Porównanie wybranych odczynów serologicznych stosowanych w diagnostyce inwazyjnej kandydozy

Prace oryginalne / Original papers Mikologia Lekarska 007, 14 (3): 179-183 Copyright 007 Cornetis www.cornetis.com.pl ISSN 13-986X Porównanie wybranych odczynów serologicznych stosowanych w diagnostyce inwazyjnej kandydozy Zak³ad Mykologii Katedry Mikrobiologii CMUJ w Krakowie Streszczenie Abstract Wprowadzenie: Badania mikoserologiczne s¹ cennym uzupe³nieniem diagnostyki grzybic uk³adowych. Cel pracy: Porównanie trzech metod serologicznych stosowanych w rutynowej diagnostyce inwazyjnej kandydozy odczynu hemaglutynacji poœredniej, odczynu immunoprecypitacji w elu i odczynu lateksowego oraz próba oceny przydatnoœci tych i innych metod serologicznych w diagnostyce grzybic g³êbokich wywo³ywanych przez grzyby z rodzaju Candida. Materia³ i metody: Na materiale 1086 surowic od pacjentów z podejrzeniem grzybicy narz¹dowej lub uogólnionej wykonano testy: hemaglutynacji poœredniej (IHA), odczyn immunoprecypitacji w elu (OP ) oraz odczyn lateksowy (OL). Wyniki: Uzyskano dodatni odczyn IHA w 43,9% badanych surowic, odczyn OP w 7,46% i odczyn OL w 6,91%. Porównano wyniki w³asne z danymi w piœmiennictwie œwiatowym. Omówiono równie metody diagnostyczne dotychczas nie stosowane w Polsce. Wnioski: 1) W badaniu stwierdzono du ¹ rozbie noœæ wyników uzyskiwanych w odczynie hemaglutynacji poœredniej (IHA) i odczynie immunoprecypitacji w elu (OP ), ) Zaobserwowano wy sz¹ czu³oœæ IHA w porównaniu z OP, 3) Surowicom dodatnim w odczynie Pastorex Candida towarzyszy³y niskie miana przeciwcia³ anty-candida w odczynie IHA. S³owa kluczowe: Candida, kandydoza, antygen, przeciwcia³o, mikoserologia Introduction: Mycoserological tests are valuable contribution to systemic mycoses diagnostics. Objective: A comparison of three serological methods used in routine diagnostics of invasive candidiasis: indirect haemagglutination test, gel immunoprecipitation test, and latex agglutination test, and assessment of the usefulness of those and other methods in the diagnostics of deep candidiasis. Materials and methods: Three tests were performed with 1086 serum samples collected from patients suspected of systemic or generalized mycosis: indirect haemagglutination test, gel immunoprecipitation test and latex test. Results: The haemagglutination test was positive in 43.9% of the serum samples, immunoprecipitation test in 7.46% of them, and latex agglutination test in 6.91%. The findings were compared with those reported in international literature. Moreover, diagnostic procedures, not in use in Poland yet, are discussed. Conclusions: 1) In the study we observed a big divergence of the indirect haemagglutination test results and gel immunoprecipitation test results, ) The results indicate that indirect haemagglutination test is more sensitive than gel immunoprecipitation test, 3) The antigen-positive patients in Pastorex Candida had lower Candida antibody titres in the indirect haemagglutination test. Key words: Candida, candidiasis, antigen, antibody, mycoserology Wprowadzenie Brak charakterystycznych objawów infekcji grzybiczych sprawia, e ich rozpoznanie na podstawie wywiadu i objawów klinicznych jest bardzo trudne. Wczesna i precyzyjna diagnostyka mikologiczna ma istotne znaczenie, poniewa umo liwia szybkie wdro enie w³aœciwego leczenia, a tym samym zmniejszenie liczby powik³añ i œmiertelnoœci w nastêpstwie infekcji grzybiczych (1, ). Liczne problemy zwi¹zane z diagnostyk¹ kliniczn¹ i mikrobiologiczn¹ inwazyjnej kandydozy oraz wzrastaj¹ca czêstoœæ tych infekcji, przyczyni³y siê do rozwoju testów serologicznych opartych na wykrywaniu antygenów Candida oraz przeciwcia³ skierowanych przeciwko tym antygenom (1, 3). Mimo i, procedura wykonania testów serologicznych z regu³y nie jest skompli- Adres do korespondencji: Prof. dr hab. n. med. Anna B. Macura Zak³ad Mykologii Katedry Mikrobiologii CMUJ ul. Czysta 18, 31-11 Kraków tel.: +48 1 633 08 77 wew. 47, e-mail: mbmacura@cyf-kr.edu.pl kowana, to interpretacja wyników w przypadku grzybicy narz¹dowej sprawia czêsto wiele trudnoœci zwi¹zanych zarówno z charakterystyk¹ populacji chorych (pacjenci z obni on¹ odpornoœci¹, których uk³ad odpornoœciowy czêsto nie jest w stanie wytworzyæ wykrywalnej odpowiedzi immunologicznej), jak równie z cechami drobnoustrojów wywo³uj¹cych te infekcje (pokrewieñstwo antygenowe miêdzy ró nymi gatunkami grzybów oraz grzybami i bakteriami) (, 3). Dodatkow¹ trudnoœci¹ w przypadku infekcji wywo³anych przez grzyby z rodzaju Candida jest koniecznoœæ odró nienia zwyk³ej kolonizacji b³on œluzowych (zw³aszcza w przypadku Candida albicans) od inwazji tkanek i kandydemii wymagaj¹cych leczenia przeciwgrzybiczego (1-3). W ci¹gu ostatnich lat dokonano znacznego postêpu zwi¹zanego z popraw¹ czu³oœci i swoistoœci testów serologicznych wykonywanych w przypadku podejrzenia inwazyjnej kandydozy. By³o to mo liwe zarówno dziêki dok³adniejszemu poznaniu budowy wielu istotnych klinicznie antygenów Candida (m.in. mannan, glukan, enolaza, arabinitol), jak równie usprawnieniu techniki wykonywanych badañ. Wykrycie antygenów kr¹ ¹cych Candida i okreœlenie ich miana, w korelacji z objawa- 179

180 mi klinicznymi, mo e równie s³u yæ do monitorowania skutecznoœci terapii przeciwgrzybiczej (1-3). Nadal jednak rozpoznanie inwazyjnej kandydozy na podstawie wyniku pojedynczego badania nie jest mo liwe. Testy serologiczne powinny byæ traktowane jako badania pomocnicze, a ostateczna diagnoza inwazyjnej kandydozy powinna opieraæ siê na analizie wielu informacji z wywiadu chorobowego, objawów klinicznych oraz badañ pomocniczych (3). Cel pracy Celem pracy by³o porównanie trzech metod serologicznych stosowanych w Zak³adzie Mykologii Katedry Mikrobiologii CMUJ w rutynowej diagnostyce inwazyjnej kandydozy odczynu hemaglutynacji poœredniej, odczynu immunoprecypitacji w elu i odczynu lateksowego. Pracê zilustrowano zestawieniem wyników badañ mikoserologicznych prowadzonych tymi metodami w Zak³adzie Mykologii Katedry Mikrobiologii CMUJ w Krakowie w latach 00-006. Dodatkowo, powo³uj¹c siê na dane literaturowe, podjêto próbê oceny przydatnoœci tych i innych metod serologicznych w diagnostyce grzybic g³êbokich wywo³ywanych przez grzyby z rodzaju Candida. Materia³ i metody W Zak³adzie Mykologii Katedry Mikrobiologii CMUJ w latach 00-006 przebadano 1086 surowic pochodz¹cych od pacjentów szpitalnych, g³ównie z Kliniki Hematologii, Kliniki Pulmonologii, Kliniki Chorób ZakaŸnych oraz z Uniwersyteckiego Szpitala Dzieciêcego, u których podejrzewano grzybicê narz¹dow¹ b¹dÿ uogólnion¹. Pacjenci ambulatoryjni stanowili niewielki odsetek badanych. W surowicy pacjentów oznaczono swoiste przeciwcia³a anty-candida oraz kr¹ ¹cy antygen grzyba stosuj¹c trzy powszechnie znane odczyny serologiczne: odczyn hemaglutynacji poœredniej Hemkit Candida IHA (ravo Diagnostika GmbH, Niemcy), odczyn immunoprecypitacji w elu metod¹ podwójnej dyfuzji oraz odczyn lateksowy Pastorex Candida (Bio-Rad, Francja). Odczyn hemaglutynacji poœredniej (IHA) oraz odczyn immunoprecypitacji w elu (OP ) pos³u y³y do wykrywania swoistych przeciwcia³ anty-candida w surowicy pacjentów. W teœcie IHA krwinki czerwone barana (SRBC) uczulone sk³adnikami œciany komórkowej grzyba C. albicans o serotypie A aglutynuj¹ w obecnoœci swoistych przeciwcia³ anty-candida znajduj¹cych siê w badanych surowicach. Uczulone SRBC reaguj¹ z trzema klasami przeciwcia³ IgM, IgG i IgA oraz w niektórych przypadkach tak e z kompleksami antygen przeciwcia³o. Reakcjê pozytywn¹ uzyskuje siê nie tylko dla gatunku C. albicans, ale równie dla innych gatunków z rodzaju Candida, takich jak: C. tropicalis, C. parapsilosis i C. glabrata. Wymienione gatunki grzybów z rodzaju Candida wykazuj¹ podobieñstwo antygenowe w stosunku do gatunku C. albicans. Miano przeciwcia³ w badanej próbce wyznacza siê w stosunku do kontroli negatywnej zawieraj¹cej nieuczulone SRBC. Za wartoœæ znamienn¹ diagnostycznie przyjmuje siê miano >1:160. Drugim testem, zastosowanym do wykrywania przeciwcia³ anty-candida, by³ odczyn immunoprecypitacji w elu (OP ). Odczyn ten wykonuje siê na szkie³kach podstawowych pokrytych 3 ml % agaru Noble z dodatkiem mertiolatu. W elu za pomoc¹ szablonu wycina siê otwory o sta³ej œrednicy 6 mm, pozostaj¹ce ze sob¹ w okreœlonej odleg³oœci. Do otworów podaje siê równe objêtoœci antygenu wzorcowego C. albicans (antygen metaboliczny firmy Bio-Rad, Francja) oraz badanej surowicy. Szkie³ka umieszcza siê w komorze wilgotnej, w cieplarce w 37ºC na dwie doby. Obecne w surowicy swoiste przeciwcia³a przeciwko antygenowi Candida oraz antygen wzorcowy Mikologia Lekarska 007, 14 (3) dyfunduj¹ w elu w przeciwnych kierunkach, tworz¹c w strefie ekwiwalencji usieciowane kompleksy antygen przeciwcia³o widoczne w elu w postaci linii precypitacyjnych. W celu lepszego uwidocznienia linii el mo na dodatkowo wybarwiæ czerni¹ amidow¹. Pojawienie siê ciemno zabarwionej linii miêdzy otworami dla antygenu i badanej surowicy œwiadczy o dodatnim wyniku badania mikoserologicznego. Testem u ytym do oznaczania kr¹ ¹cego antygenu grzybów z rodzaju Candida by³ odczyn lateksowy Pastorex Candida (OL) wykrywaj¹cy mannan antygen polisacharydowy œciany komórkowej grzyba. Test oparty jest na reakcji aglutynacji cz¹stek lateksu op³aszczonych szczurzym przeciwcia³em monoklonalnym EBCA-1 z fragmentem 1--oligomannozydowym œciany komórkowej grzybów z rodzaju Candida. Powsta³e aglutynaty lateks-(ebca-1)-mannan widoczne s¹ makroskopowo w postaci bia³ych k³aczków. Reakcja dodatnia obserwowana jest dla nastêpuj¹cych gatunków grzybów z rodzaju Candida: C. glabrata, C. guilliermondii, C. albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. pseudotropicalis, a tak e C. dubliniensis, C. lusitaniae, C. famata (3). Wyniki Wyniki testów mikoserologicznych wykrywaj¹cych obecnoœæ swoistych przeciwcia³ anty-candida (odczyn IHA oraz OP ) oraz antygenów polisacharydowych œciany komórkowej grzybów z rodzaju Candida (OL) przeprowadzonych w Zak³adzie Mykologii Katedry Mikrobiologii CMUJ w okresie 00-006 przedstawiaj¹ tabele I, II i III. W celu syntezy wyników uzyskanych z poszczególnych lat dokonano analizy zbiorczej metod¹ metaanalizy. ¹cznie w latach 00-006 wykonano 1086 oznaczeñ mikoserologicznych. W teœcie IHA uzyskano 477 (43,9%) dodatnich wyników, dla których miana przeciwcia³ anty-candida okreœlono na poziomie >1:160. Wœród 477 surowic dodatnich w teœcie IHA 1 surowic (4,1%) wykazywa³o miana równe 1:30, 143 surowice (30,0%) miana 1:640, natomiast 119 surowic (4,9%) miana 1:180 (tab. I i II). Za pomoc¹ odczynu OP przeciwcia³a anty-candida wykryto tylko w 81 surowicach (7,46%). Liczba dodatnich wyników w OP by³a wobec tego prawie szeœciokrotnie ni sza ni liczba dodatnich odczynów IHA. Najwiêcej dodatnich wyników w teœcie OP (40 dodatnich wyników 49,4%) obserwowano przy wysokich mianach surowicy ( 1:640) w teœcie IHA. W mianie 1:30 tylko 13 surowic (16,0%) dawa³o linie precypitacyjne w OP, natomiast w mianie 1:160 by³o ich 8 (34,6%). Sumarycznie za pomoc¹ odczynów OP i IHA przeciwcia³a anty-candida stwierdzono w 8 próbkach surowicy, czyli w ponad po³owie wszystkich wykonanych badañ (1,4%). W przypadku 18 surowic (1,66%) odczyt odczynu OP by³ niejednoznaczny i trudny do interpretacji (linie precypitacyjne praktycznie niewidoczne makroskopowo). Wyniki te zaklasyfikowano jako w¹tpliwe (tab. I i II). Antygen mannanowy wykrywany by³ znacznie rzadziej ni przeciwcia³a anty-candida, poniewa tylko w 7 badanych surowicach (6,91%). Surowic maj¹cych równoczeœnie dodatni odczyn OL oraz OP by³o zaledwie 7 (0,64%), natomiast surowic wykazuj¹cych dodatnie odczyny OL i IHA by³o 31 (,8%). Najwiêcej dodatnich wyników w teœcie lateksowym (44 odczyny dodatnie 8,7%) zaobserwowano dla niskich mian przeciwcia³ ( 1:160) w teœcie IHA. W mianie 1:30 w odczynie IHA mannano-dodatnich surowic by³o 13 (17,3%), a w mianie 1:640 18 surowic (4,0%). W odczynie OL uzyskano 9,3% wyników ujemnych (100 surowice mannano-ujemne) oraz 0,83% wyników w¹tpliwych (9 surowic), dla których obserwowano œladow¹ aglutynacjê (tab. I i II).

Porównanie wybranych odczynów serologicznych stosowanych w diagnostyce inwazyjnej kandydozy Tabela I: Wyniki badañ mikoserologicznych surowicy pacjentów z podejrzeniem inwazyjnej kandydozy wykonanych w Zak³adzie Mykologii Katedry Mikrobiologii CMUJ w latach 00-006 Table I: Results of mycoserological tests in the serum of patients suspected of invasive candidiasis performed at the Dept. of Mycology, Chair of Microbiology CMUJ in the years 00-006 Rok Year Liczba badañ Number of tests Liczba dodatnich odczynów serologicznych Number of positive serological tests Liczba ujemnych/w¹tpliwych* odczynów serologicznych Number of negative/doubtful* serological tests IHA OP OL IHA OP OL 00 149 77 1,7% 7/0 48,3/0,00% 144/0 96,4/0,00% 141/3 94,6/,01% 003 18 88 47,6% 1 11,4% 13,% 97/0,4/0,00% 19/ 8,9/,70% 18/ 8,4/1,08% 004 36 103 43,6% 9,3% 8 3,40% 133/0 6,4/0,00% 08/6 88,1/,4% 6/ 9,8/0,8% 00 6 10 4,3% 19 7,17% 1,89% 14/0 4,7/0,00% 44/ 9,1/0,7% 60/0 98,1/0,00% 006 1 89 3,% 14,8% 3 1,7% 16/0 64,/0,00% 3/ 9,4/1,99% 17/ 86,/0,80% 00-006 1086 477 43,9% 81 7,46% 7 6,91% 609/0 6,1/0,00% 987/18 90,9/1,66% 100/9 9,3/0,83% 8 1,4% IHA odczyn hemaglutynacji poœredniej / indirect haemagglutination test, OP odczyn precypitacji w elu / gel immunoprecipitation test, OL odczyn lateksowy latex agglutination test, * wyniki w¹tpliwe; dotyczy odczynów OP i/lub OL / doubtful OP and/or OL tests results Tabela II: Porównanie liczby dodatnich wyników odczynów OP i OL oraz wyników odczynu IHA uzyskanych w latach 00-006 Table II: Comparison of the number of positive OP, OL tests results and IHA test results obtained in the years 00-006 Rok Year Liczba badañ Number of tests Liczba dodatnich odczynów Number of positive tests results IHA OP OL 1:80 1:160 1:30 1:640 1:180 00 149 31 0,8% 41 7,% 33,1% 3 1,4% 1 14,1% 003 18 61 33,0% 36 19,% 36 19,% 8 1,1% 4 13,0% 1 11,4% 13,% 004 36 79 33,% 4,9%,0% 6 11,0% 10,6% 9,3% 8 3,40% 00 6 81 30,6% 64 4,% 9,3% 3 1,1% 9 10,9% 19 7,17% 1,89% 006 1 7 9,9% 87 34,7% 3 13,9% 34 13,% 0 7,97% 14,8% 3 1,7% 00-006 1086 37 30,1% 8 6,0% 1 19,8% 143 13,% 119 11,0% 81 7,46% 7 6,91% 609 6,1% 477 43,9% IHA odczyn hemaglutynacji poœredniej / indirect haemagglutination test, OP odczyn precypitacji w elu / gel immunoprecipitation test, OL odczyn lateksowy / latex agglutination Tabela III: Zestawienie dodatnich, ujemnych oraz w¹tpliwych wyników oznaczeñ mikoserologicznych uzyskanych w latach 00-006 Table III: Combination of positive, negative and doubtful mycoserological tests results performed in the years 00-006 Odczyny z C. albicans Tests with C. albicans 00 N=149 003 N=18 004 N=36 00 N=6 006 N=1 Surowice wykazuj¹ce przynajmniej 83 10 114 19 114 jeden odczyn dodatni,7% 6,8% 48,3% 48,7% 4,4% Serum with at least one test positive Surowice wykazuj¹ce wszystkie odczyny ujemne Serum with all of the tests negative Surowice wykazuj¹ce odczyn w¹tpliwy* Serum with doubtful test* 64 43,0% 1,34% 78 4,% 1,08% 117 49,6%,1% 13 0,9% 1 0,38% N liczba badañ / number of tests, * wyniki w¹tpliwe; dotyczy odczynów OP i/lub, OL / doubtful OP and/or OL tests results 13 3,8% 0,80% 00-006 N=1086 4 0,% 9 48,7% 1 1,10% Wœród wszystkich przebadanych surowic (1086) 4 czyli nieco wiêcej ni po³owa (0,%) wykazywa³a przynajmniej jeden odczyn dodatni na trzy wykonywane dla ka dej surowicy, natomiast 9 (48,7%) posiada³o wszystkie trzy odczyny ujemne. Tylko w 3 surowicach (0,8%) zaobserwowano wszystkie trzy odczyny dodatnie OP, OL oraz IHA w mianie 1:30 (tab. II). Dyskusja W zwi¹zku z wprowadzeniem do lecznictwa inwazyjnych metod diagnostycznych, leków dzia³aj¹cych immunosupresyjnie, a tak e agresywnych metod leczenia nowotworów (chemioterapii i radioterapii), rola grzybów jako czynników etiolo- 181

18 gicznych zaka eñ znacznie wzros³a w ci¹gu ostatnich 40 lat. Wed³ug analiz przeprowadzonych w Stanach Zjednoczonych inwazyjna kandydoza stanowi g³ówn¹ przyczynê zgonów spowodowanych infekcjami grzybiczymi (1, 4), a grzyby z rodzaju Candida s¹ czwartym co do czêstoœci czynnikiem etiologicznym zaka eñ krwi (). W celu rozpoznania grzybic inwazyjnych wykorzystuje siê nastêpuj¹ce metody diagnostyczne: ocenê obecnoœci grzybów w materiale klinicznym (hodowla, badanie bezpoœrednie), metody serologiczne wykrywaj¹ce obecnoœæ antygenów grzybów, swoistych przeciwcia³ przeciwgrzybiczych oraz kompleksów antygen przeciwcia³o, metody biologii molekularnej (PCR, RFLP), badanie histologiczne wycinków tkanek oraz badania obrazowe (badanie rentgenowskie, tomografia komputerowa) (6, 7). 1. Testy serologiczne wykrywaj¹ce przeciwcia³a Testy serologiczne wykrywaj¹ce przeciwcia³a przeciwko antygenom Candida s¹ istotne szczególnie w zaka eniach o przewlek³ym przebiegu (). Interpretacja wyników tych testów mo e jednak nastrêczaæ wiele trudnoœci w zwi¹zku z koniecznoœci¹ odró nienia bezobjawowej kolonizacji b³on œluzowych od inwazyjnej kandydozy. Dodatkowym ograniczeniem w przypadku badañ serologicznych wykrywaj¹cych przeciwcia³a jest czêstsze wystêpowanie upoœledzenia odpornoœci w przypadku pacjentów z inwazyjn¹ kandydoz¹. Uk³ad immunologiczny tych pacjentów nie jest w stanie wytworzyæ wykrywalnej odpowiedzi immunologicznej (1-3). Wa nym wyj¹tkiem jest tutaj zapalenie wsierdzia wywo³ane przez Candida sp. Poziom przeciwcia³ przeciwko antygenom Candida w tej grupie pacjentów jest bardzo czêsto wysoki i omawiane badania serologiczne maj¹ w ich przypadku wartoœæ diagnostyczn¹ (1). Testy wykrywaj¹ce obecnoœæ przeciwcia³ przeciwko antygenom Candida s¹ wykorzystywane równie w celu oceny prognozy choroby. Obserwacja spadaj¹cego miana przeciwcia³ jest istotnym pozytywnym czynnikiem prognostycznym, natomiast ca³kowity brak przeciwcia³ przeciwko Candida, przy obecnoœci objawów klinicznych inwazyjnej kandydozy, najczêœciej wi¹ e siê z niekorzystnym rokowaniem. Zjawisko to wynika ze znacznego upoœledzenia odpornoœci pacjenta lub ze zu ycia przeciwcia³ (wytr¹canie siê kompleksów immunologicznych) (1). Do metod wykorzystywanych w testach serologicznych wykrywaj¹cych obecnoœæ przeciwcia³ nale ¹: odczyn immunoprecypitacji w elu metod¹ podwójnej dyfuzji (OP ), immunoelektroforeza przeciwstawna (CIE), metody immunoenzymatyczne (EIA) oraz odczyn hemaglutynacji (, 8, 9). W naszych badaniach pos³u yliœmy siê odczynem hemaglutynacji poœredniej (IHA) oraz odczynem immunoprecypitacji w elu metod¹ podwójnej dyfuzji (OP ). Literatura podaje ró ne wartoœci czu³oœci i swoistoœci odczynu IHA. Bisbe i wsp. okreœlili czu- ³oœæ na poziomie 97% i swoistoœæ na poziomie 60% (8). Wysoka czu³oœæ testu IHA pojawi³a siê tak e w badaniach Petriego i wsp. (czu³oœæ 88%), przy czym swoistoœæ by³a bardzo niska (6%) (10). Bär i Hecker uzyskali odmienne wyniki wy sze wartoœci swoistoœci (8,7%) w stosunku do czu³oœci (,9%). Wyznaczona przez nich dodatnia wartoœæ predykcyjna testu wynios³a 60% a ujemna wartoœæ predykcyjna 81,8% (11). Jak podaj¹ Ÿród³a, u ytecznoœæ odczynu podwójnej immunodyfuzji w elu w diagnozowaniu kandydemii jest ograniczona, bowiem test ten cechuje siê nisk¹ czu³oœci¹ i stosunkowo wysok¹ swoistoœci¹ (1, 13). Pallavicini i wsp. okreœlili czu³oœæ tej metody na poziomie 9%, natomiast swoistoœæ okaza³a siê byæ ponad dwukrotnie wy sza 67%. Wyznaczona w tym badaniu dodatnia wartoœæ predykcyjna testu wynosi³a 1%, a ujemna wartoœæ predykcyjna 8% (14). Analizuj¹c powy sze parametry mo na wnioskowaæ, i odczyn podwójnej dyfuzji w elu jest bardziej przydatny do wykluczenia kandydozy ni do jej potwierdzenia. Mikologia Lekarska 007, 14 (3) W przeprowadzonych przez nas badaniach przeciwcia³a anty-candida wykrywane by³y prawie szeœciokrotnie czêœciej w odczynie IHA ni w odczynie OP (odpowiednio 43,9% i 7,46%). Dodatnie wyniki w odczynie OP uzyskiwano g³ównie (49,4%) w przypadku surowic z wysokimi mianami przeciwcia³ w odczynie IHA ( 1:640). Korelacja dodatnich wyników uzyskiwanych w IHA oraz OP by³a niewielka, poniewa tylko 3 surowice na 8 (9,%), w których stwierdzono obecnoœæ przeciwcia³ anty-candida, wykazywa³y równoczeœnie dodatnie odczyny IHA (miano >1:160) i OP. Jednym z najczêœciej wykonywanych badañ jest ocena obecnoœci przeciwcia³ anty-mannan przy u yciu metody immunoenzymatycznej (EIA). Stosunkowo wysok¹ czu³oœæ i swoistoœæ tej metody (odpowiednio 3 i 94%) wykazano w badaniu klinicznym przeprowadzonym na grupie pacjentów z kandydoz¹ potwierdzon¹ hodowl¹ grzybów z materia³ów klinicznych (1). W badaniu przeprowadzonym przez Persat i wsp. wartoœæ diagnostyczna EIA by³a ni sza. Czu³oœæ i swoistoœæ ró nych dostêpnych testów komercyjnych (Platelia, Virotech GmbH, Biomerica ) mieœci³a siê w przedziale 9-90,9% i 18,4-63,1% odpowiednio (16).. Testy serologiczne wykrywaj¹ce antygeny Badania serologiczne wykrywaj¹ce antygeny kr¹ ¹ce grzybów z rodzaju Candida s¹ szczególnie istotne w przypadku pacjentów z obni on¹ odpornoœci¹ oraz chorych, u których infekcja ma przebieg ostry. Testy te maj¹ znaczenie nie tylko diagnostyczne, lecz równie w przypadku okreœlenia miana wykrytego antygenu oraz w korelacji z obrazem klinicznym choroby mog¹ s³u yæ do monitorowania skutecznoœci leczenia. Do metod badawczych wykorzystywanych w mikoserologii do oznaczania kr¹ ¹cych antygenów grzybów nale ¹: aglutynacja lateksowa (LA), metoda immunoenzymatyczna (EIA), immunoblotting, dot immunoassay, liposomal immunoassay oraz metody radioimmunologiczne (radioimmunoassay RIA) (1-3). Wœród antygenów wykrywanych w omawianych testach w przypadku podejrzenia inwazyjnej kandydozy mo na wymieniæ: mannan, mannoproteiny, glukan, bia³ka szoku cieplnego (hsp90), enolazê, kwaœn¹ proteazê oraz inne antygeny cytoplazmatyczne, jak równie antygeny œciany komórkowej (3, 17). Mannan wystêpuje w osoczu g³ównie w postaci kompleksów immunologicznych szybko usuwanych przez w¹trobê i nerki, st¹d stê enie tego antygenu w osoczu jest bardzo niskie. Dodatkowe trudnoœci diagnostyczne w przypadku testów wykrywaj¹cych mannan sprawiaj¹ ró nice antygenowe miêdzy poszczególnymi gatunkami Candida. Badania opracowane dla C. albicans mog¹ nie wykrywaæ obecnoœci mannanu C. glabrata czy C. krusei (1, 3, 17). Wykrywalne stê enia mannanu w p³ynach ustrojowych pacjentów z inwazyjn¹ kandydoz¹ wyprzedzaj¹ pojawienie siê przeciwcia³ przeciwko antygenom Candida o 1-3 tygodni (3). W przebiegu niektórych grzybic narz¹dowych stê enia mannanu mog¹ byæ jednak niewykrywalne. Fa³szywie ujemne wyniki w przypadku tego antygenu najczêœciej obserwowane s¹ w przebiegu kandydozy w¹trobowo-œledzionowej, grzybiczego zapalenia wsierdzia czy wewnêtrznego zapalenia ga³ki ocznej (endopthalmitis) (1, 3). Natomiast wysokie stê enie mannanu w p³ynie mózgowo-rdzeniowym obserwowano w przebiegu zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych wywo³anego przez grzyby z rodzaju Candida (3). Do metod badawczych wykorzystywanych w celu wykrywania obecnoœci mannanu nale ¹ EIA (enzyme immuno assay) (ICON Candida Assay system, Hybritec, USA) oraz aglutynacja lateksowa (RPLA: LA-Candida Antigen Detection System, Immuno Mycologics, USA; Pastorex Candida, Sanofi Pasteur, Francja). W naszych badaniach zastosowaliœmy odczyn lateksowy (OL) (Pastorex Candida, Bio-Rad, Francja). Test ten by³ dodatni

Porównanie wybranych odczynów serologicznych stosowanych w diagnostyce inwazyjnej kandydozy w zaledwie 6,91% badanych surowic, co mo e wynikaæ z przejœciowego charakteru antygenemii. Najwiêcej dodatnich wyników w teœcie lateksowym zaobserwowano dla niskich mian przeciwcia³ w teœcie IHA. Podobne wyniki otrzymali Bär i Hecker w badaniach nad uogólnion¹ kandydoz¹ u pacjentów z oddzia- ³ów intensywnej terapii. Naukowcy ci wykazali, i pacjenci, u których wykryto antygen Candida, mieli ni sze miana przeciwcia³ anty-candida w surowicy (œrednio 1:160) w porównaniu z pacjentami antygeno-negatywnymi (œrednie miana przeciwcia³ 1:180) (11). Swoistoœæ testu lateksowego Pastorex Candida, jak podaje producent (Bio-Rad, Francja), wynosi 99,7%. Inne Ÿród³a podaj¹ porównywalne, wysokie wartoœci swoistoœci (100%) (18). Czu³oœæ testu wyznaczona przez Herenta i wsp. wynios³a,6%, przy czym wartoœæ ta wzrasta³a wraz z liczb¹ próbek surowicy pobranych od danego pacjenta z podejrzeniem inwazyjnej kandydozy. Po ominiêciu w badaniu pacjentów, którym pobrano tylko jedn¹ lub dwie próbki surowicy, czu³oœæ testu wzros³a do 76,9% (18). W przypadku metod immunoenzymatycznych swoistoœæ testów jest wysoka, natomiast ich czu³oœæ waha siê miêdzy 3 i 90% (). Wœród czynników wp³ywaj¹cych na tak du ¹ rozbie - noœæ wyników wymieniane s¹: jakoœæ wykorzystywanych odczynników, gatunek Candida wywo³uj¹cy zaka enie, stan pacjenta, czêstoœæ wykonywanych badañ oraz czas pobrania krwi do badania w korelacji z nasileniem objawów chorobowych. W badaniach klinicznych, w których testy immunoenzymatyczne wykonywano wielokrotnie u ka dego pacjenta oraz w przypadku, gdy próbki krwi pobierano w najciê szym etapie choroby, obserwowano wysok¹ czu³oœæ metod immunoenzymatycznych. Czu³oœæ komercyjnych testów lateksowych wykrywaj¹cych mannan jest ni sza od EIA. W badaniu porównuj¹cym obie te metody wykorzystano odczynniki zawieraj¹ce mannan C. albicans i C. krusei. Wyniki dodatnie badania w przypadku metody immunoenzymatycznej obserwowano w 74% przypadków, natomiast czu³oœæ metody lateksowej wynios³a tylko 38% (). Wyniki badañ opublikowanych w miêdzynarodowym piœmiennictwie potwierdzaj¹ du ¹ przydatnoœæ testów serologicznych w ustaleniu diagnozy inwazyjnej grzybicy wywo³anej przez grzyby dro d opodobne nale ¹ce do rodzaju Candida, jak równie w monitorowaniu skutecznoœci leczenia przeciwgrzybicznego inwazyjnej kandydozy, szczególnie w przypadku wielokrotnego ich wykonania. W przypadku testów wykrywaj¹cych kr¹ ¹ce antygeny grzybów z rodzaju Candida nale y pamiêtaæ o pewnych ograniczeniach tych testów zwi¹zanych g³ównie z przejœciowym charakterem antygenemii czy ró nicami gatunkowymi miêdzy poszczególnymi przedstawicielami rodzaju Candida. Trudnoœci w interpretacji wyników testów wykrywaj¹cych przeciwcia³a anty-candida wystêpuj¹ przede wszystkim w przypadku osób z upoœledzon¹ odpornoœci¹ (pacjenci z zaburzon¹ produkcj¹ immunoglobulin), które stanowi¹ najwiêksz¹ grupê pacjentów poddawanych badaniom mikoserologicznym.. Zaobserwowano wy sz¹ czu³oœæ IHA w porównaniu z OP. 3. Surowicom dodatnim w odczynie Pastorex Candida towarzyszy³y niskie miana przeciwcia³ anty-candida w odczynie IHA. Piœmiennictwo 1. Matthews R., Burnie J.: Mycoserology. [w:] Microbiology and microbial infections. vol. IV Medical Mycology. red. L. Collier, A. Balows, M. Sussman, vol. ed. L. Ajello, R.J. Hay, wyd. Arnold, Londyn, 1998, 89-96.. Ochman E.: Diagnostyka mikrobiologiczna i serologiczna uk³adowych zaka eñ grzybiczych. [w:] Zaka enia grzybicze wybrane zagadnienia. red. D. Dzier anowska, wyd. -medica press, Bielsko Bia³a, 006, 67-70. 3. Quindos G., Moragues M.D., Ponton J.: The role of antygen and antibody testing in the diagnosis of invasive candidiasis. Mikol. Lek. 004, 11, 14-11. 4. Pfaller M.A., Diekema D.J.: Epidemiology of invasive candidiasis: a persistent public health problem. Clin. Microbiol. Rev., 007, 0, 133-63.. Marr K.A.: Invasive Candida infections: the changing epidemiology. Oncology (Williston Park), 004, 18, 9-14. 6. Budak A.: Diagnostyka serologiczna grzybic. [w:] Zarys Mikologii Lekarskiej. red. E. Baran, wyd. Volumed, Wroc³aw, 1998, 7-78. 7. Budak A., Macura A.B., Pawlik B.: Diagnostyka mykologiczna. Diagnostyka serologiczna grzybic. [w:] Mikrobiologia lekarska. red. P.B. Heczko, Wydawnictwo Uniwersytetu Jagielloñskiego, Kraków, 1999, 89-91. 8. Bisbe J., Miro J.M., Torres J.M., Latorre X., Alia C., Amaral M., Estivill D., Mallolas J., Trilla A., Soriano E.: Diagnostic value of serum antybody and antigen detection in heroin addicts with systemic candidiasis. Rev. Infect. Dis., 1989, 11, 310-31. 9. Ibanez-Nolla J., Torres-Rodriguez J.M., Nolla M., Leon M.A., Mendez R., Soria G., Diaz R.M., Marrugat J.: The utility of serology in diagnosing candidosis in non-neutropenic critically ill patients. Mycoses, 001, 44, 47-3. 10. Petri M.G., Konig J., Moecke H.P., Gramm H.J., Barkow H., Kujath P., Dennhart R., Schafer H., Meyer N., Kalmar P., Thulig P., Muller J., Lode H.: Epidemiology of invasive mycosis in ICU patients: prospective multicenter study in 43 non-neutropenic patients. Paul-Ehrlich Society for Chemotherapy, Divisions of Mycology and Pneumonia Research. Intensive Care Med., 1997, 3, 317-3. 11. Bär W., Hecker H.: Diagnosis of systemic Candida infections in patients of the intensive care unit. Significance of serum antigens and antibodies. Mycoses, 00, 4, -8. 1. Chakrabarti A., Roy P., Kumar D., Sharma B.K., Chugh K.S., Panigrahi D.: Evaluation of three serological tests for detection of anti-candidal antibodies in diagnosis of invasive candidiasis. Mycopathologia, 1994, 16, 3-7. 13. Freidank H., Thiel L., Henninger S.: Comparison of immunodiffusion and counterimmunoelectrophoresis for the detection of precipitating antibodies against Candida and Aspergillus antigens. Mycoses, 1994, 37 Suppl.1, 79-83. 14. Pallavicini F., Izzi I., Pennisi M.A., Morace G., Portaccio G.G., Bello G., Iodice F., Godino D., Del Borgo C., Proietti R.: Evaluation of the utility of serological tests in the diagnosis of candidemia. Minerva Anestesiol., 1999, 6, 637-639. 1. Sendid B., Tabouret M., Poirot J.L., Mathieu D., Fruit J., Poulain D.: New enzyme immunoassays for sensitive detection of circulating Candida albicans mannan and antimannan antibodies: useful combined test for diagnosis of systemic candidiasis. J. Clin. Microbiol., 1999, 37, 110-117. 16. Persat F., Topenot R., Piens M.A., Thiebaut A., Dannaoui E., Picot S.: Evaluation of different commercial ELISA methods for the serodiagnosis of systemic candidosis. Mycoses, 00, 4, 4-460. 17. Matthews R.C.: Comparative assessment of the detection of candidal antigens as a diagnostic tool. Med. Mycol., 1996, 34, 1-10. 18. Herent P., Stynen D., Hernando F., Fruit J., Poulain D.: Retrospective evaluation of two latex agglutination tests for detection of circulating antigens during invasive candidosis. J. Clin. Microbiol., 199, 30, 18-164. Wnioski 1. W badaniu stwierdzono du ¹ rozbie noœæ wyników uzyskiwanych w odczynie hemaglutynacji poœredniej (IHA) i odczynie immunoprecypitacji w elu (OP ). Praca wp³ynê³a do Redakcji: 007.0.13. Zaakceptowano do druku: 007.07.0. 183