniu 125 g dm -3 28, a pozostałe 30 dni. Odczyn podłoży ustalono i regulowano na poziomie 6 za pomocą 8 N KOH od 6 dnia procesu. Metody analityczne. Próby do analizy stężenia kwasów organicznych pobierano w 12. i 18. dobie oraz po zakończeniu procesu w ilości 2 cm 3. Po odwirowaniu i przefiltrowaniu płyn rozcieńczano wodą chemicznie czystą. Objętość próby analitycznej wynosiła 20 μl. Kwasy organiczne oznaczano ilościowo i jakościowo metodą wysoko sprawnej chromatografii cieczowej HPLC (Perkin Elmer) przy użyciu kolumny Aminex HPX-87H (Bio-Rad), specjalizowanej do oznaczania kwasów organicznych, oraz detektora UV/ VIS o długości fali 210 nm (Perkin Elmer). Fazą mobilną był 5 mm H 2 SO 4. Szybkość przepływu wynosiła 0,6 cm 3 min -1. Oznaczenia wykonywano w temperaturze pokojowej. Składniki identyfikowano jakościowo na podstawie czasów retencji, a ich stężenie obliczano z równania krzywych wzorcowych na podstawie powierzchni odpowiedzi detektora. Suchą masę grzybni oznaczano po zakończeniu procesu przez odfiltrowanie biomasy i jej suszenie w temp. 105 C do stałej masy. Obliczenia. Produktywność procesu (Q P ) obliczano ze wzoru: P QP = gdzie: t Q P szybkość tworzenia produktu (kwasu szczawiowego) [g dm -3 d-1 ], P stężenie kwasu szczawiowego [g dm -3 ], t czas [d]. Biotechnologia 13 (4) 2014

22 E. Walaszczyk i in. Wydajność substratową (Y P/S ) obliczano ze wzoru: P YP/S = 100 gdzie: S Y P/S wydajność substratowa [%], P stężenie kwasu szczawiowego [g dm -3 ], S stężenie substratu przed procesem [g dm -3 ]. Współczynnik homofermentatywności procesu obliczano ze wzoru: P HF = 100 P+ CA+ GA gdzie: HF współczynnik homofermentatywności biosyntezy kwasu szczawiowego [%], P stężenie kwasu szczawiowego [g dm -3 ], CA stężenie kwasu cytrynowego [g dm -3 ], GA stężenie kwasu glukonowego [g dm -3 ]. Wszystkie wyniki przedstawione w niniejszej pracy są wartościami średnimi otrzymanymi z co najmniej dwóch niezależnych eksperymentów, różniących się o nie więcej niż 10%. Jeśli różnice były większe, eksperymenty powtarzano. W obliczaniu parametrów procesu uwzględniono odparowanie, wahające się w zakresie 11 15%. OMÓWIENIE WYNIKÓW W przeprowadzonych hodowlach pleśnie A. niger wydzielały do podłoża trzy kwasy organiczne: szczawiowy, cytrynowy i glukonowy (rys. 1). Najwyższe stężenie produktu, wynoszące 64,2 g dm -3, uzyskano w podłożu zawierającym glukozę w ilości 150 g dm -3, nieco niższe: 62,3 i 61,6 g dm -3 w wariantach z substratem w stężeniach odpowiednio 125 i 100 g dm -3, a najniższe, wynoszące 56,5 g dm -3, w podłożu z najwyższym stężeniem glukozy, czyli 175 g dm -3. We wszystkich wariantach stwierdzono obecność kwasu cytrynowego w ilości od 10,1 do 17,2 g dm -3, natomiast kwas glukonowy w ilości 10,3 33,9 g dm -3 był obecny w podłożach, w których stężenie glukozy zmieniało się z zakresie od 125 do 175 g dm -3. Należy zauważyć, że stężenie kwasu glukonowego w płynie pohodowlanym rosło wraz ze wzrostem stężenia substratu. Kształtowanie się stężenia suchej substancji grzybni, produktywności, wydajności substratowej i współczynnika homofermentatywności procesu w zależności od stężenia glukozy przedstawiono na rysunku 2. Stężenie suchej substancji grzybni w podłożach z glukozą w ilościach 100 i 125 g dm -3 było zbliżone i wynosiło odpowiednio 10,4 i 10,2 g dm -3 ; w dwóch pozostałych wariantach było nieco niższe, równe 9,2 i 8,8 g dm -3, odpowiednio w podłożach z substratem w stężeniach 150 i 175 g dm -3. Produktywność syntezy kwasu szczawiowego i wydajność substratowa były najwyższe w podłożu z glukozą w stężeniu 100 g dm -3 i wyniosły odpowiednio 2,9 g dm -3 d -1 oraz 61,6%. W pozostałych wariantach ich wartości kształtowały się w zakresach: produktywność 1,9 2,2 g dm -3 d -1, wydajność substratowa 32,3 49,8%. Współczynnik homofermentatywności procesu przyjmował wartości najwyższe, równe 90,8% dla najniższego zastosowanego w badaniach stężenia glukozy, a najniższe, wynoszące 53,6% dla stężenia najwyższego. Acta Sci. Pol.

Wpływ stężenia glukozy... 23 Wartości stężeń poszczególnych kwasów organicznych w czasie trwania hodowli w wariancie z najwyższym końcowym stężeniem kwasu szczawiowego przedstawiono na rysunku 3. W 12. dobie procesu stężenie kwasu glukonowego (28,1 g dm -3 ) było wyższe niż stężenie pozostałych kwasów, co było skutkiem dominacji procesu biotransformacji glukozy do kwasu glukonowego przez A. niger w warunkach nielimitowanego stężenia tlenu rozpuszczonego [Cameselle i in. 1998, Podgórski 2005]. Tworzenie się tego kwasu jest wskazywane w literaturze jako główny problem związany ze stosowaniem glukozy lub sacharozy jako substratów w procesach biotechnologicznych z udziałem grzybów strzępkowych [Musiał i in. 2008]. Stężenie kwasu glukonowego rosło w czasie trwania procesu, osiągając wartość 35,8 g dm -3 w 18. dobie, a w końcowej fazie, tj. w 30. dobie uległo obniżeniu do 28,7 g dm -3. Zjawisko to jest prawdopodobnie skutkiem wtórnej asymilacji źródła węgla i energii przez drobnoustroje w warunkach wyczerpywania się podstawowego substratu, jakim była glukoza [Cameselle i in. 1998]. Stężenie kwasu cytrynowego zwiększało się w czasie trwania procesu, osiągając wartość maksymalną na poziomie 15,4 g dm -3. Stosunkowa słaba dynamika tworzenia tego metabolitu wynikała z wysokich wartości regulacyjnych ph podłoża [Strasser i in. 1994, Cameselle i in. 1998]. Analizując szybkość tworzenia kwasu szczawiowego, stwierdzono, że do około 12. doby była ona niższa niż szybkość tworzenia kwasu glukonowego. Jednakże w dalszej fazie hodowli odnotowano przyspieszenie jego syntezy, pozwalające na uzyskanie 50,1 g dm -3 w 18. dobie hodowli oraz 64,2 g dm -3 w dobie 30. Badania nad biosyntezą kwasu szczawiowego z wykorzystaniem glukozy i sacharozy były prowadzone także przez innych autorów, jednak otrzymywali oni zdecydowanie niższe końcowe stężenia produktu, zarówno w hodowlach wstrząsanych, jak i bioreaktorowych. W procesach syntezy kwasu szczawiowego z użyciem glukozy, prowadzonych na wstrząsarce przez Bomsteina i Johnsona [1952] oraz Clelanda i Johnsona [1956], stosowano stężenia substratu w zakresie 38 162 g dm -3. Z przedstawionych danych wynika, że najwyższe stężenia produktu, wynoszące 22,5 g dm -3, uzyskano w podłożu zawierającym najwyższą ilość glukozy. Strasser i in. [1994] uzyskali 35,9 g dm -3 kwasu szczawiowego w hodowli wstrząsanej oraz 38,4 g dm -3 w hodowli bioreaktorowej w podłożu z sacharozą w ilości 100 g dm -3, Cameselle i in. [1998] z sacharozy w stężeniu 150 g dm -3 otrzymali odpowiednio 29,0 i 33,8 g dm -3 produktu, natomiast Musiał i in. [2005] uzyskali 46,0 g dm -3 kwasu szczawiowego w hodowli bioreaktorowej w wariantach zarówno z glukozą, jak i sacharozą w ilości 150 g dm -3. Otrzymane przez tych badaczy ilości produktu były w każdym przypadku niższe niż ilości syntezowanego równolegle niepożądanego kwasu glukonowego. Prowadzono także badania nad produkcją kwasu szczawiowego z glukozy z udziałem unieruchomionych komórek Aspergillus niger, jednakże procesy te charakteryzowały się stosunkowo słabą efektywnością, pozwalającą na uzyskanie stężenia produktu na poziomie 20,6 g dm -3 ze 105,5 g dm -3 glukozy [Mandal i Banerjee 2005]. W opisywanych w niniejszej pracy badaniach, prowadzonych metodą hodowli wstrząsanej, otrzymano w podłożach z glukozą w ilości 150 g dm -3 maksymalne stężenie kwasu szczawiowego na poziomie 64,2 g dm -3. Podobne stężenie produktu (65,7 g dm -3 ) uzyskane zostało przez tych samych autorów w podłożu z sacharozą z tym samym stężeniem początkowym substratu [Foryś i Podgórski 2004]. Równie wysokie stężenia kwasu szczawiowego w zakresie 64,4 68,1 g dm -3 otrzymali także inni badacze, jednakże ich eksperymenty były realizowane na podłożach naturalnych zawierających porafinacyjne kwasy tłuszczowe w stężeniu 50 g dm -3 lub surowy olej rzepakowy w ilości 60 g dm -3 [Rymowicz i Lenart 2003, Musiał i in. 2005]. Biotechnologia 13 (4) 2014

24 E. Walaszczyk i in. 70 Stężenie kwasów organicznych [g dm -3 ] Organic acids concentration 60 50 40 30 20 10 0 100 125 150 175 Stężenie glukozy [g dm -3 ] Glucose concentration kwas szczawiowy oxalid acid kwas cytrynowy citric acid kwas glukonowy glucinic acid Rys. 1. Profil tworzonych kwasów organicznych w zależności od stężenia glukozy w podłożu Fig. 1. Organic acids synthesis in different glucose concentrations in fermentation medium 12 120 Produktywność [g dm -3 d -1 ] Productivity Q p Stężenie suchej masy [g dm -3 ] Dry mass concentration 10 8 6 4 2 0 100 125 150 175 Stężenie glukozy [g dm -3 ] Glucose concentration 100 80 60 40 20 0 Homofermantatywność [%] Chemical selectivity HF Wydajność substratowa [%] Substrate yield Y P/S X Q p Y P/S HF Rys. 2. Kształtowanie się parametrów procesu w zależności od stężenia glukozy w podłożu Fig. 2. Process parameters values in different glucose concentrations in fermentation medium Acta Sci. Pol.

Wpływ stężenia glukozy... 25 70 Stężenie kwasów organicznych [g dm -3 ] Organic acids concentration 60 50 40 30 20 10 0 0 5 10 15 20 25 30 35 Czas [doba] Time [day] kwas szczawiowy oxalid acid kwas cytrynowy citric acid kwas glukonowy gluconic acid Rys. 3. Stężenie kwasów organicznych w trakcie hodowli w podłożu ze 150 g dm -3 glukozy Fig. 3. Organic acids concentration in time in medium with 150 g dm -3 of glucose WNIOSKI Glukoza jest dobrym źródłem węgla do procesu syntezy kwasu szczawiowego przez A. niger. W wyniku eksperymentów przeprowadzonych z użyciem tego substratu w ilościach od 100 do 175 g dm -3 uzyskano wysokie końcowe stężenia produktu, w zakresie od 56,5 do 64,2 g dm -3. Najwyższe stężenie kwasu szczawiowego otrzymano w podłożu z glukozą w ilości 150 g dm -3. To początkowe stężenie substratu zostało uznane za najkorzystniejsze ze względu na maksymalizację ilości tworzonego produktu w procesie biosyntezy kwasu szczawiowego przez A. niger we wstrząsanej hodowli okresowej. PIŚMIENNICTWO Aghaie E., Pazouki M., Hosseini M.R., Ranjbar M., Ghavipanejeh F., 2009. Response surface methodology (RSM) analysis of organic acid production for Kaolin beneficiation by Aspergillus niger. Chemical Engineering Journal, 147, 245 251. Andre A., Diamantopoulou P., Philippoussis A., Sarris D., Komaitis M., Papanikolaou A., 2010. Biotechnological conversions of bio-diesel derived waste glycerol into added-value compounds by higher fungi: production of biomass, single cell oil and oxalic acid. Industrial Crops and Products, 31, 407 416. Biotechnologia 13 (4) 2014

26 E. Walaszczyk i in. Behera S.K., Panda P.P., Singh S., Pradhan N., Sukla L.B., Mishra B.K., 2011. Study on reaction mechanism of bioleaching of nickel and cobalt from lateritic chromite overburdens. International Biodeterioration and Biodegradation, 65, 1035 1042. Biswas S., Dey R., Mukherejee S., Banerjee P.C., 2013. Bioleaching of nickel and cobalt from lateritic chromite overburden using the culture filtrate of Aspergillus niger. Applied Biochemistry and Biotechnology, 170, 1547 1559. Bomstein R.A., Johnson M.J., 1952. The mechanism of formation of citrate and oxalate by Aspergillus niger. The Journal of Biological Chemistry, 198, 1, 143 153. Cameselle C., Bohlmann J.T., Nunez M.J., Lema J.M., 1998. Oxalic acid production by Aspergillus niger. Part I: Influence of sucrose and milk whey as carbon source. Bioprocess Engineering, 19, 247 252. Cleland W.W., Johnson M.J., 1956. Studies on the formation of oxalic acid by Aspergillus niger. The Journal of Biological Chemistry, 220, 2, 595 606. Foryś E., Podgórski, W. 2004. Application of replicated 2 3 full factorial central composite circumscribed design of experiment (CCC DOE) for optimization for oxalate biosynthesis by Aspergillus niger W78C. Acta Scientiarum Polonorum. Biotechnologia, 3 (1 2) 2004, 43 53. Gadd M.G., Bahri-Esfahani J., Li Q., Rhee Y.J., Wei Z., Fomina M., Liang X., 2014. Oxalate production by fungi: significance in geomycology, biodeterioration and bioremediation. Fungal Biology Reviews, 28, 36 55. Gąsiorek E., Fronia J., Firuta P., Podgórski W. 2007. Makuch rzepakowy jako substrat do biosyntezy kwasu szczawiowego metodą solid state. Acta Scientiarum Polonorum. Biotechnologia, 6 (3), 27 32. Gąsiorek E., Walaszczyk E., Podgórski W., 2013. Makuch słonecznikowy jako substrat w równoczesnej syntezie kwasu szczawiowego i enzymów celulolitycznych przez pleśnie Aspergillus niger. Nauki Inżynierskie i Technologie, 4 (11), 39 49. Huang H., Jing G., Guo L., Zhang D., Yang B., Duan X., Ashraf M., Jiang Y., 2013. Effect of oxalic acid on ripening attributes of banana fruit during storage. Postharvest Biology and Technology, 84, 22 27. Jin P., Zhu H., Wang L., Shan T., Zheng Y., 2014. Oxalic acid alleviates chilling injury in peach fruit by regulating energy metabolism and fatty acid contents. Food Chemistry, 161, 87 93. Kubicek C.P., Schreferl-Kunar G., Wohrer W., Rohr M. 1988. Evidence for a cytoplasmic pathway of oxalate biosynthesis in Aspergillus niger. Applied and Environmental Microbiology, 54, 3, 633 637. Li P., Zheng X., Liu Y., Zhu Y., 2014. Pre-storage application of oxalic acid alleviates chilling injury in mango fruit by modulating proline metabolism and energy status under chilling stress. Food Chemistry, 142, 72 78. Mandal S.K., Banerjee P.C., 2005. Submerged production of oxalic acid from glucose by immobilized Aspergillus niger. Process Biochemistry, 40, 1605 1610. Massey L.K. 2007. Food oxalate: Factors affecting measurement, biological variation, and bioavailability. Journal of Dietetic Association, 107, 1191 1194. Musiał I., Cibis E., Rymowicz W., 2011. Designing a process of kaolin bleaching in an oxalic acid enriched medium by Aspergillus niger cultivated on biodiesel-derived waste composed of glycerol and fatty acids. Applied Clay Science, 52, 277 284. Musiał I., Rymowicz W., Lenart D., Witkowska D., 2005. Wykorzystanie porafinacyjnych kwasów tłuszczowych do biosyntezy kwasu szczawiowego przez Aspergillus niger w warunkach obniżonego ph. Biotechnologia, 2 (2), 37 45. Musiał I., Rymowicz W., Witkowska D., 2006. Effect of Span 20 concentration on oxalic acid production from post-refinery fatty acids by Aspergillus niger XP. Chemical Papers, 60 (5), 388 390. Acta Sci. Pol.

Wpływ stężenia glukozy... 27 Musiał I., Rymowicz W., Witkowska D., 2008. Biosynteza kwasu szczawiowego z porafinacyjnych kwasów tłuszczowych przez Aspergillus niger w hodowlach półciągłych. Acta Scientiarum Polonorum. Biotechnologia, 7 (2), 3 11. Papagianni M., 2007. Advances in citric acid fermentation by Aspergillus niger: biochemical aspects, membrane transport and modeling. Biotechnology Advances, 25, 244 263. Pedersen H., Christiansen B., Hjort C., Nielsen J. 2000. Construction and characterization of an oxalic acid nonproducing strain of Aspergillus nger. Metabolic Engineering, 2, 34 41. Podgórski W., 2002. Kształtowanie aktywności oddechowej i kwasotwórczej Aspergillus niger podczas produkcji kwasu cytrynowego w podłożach z melasą trzcinową. Praca habilitacyjna. Prace Naukowe nr 914 Akademii Ekonomicznej we Wrocławiu. Monografie i Opracowania nr 144, Wrocław. Podgórski W., 2005. Kinetyczny model wzrostu Aspergillus niger W78B w okresowym procesie biotransformacji glukozy do kwasu glukonowego. Inżynieria i Aparatura Chemiczna, 44 (36), 79 80. Podgórski W., Gąsiorek E., Leśniak W., Gadomski K., 2004. Bioutilization and biotransformation of wastes and by-products from food industry into organic acids. Acta Scientiarum Polonorum. Biotechnologia, 3 (1 2), 55 66. Podgórski W., Leśniak W. 2003. Biochemical method of oxalic acid production from beet molasses. Chemical Papers, 57, 6, 408 412. Ruijter G.J.G., van de Vondervoort P.J.I., Visser J., 1999. Oxalic acid production by Aspergillus niger: an oxalate-non-producing mutant produces citric acid at ph 5 and in the presence of manganese. Microbiology, 145, 2569 2576. Rymowicz W., Lenart D., 2003. Oxalic acid production from lipids by a mutant of Aspergillus niger at different ph. Biotechnology Letters, 25, 955 958. Santoro R., Cameselle C., Rodriguez-Couto S., Sanroman A., 1999. Influence of milk whey, nitrogen and phosphorus concentration on oxalic acid production by Aspergillus niger. Bioprocess Engineering, 20, 1 5. Sawada H., Murakami T. 2000. Oxalic acid [in:] Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology. Wiley-Interscience, New York (USA), 1 19. Strasser H., Burgstaller W., Schinner F., 1994. High-yield production of oxalic acid for metal leaching processes by Aspergillus niger. FEMS Microbiology Letters, 119, 365 370. Walaszczyk E., Podgórski W., Marzec D., 2011. Wpływ makroelementów na proces biosyntezy kwasu szczawiowego z glicerolu przez Aspergillus niger. Żywność. Nauka. Technologia. Jakość, 1 (74), 165 172. Yoruk R., Marshall M.R., 2009. Importance of ph and antibrowning activity of oxalic acid. Journal of Food Biochemistry, 33, 522 534. Zheng X., Tian S., 2006. Effect of oxalic acid on control of postharvest browning of litchi fruit. Food Chemistry, 96, 519 523. Zheng X., Jing G., Liu Y., Jiang T., Jiang Y., Li J., 2012. Expression of expansion gene, MiExpA1, and activity of galactoxidase and polygalacturonase in mango fruit as affected by oxalic acid during storage at room temperature. Food Chemistry, 132, 849 854. Biotechnologia 13 (4) 2014

28 E. Walaszczyk i in. INFLUENCE OF GLUCOSE CONCENTRATION ON OXALIC ACID SYNTHESIS BY ASPERGILLUS NIGER Abstract. The aim of the work was to examine the influence of glucose concentration as a sole carbon source on oxalic acid synthesis by Aspergillus niger in submerged fermentation. Cultivations were conducted in synthetic medium containing glucose diluted to 100, 125, 150 and 175 g dm -3. The highest product concentration 64,2 g dm -3 was obtained in medium containing 150 g dm -3 of glucose. There were also 15,4 g dm -3 of citric acid and 28,7 g dm -3 of gluconic acid present. Chemical selectivity of the process was 59,2%. The highest productivity and the highest substrate yield equalled respectively 2,9 g dm -3 d -1 and 61,6% was obtained in medium containing 100 g dm -3 of substrate. In conclusion, optimal glucose concentration in medium was recognised as 150 g dm -3 because of the highest product concentration. Key words: oxalic acid, Aspergillus niger, biosynthesis, glucose Zaakceptowano do druku Accepted for print: 31.12.2014 Do cytowania For citation: Walaszczyk E., Dawidowicz K., Gąsiorek E., Podgórski W., 2014. Wpływ stężenia glukozy na syntezę kwasu szczawiowego przez Aspergillus niger. Acta Sci. Pol. Biotechnol., 13 (3), 19 28. Acta Sci. Pol.