Uniwersytet Gdański, Wydział Biologii Biologia i Biologia Medyczna II rok Katedra Genetyki Molekularnej Bakterii Katedra Biologii i Genetyki Medycznej Przedmiot: Katedra Biologii Molekularnej Biologia Molekularna z Biotechnologią =============================================================================================== Ćwiczenia 1 Klonowanie in silico Klonowanie molekularne jest metodą inżynierii genetycznej wykorzystywaną do tworzenia i powielania (klonować = tworzyć identyczne kopie) zrekombinowanych wektorów, niosących wybrany fragment DNA. W praktyce laboratoryjnej klonowanie DNA polega na łączeniu (czyli rekombinacji) cząsteczki wektora (plazmidu lub faga) z wybranym fragmentem DNA (wstawką) i wprowadzeniu takiego tworu do organizmu, w którym uzyskany hybrydowy DNA może amplifikować się z wykorzystaniem aparatu enzymatycznego gospodarza. W efekcie otrzymuje się klon, czyli zbiór cząsteczek identycznych pod względem genetycznym. Narzędziami w klonowaniu są szczepy bakteryjne, wektory i enzymy. Pierwszym etapem klonowania jest zwykle planowanie konstrukcji zrekombinowanego wektora in silico (ryc. 1 A). Następnie z wykorzystaniem szeregu technik biologii molekularnej przeprowadza się syntezę zaprojektowanych konstruktów in vitro (ryc. 1 B). Kolejnym etapem jest powielanie in vivo otrzymanych uprzednio konstruktów (ryc 1 C). Stworzone w ten sposób nowe zrekombinowane cząsteczki DNA mogą być wykorzystane do przeprowadzenia dowolnych eksperymentów. A) Tworzenie zrekombinowanych wektorów in silico, czyli planowanie konstrukcji zrekombinowanego wektora z wykorzystaniem programów komputerowych. In silico (łac. w krzemie ), prowadzenie eksperymentów/symulacji z wykorzystaniem komputera. B) Konstrukcja zrekombinowanych wektorów in vitro, czyli tworzenie zaprojektowanych wektorów z wykorzystaniem technik biologii molekularnej (np. PCR, trawienie restrykcyjne) w warunkach laboratoryjnych. In vitro (łac. w szkle ), prowadzenie badań poza organizmem ( w probówce ). WEKTOR WSTAWKA ZREKOMBINOWANY WEKTOR C) Powielenie skonstruowanych wektorów in vivo, dzięki wykorzystaniu zdolności wektora do autonomicznej replikacji wewnątrz komórek gospodarza. In vivo (łac. na żywym ), prowadzenie badań wewnątrz żywego organizmu. Rycina 1. Uproszczony schemat przedstawiający etapy klonowania molekularnego. 1. Wektory genetyczne Wektorami nazywamy elementy genetyczne służące do przenoszenia informacji genetycznej do wnętrza komórek. Istotną cechą wektorów genetycznych jest ich zdolność do autonomicznej (tj. niezależnej 1
od chromosomu gospodarza) replikacji w komórkach gospodarza. Wektorami genetycznymi mogą być plazmidy lub wirusy (w tym bakteriofagi), jednak w procesie klonowania najczęściej wykorzystuje się wektory plazmidowe (ryc. 2). Plazmidy są cząsteczkami DNA występującymi naturalnie w komórkach bakteryjnych, jednak na potrzeby inżynierii genetycznej najczęściej wykorzystuje się zmodyfikowane pochodne naturalnych plazmidów. W celu uzyskania wektora plazmidowego użytecznego w procesie klonowania DNA, plazmidy zwykle zmodyfikowane są w następujący sposób: 1. Masa cząsteczkowa plazmidu zostaje zredukowana. Obecność we wnętrzu komórki dużych ilości dodatkowej informacji genetycznej kodowanej w plazmidowym DNA wiąże się z pogorszeniem kondycji komórki (tzw. fitness), a nawet spadkiem jej żywotności. Rekombinacja wektora z klonowanym fragmentem DNA powoduje z kolei wzrost masy cząsteczkowej plazmidu (i ilości informacji genetycznej zawartej w plazmidowym DNA). Można zatem powiedzieć, że im mniejszy wektor, tym większa jego pojemność. Oznacza to, że można wykorzystać go do przenoszenia do komórki większych fragmentów DNA bez ryzyka znacznego obniżenia fitness komórek. 2. Geny warunkujące możliwość transferu zrekombinowanego plazmidu do innych bakterii zostają usunięte. Dzięki temu przekazywanie wektora odbywać się będzie jedynie wertykalnie (czyli z komórek macierzystych do potomnych). 3. Utworzenie miejsca wielokrotnego klonowania (ang. multiple cloning site MCS). MCS tworzy się zwykle poprzez integrację z plazmidem syntetycznego oligonukleotydu zawierającego sekwencje DNA rozpoznawane przez wybrane enzymy restrykcyjne. Ułatwia to integrację z wektorem plazmidowym dowolnego DNA ze względu na większy wybór enzymów restrykcyjnych, które można zastosować w tym procesie. 4. Obecność jednego lub kilku genów markerowych (markerów selekcyjnych), służących do wyróżnienia i selekcji transformantów (komórek, które pobrały zrekombinowany wektor) na podstawie ich fenotypu. 2. Wstawka Rycina 2. Schemat przedstawiający budowę wektora plazmidowego. Wykorzystując technikę klonowania molekularnego można tworzyć i powielać plazmidy zawierające dowolne fragmenty DNA (tzw. wstawki lub inserty ). Jednym z najczęściej wykorzystywanych sposobów przygotowania wstawki jest jej powielenie (amplifikacja) z wykorzystaniem techniki łańcuchowej reakcji polimerazy (ang. polymerase chain reaction PCR). W tym celu należy zaprojektować startery do reakcji PCR, czyli krótkie oligonukleotydy, komplementarne do matrycowego DNA, który zamierzamy powielić. Startery do amplifikacji wstawki projektuje się zwykle w taki sposób, aby możliwe było trawienie restrykcyjne amplifikowanych fragmentów DNA, a następnie ich integracja z wektorem plazmidowym. Dobrze zaprojektowane startery posiadają następujące cechy: Długość startera: 19-25 nt Temperatura topnienia: 58-62 C Oba startery w parze powinny mieć zbliżoną temperaturę topnienia [T m ] 40< %GC < 60 2
Sekwencja startera powinna być pozbawiona powtórzeń (ang. runs), np. AAAA Starter nie powinien mieć powtórzeń G/C na końcach 5 i 3, ale dobrze jeśli występuje jeden nt C lub G 3. Enzymy nich: W procesie klonowania molekularnego często wykorzystuje się różnego rodzaju enzymy. Należą do A) Enzymy restrykcyjne - izolowane z bakterii białka o aktywności endonukleaz, zdolne do rozpoznawania specyficznych sekwencji w DNA i do przecinania dwuniciowej cząsteczki DNA w określonym miejscu. Wskutek cięcia enzymami restrykcyjnymi, w DNA powstają tępe lub lepkie końce, co umożliwia zaplanowanie integracji z wektorem plazmidowym dowolnego DNA w wybranej orientacji. B) Alkaliczna fosfataza enzym, który katalizuje reakcję usuwania grup 5 fosforanowych z DNA, RNA oraz tri fosforanów. Defosforylacja końców DNA podczas przygotowywania wektora do klonowania uniemożliwia jego recyrkularyzację ( zamykanie się pustych, nie zawierających wstawki wektorów) C) Fragment Klenowa polimerazy DNA I białko będące produktem proteolizy polimerazy DNA I z E. coli. Posiada aktywność polimerazy (3' 5 ) i aktywność egzonukleolityczną 3' 5, jednak bez aktywności egzonukleolityczną 5' 3. Enzym ten ma zatem zdolność katalizowania wiernej reakcji polimeryzacji bez degradacji końców 5. W procesie klonowania molekularnego enzym ten wykorzystywany jest w celu tworzenia tępych końców DNA (poprzez wypełnianie lepkich końców dobudowywanie nici DNA do końca 3, na matrycy końców DNA wysuniętych w kierunku 5 ) D) Ligazy DNA są enzymami katalizującymi tworzenie wiązania fosfodiestrowego pomiędzy dwoma fragmentami DNA. Funkcją ligaz DNA jest łączenie przerw w DNA, co ma miejsce przy wszystkich procesach angażujących syntezę nowych nici DNA (replikacja łącznie fragmentów Okazaki, naprawa DNA) czy wycinanie i wstawianie ich fragmentów (rekombinacja genetyczna). Ligacja proces łączenia wiązaniem fosfodiestrowym dwóch fragmentów lub końców nici DNA za pomocą ligazy. Proces ligacji wymaga energii w postaci ATP lub NAD (w zależności od rodzaju ligazy) (ryc. 3). Rycina 3. Schemat procesu ligacji komplementarnych końców DNA wektora i wstawki. 4. Zagadnienia do samodzielnego przygotowania: 1. Rodzaje wektorów do klonowania 2. Wektory wahadłowe 3. Wektory wysoko- i niskokopijne oraz ich zastosowanie 3
5. Literatura 1. J. Kur Podstawy inżynierii genetycznej. Teoria, ćwiczenia, testy. Wydawnictwo PG, 1994. 2. B. Zalewska-Piątek, M. Olszewski, R. Piątek, S. Milewski, J. Kur Biologia molekularna. Ćwiczenia laboratoryjne. Wydawnictwo PG, 2009. Część praktyczna Celem ćwiczenia jest zaplanowanie konstrukcji pochodnej plazmidu puc18 zawierającej gen λo z wykorzystaniem programu komputerowego Serial Cloner, czyli klonowanie in silico genu λo w wektorze puc18. Podczas kolejnych zajęć (ćwiczenia 2-4) przeprowadzone zostanie klonowanie molekularne z wykorzystaniem technik inżynierii genetycznej w warunkach laboratoryjnych, zgodnie z projektem opracowanym podczas ćwiczenia 1. Poniżej wymieniono etapy klonowania genu λo oraz zaznaczono, na których ćwiczeniach dany etap zostanie wykonany (ryc. 4): 1. Izolacja wektora plazmidowego puc18. Realizacja: ćwiczenie 2 2. Przygotowanie wstawki (fragment DNA zawierający gen λo ) z wykorzystaniem reakcji PCR. Realizacja: ćwiczenie 3 3. Trawienie restrykcyjne wektora oraz wstawki enzymami BamHI oraz PstI. Realizacja: ćwiczenie 3 4. Ligacja, czyli reakcja łączenia wektora ze wstawką. Realizacja: ćwiczenie 4 5. Wprowadzenie zrekombinowanego wektora plazmidowego (pochodna plazmidu puc18 niosąca gen λo ) ) do komórek gospodarza, czyli transformacja komórek biorcy otrzymanym zrekombinowanym plazmidem. Realizacja: ćwiczenie 4 6. Selekcja transformantów - po ćwiczeniu 4 Rycina 4. Schemat klonowania molekularnego z wykorzystaniem reakcji ligacji. 4
Wykorzystanie programu Serial Cloner podczas kolejnych etapów klonowania in silico: 1. Wektor plazmidowy puc18 wizualizacja sekwencji, MCS oraz dostępnych genów markerowych. 2. Przygotowanie wstawki pochodzącej z plazmidu pcb104 (gen λo) symulacja przebiegu reakcji PCR 3. Trawienie restrykcyjne wektora i wstawki (enzymami BamHI oraz PstI) dobór enzymów restrykcyjnych i przedstawienie graficzne powstałych fragmentów 4. Ligacja czyli reakcja łączenia wektora ze wstawką wizualizacja powstałego zrekombinowanego wektora plazmidowego Wprowadzenie do programu: Widok okna programu. Podstawowe narzędzia, które będziemy wykorzystywać w pracy z tym programem na zajęciach: 1 otwiera nową sekwencję do obróbki 2 otwiera sekwencję DNA zapisaną na dysku, nad którą wcześniej pracowaliśmy 3 zapisuje zmienioną sekwencję DNA 4 pokazuje w sposób graficzny otwartą sekwencji DNA 5 pokazuje szczegóły wczytanej sekwencji z miejscami restrykcyjnymi 6 wskazuje ilość miejsc cięcia dla danego enzymu restrykcyjnego w wybranej sekwencji DNA 7 pozwala przeprowadzić analizę po użyciu enzymów restrykcyjnych na żelu agarozwym 8 zaznacza miejsca z genami, które warunkują specyficzne cechy wektora 9 pozwala odnaleźć odpowiednie miejsca na wskazanej sekwencji, np. miejsca restrykcyjne 10 pozwala na przeprowadzenie wirtualnej ligacji fragmentów DNA 11 pozwala na projektowanie primerów i przeprowadzenie wirtualnej reakcji PCR 12 pozwala na sprawdzenie miejsc homologicznych pomiędzy sekwencjami 5
Wprowadzanie sekwencji do programu: file open wybór pliku (plazmid pcb104) w celu wizualizacji plazmidu wybierz opcję Graphic Map, a następnie wybierz opcję Circularize Po wczytaniu danej sekwencji DNA do programu, możemy określić jej wielkość, wskazać miejsce inicjacji replikacji, czy sprawdzić występujące tu markery selekcyjne. Projektowanie starterów/ reakcja PCR: Aby uzyskać produkt po reakcji PCR i zintegrować go z wektorem, konieczne jest zaprojektowanie starterów komplementarnych do interesującej nas sekwencji DNA (matrycy DNA), którą chcemy powielić. Podczas konstrukcji wprowadzamy miejsce cięcia dla enzymów restrykcyjnych na końcu 5, aby możliwe było trawienie restrykcyjne, a następnie reakcja ligacji. 6
Wprowadzamy sekwencję matrycową i zaznaczamy fragment sekwencji, który zamierzamy powielić. Sprawdzamy czy starter ma odpowiednią długość, ilość par GC, temperaturę topnienia. Za pomocą tego programu możemy również przeprowadzić wirtualną reakcję PCR z wykorzystaniem uprzednio zaprojektowanych pimerów. Wczytujemy sekwencję matrycową (opcja u dołu okna Run a PCR ), czyli tę samą, którą wykorzystaliśmy do projektowania starterów, i otrzymujemy produkt PCR, który później będziemy wykorzystać do reakcji ligacji. Etapy: wybierz opcję PCR wstaw sekwencje rozpoznawane i cięte przez oba enzymy restrykcyjne na końcach 5 projektowanych primerów w miejscu oligo tail not indentical to the target sequence, oraz sekwencje pochodzące z plazmidu pcb104 w miejscu segment identical to the target sequence. Po wyborze sekwencji pochodzącej z plazmidu pcb104 należy zaznaczyć opcję use as PCR forward primer oraz use as PCR reverse primer wstaw matrycę select target DNA i wybierz pcb104 wciśnij Run PCR Wirtualna ligacja wektora i wstawki: Program ten pozwala na przeprowadzenie wirtualnej reakcji ligacji dwóch fragmentów DNA: wektora oraz wstawki (produktu reakcji PCR), które zostały potrawione tymi samymi enzymami restrykcyjnymi. Wprowadzamy wcześniej przygotowaną i sprawdzoną sekwencję DNA do programu SerialCloner. Zaznaczamy wybrane przez nas enzymy restrykcyjne i uzyskujemy informację na temat rodzaju cięcia restrykcyjnego (końce tępe lub lepkie oraz wielkości otrzymanego fragmentu DNA). 7
Tak uzyskane fragmenty DNA ligujemy, a uzyskany zrekombinowany plazmid zapisujemy poniżej mapa powstałego konstruktu oraz dwóch plazmidów wykorzystanych do jego stworzenia. Etapy ligacji: po pocięciu enzymami restrykcyjnymi plazmidu puc19 oraz wstawki z plazmidu pcb104 wybieramy opcję Construct, a następnie wstawiamy otwartą sekwencję nukleotydową plazmidu puc19 w Select DNA 1 oraz sekwencję nukleotydową wstawki w Select DNA2 reakcję wirtualnej ligacji przeprowadzamy poprzez naciśnięcie opcji LIGATE Rycina 5. Schemat plazmindu pcb104 zawierającego gen λo, który zostanie wklonowany w MCS plazmidu puc19 8
Rycina 6. Schemat plazmidu puc19 zawierającego fragment genu lacz kodujący N-końcowy fragment β-galaktozydazy Rycina 7 Zrekombinowany plazmid uzyskany w wyniku klonowania in silico. 9