2014-07-17 Zestaw dydaktyczny EasyGenotyping PCR-RFLP - S. aureus genotypowanie szczepów 5taphy/ococcus aureus metodą PCR-RFLP Celem ćwiczenia jest przeprowadzenie typowania genetycznego dostarczonych szczepów klinicznych Stephvlococcus eureus (DNA) i przyporządkowanie ich do poszczególnych grup genotypowych. blrt BLIRTS.A. ul. Trzy lipy 3/1.38, 80-172 Gdańsk tet.: +4858739-61-50, fax: +4858739-61-51.! ----...
ZAJĘCIA LABORATORYJNE UWAGA!!!» Należy pamiętać o zwirowaniu probówek z odczynnikami po rozmrożeniu, tak aby całość mieszaniny znalazła się na dnie probówki!!!» Przed przystąpieniem do przygotowywania reskcji per należy umyć ręce i przygotować stanowisko pracy (ttpsv, probówki, rękawiczki). Do dezynfekcji stołu oraz innego drobnego sprzętu laboratoryjnego (np. pipety, statywy, itd.) użyć 3% wody utlenionej.» Ze względu na dużą czułość układu z czym związana jest jego duża wrażliwość na kontaminacje należy zawsze pracować w jednorazowych rękawiczkach.» Zaleca się każdy z trzech etapów oznaczenia: przygotowanie reekcji per, amplifikację oraz elektroforezę produktów per prowadzić w oddzielnych pomieszczeniach. Szczególnie należy zwrócić uwagę na produkty per z poprzednich oznaczeń - stanowią one najbardziej niebezpieczne źródło kontaminacji.» Do przygotowania reekcji per najlepiej używać pipet, które są autoklawowalne (co pewien czas należy je autoklawować).» Zaleca się stosować oddzielne pipety do każdego z etapów oznaczenia, czyli przygotowania i rozporcjowania Master Mix-u, dodawania matrycy, nanoszenia produktów per na żel.» Należy przestrzegać zasady, że tylko jedna probówka może być otwarta w danym momencie. Dzięki temu zmniejsza się ryzyko kontaminacji.» Należy unikać dotykania krawędzi probówek. Celem ćwiczenia jest przeprowadzenie typowania genetycznego dostarczonych szczepów klinicznych Staphylococcus aureus i przyporządkowanie ich do poszczególnych grup genotypowych. --------------;;bi;;-~.;;;----;t~-.::-,. r'~-"7'::--------;:b:;-li;;r=:;t;-:s;;-.a-;-. D A ul. Trzy lipy 3/1.38, 80-172 Gdańsk Ir tel.: +4858739-61-50, fax: +4858739-61-51 GDAŃSK _ N co" o l:l Vl
.'--------'-~~ I. Przygotowanie reakcji amplifikacji genu coa A. Przygotowanie mieszaniny reakcyjnej dla jednej próbki. Składniki mieszaniny należy dodawać do probówki do PCR (0,2 mi) w kolejności zamieszczonej w tabeli poniżej. Każda z grup poddaje analizie 2 szczepy 5. aureus. Odczynnik Woda do PCR 31 10x Bufor do r-cji PCR 5 MgCI 2 [50 mm) 2 roztwór dntps [8 mm) 5 Starter FORWARD[10 ~M) 2 Starter REVERSE[10 ~M) 2 Termostabilna polimeraza DNA [2U/~I) 1 DNA matrycowe - ANALIZOWANA PRÓBKA 2 Objętość końcowa 50 Tabela 1. Skład mieszaniny reakcyjnej PCR - coa dla analizowanej próbki. B. Przygotowanie mieszaniny reakcyjnej dla Kontroli negatywnej. Ilość ' MM ix na Suma Rozporcjować [pl]... prób [pl] po [pl]: Dla każdej serii analiz należy również wykonać kontrolę negatywną, aby sprawdzić poprawność pracy i czystość odczynników, by wykluczyć ewentualne fałszywie pozytywne wyniki. Skład mieszaniny zamieszczono w tabeli 2. Odczynnik Ilość [pl] Woda do PCR 31 1Ox Bufor do r-cji PCR 5 MgCl 2 [50 mm) 2 roztwór dntps [8 mm] 5 Starter FORWARD[10 ~M) 2 Starter REVERSE[10 ~M) 2 Termostabilna polimeraza DNA [2U/~I] 1 Woda do PCR 2 Objętość końcowa 50 Tabela 2. Skład mieszaniny reakcyjnej per - coa dla kontroli negatywnej. Powyższe 3 (2 próbki + kontrola negatywna) mieszaniny reakcyjne mogą być przygotowane jednocześnie. W tym przypadku należy przygotować Master Mix (MMix) - ilości stosowanych odczynników M przeznaczone dla pojedynczej próbki należy pomnożyć przez: 3 (ilość próbek) + 1, czyli przez 4. W ~. o tabeli 1 zamieszczono pola potrzebne do wykonania odpowiednich obliczeń. Uzyskaną wartość dla ~ IIIIIIII,. ~~~_9~_--.------~~~~~~~~S~li:~;-3/-1.-38-,-8-0--17-2-GOO--ńS-k----------~bI~.~~I ~r-_~t~ ~ tel.: +4858739-61-50,fax: +4858739-61-51 GDAŃ s K www.dnagdansk.com. e-mail: info@dnagdansk.com
~ '" c o b Vl ~"~~~ objętości całkowitej MMix-u należy podzielić przez ilość próbek na jaką wyliczany był MMix (czyli 4). Otrzymana wartość jest objętością mieszaniny reakcyjnej jaką należy rozporcjować do poszczególnych probówek. Powinna być ona zgodna z sumą składników zliczanych do MMix-u przeznaczonych dla próbki. Przed rozporcjowaniem przygotowany MMix należy wymieszać przez pipetowanie. Probówki z przygotowanymi mieszaninami reakcyjnymi należy umieścić w termocyklerze i nastawić profil temperaturowo-czasowy zamieszczony w tabeli 3. Etap Temperatura [OC] Czas [sekl Wstępna denaturacja 95 120 Denaturacja 95 30 Przyłączanie starterów 55 30 35 cykli Elongacja 72 60 Wydłużanie końcowe 72 300 Chłodzenie 10 00 Tabela 3. Profil temperaturowo-czasowy dla reakcji PCR. bliri BLIRTS.A. ul. Trzy lipy 3/1.38, 80-172 Gdańsk tel.: +4858739-61-50, fax: +4858739-61-51
» Rozdział elektroforetyczny należy prowadzić w 2% żelu agarozowym.» Przed przystąpieniem do wykonania żelu należy przygotować 1x stężony bufor TAE poprzez 50-krotne rozcieńczenie buforu 50x TAE (dołączonego do zestawu). Na przykład dla przygotowania 1000 mi buforu 1x TAE należy do naczynia o odpowiedniej wielkości nalać 20 mi 50x TAE i 980 mi wody destylowanej.» Następnie 1 g agarozy należy rozpuścić w 50 mi buforu 1x TAE (kuchenka mikrofalowa, palnik).» Ostudzić żel do temperatury ok. 60 C. UWAGAIII Wszystkie operacje od tego momentu należy wykonywał w rękawiczkach nitrylowych, stanowiących ochronę przed bromkiem etydyny (czynnik rakotwórczy).» Dodać 5 ~I roztworu bromku etydyny o stężeniu 1 mg/mi.» Wymieszać i wylać ostrożnie żel do tacki do wylewania żeli z osadzonym odpowiednio grzebieniem lub grzebieniami. Należy zwrócić uwagę aby w żelu nie było pęcherzyków powietrza (zbyt schłodzony żel - taki żel należy rozpuścić ponownie).» Po zastygnięciu żelu wyjąć grzebienie w taki sposób, aby nie uszkodzić studzienek i wstawić żel do komory aparatu do elektroforezy i zalać buforem 1x TAE tak, aby całkowicie wypełnił komory elektrodowe i pokrył powierzchnię żelu.» Uzyskane produkty reakcji PCRnależy nanosić za pomocą pipety do studzienek żelu, w następujący sposób: - 10 ~I markera wielkości DNA M100-1000 ready-to-use - 2 ~I buforu obciążającego 6x Green i 10 ~I mieszaniny reakcyjnej PCRpróbek» Rozdział należy prowadzić przez 0,5-1 h, przy napięciu ok. 5-10 V/cm długości żelu.» Po zakończonej elektroforezie żel należy analizować w świetle UV transiluminatora. l..jj '"c g '" BlIRT S.A. bliri ul. Trzy lipy 3/1.38, 8G-172Gdańsk tel.: +4858739-61-50, fax: +4858739-61-51
\O '" s:: o b Vl '------.::..-~~~=_=_=_~ = == = D~Y...:._.8 '7 IV. Trawienie enzymatyczne - coa I RFLP A. Przygotowanie mieszaniny restrykcyjnej dla jednej próbki. Składniki mieszaniny należy dodawać do nowej probówki PCR (0,2 mi) w kolejności zamieszczonej w tabeli poniżej. Każda z grup poddaje analizie 2 szczepy S. aureus. Odczynnik 10x Bufor do r-cji trawienia 2,5 Enzym restrykcyjny RsaI [lou/iji] 0,5 Produkt reakcji PCR 22 Objętość końcowa 25 Ilość MMix na Suma Rozporcjować [IJI]... prób [IJI] po [IJI]: Tabela 4. Skład mreszanmy restrykcyjnej coalrsai dla anatlzowane] probkl. Powyższe 2 mieszaniny reakcyjne mogą być przygotowane jednocześnie. W tym przypadku należy przygotować Master Mix (MMix) postępując analogicznie jak w przypadku reakcji PCR - coa (pkt. LA). Probówki z przygotowanymi mieszaninami restrykcyjnymi należy umieścić w termocyklerze i inkubować w temperaturze 3rC przez 1 h. V. Detekcja produktów reakcji per» Należy postępować analogicznie jak w punkcie II. r'~~~------~b=l=ir~t~s.a~ ------------------~bi~~ ~~t ul. Trzy lipy 3/1.38, 80-172 Gdańsk D A Ir ODAN ' SK tel.: +4858739-61-50, fax: +4858739-61-51
Genotyp Nr szczepu Etap I. Etap II. S.lIureus Amplifikacja genu COlI Trawienie produktu PeR - COlI 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Tabela 5 WynikI.. typowania metodą PCR-RFLP - klasyfikacja szczepow S. aureus do poszczególnych genotypów. r-, '"c o b Vl ="~-=-----=BL=IRT=-=S'-:-.A --------:bi=--== --=t,...--:-l,.,. D A ul. Trzy lipy3/1.38, 8(H72 Gdańsk Ir GDAŃSK tel.: +4858739-61-50, fax: +4858739-61-51
Blolab Innovatlve Research Technologies BLIRT S.A. ul. Trzy lipy 3/1.38 80-172 Gdańsk tel.: +4858739-61-50 'fax: +48 58 739-61-51 www.dnagdansk.com e-mail: info@dnagdansk.com GDAŃSK bll._rj BURT ul. Trzy S.A. lipy 3/1.38, 80-172 Gdańsk tel.: +4858739-61-50, fax: +4858739-61-51.1