PLATELIA EBV-VCA IgM testów

PLATELIA EBV-VCA IgM 72936 96 testów TEST IMMUNOENZYMATYCZNY DO JAKOŚCIOWEGO WYKRYWANIA PRZECIWCIAŁ KLASY IgM PRZECIWKO WIRUSOWI EPSTEIN-BARR (PRZECIWKO ANTYGENOWI KAPSYDOWEMU) W SUROWICY LUDZKIEJ 1

1- ZASTOSOWANIE Test immunoenzymatyczny do jakościowego oznaczania przeciwciał klasy IgM przeciwko antygenowi kapsydowemu wirusa Epstein-Barr (VCA) w surowicy ludzkiej. Test Platelia EBV-VCA IgM, stosowany w połączeniu z innymi testami serologicznymi do wykrywania zakażenia wirusem EB, jak Platelia EBV-VCA IgG, Platelia EB-NA-1 IgG i Platelia EBV-EA-D IgG), służy do diagnostyki mononukleozy zakaźnej. 2 ZNACZENIE KLIN ICZNE Wirus Epsteina-Barr (EBV) jest rozpowszechnionym na całym świecie patogenem człowieka. Nosicielstwo w populacji dorosłych w USA wynosi 80%. Odkryty w 1964 roku wirus EB, został uznany za czynnik etiologiczny rosnącej liczby zakażeń człowieka, takich jak np. mononukleoza zakaźna. Jest on również związany z powstawaniem chłoniaków z limfocytów B u pacjentów z immunosupresją, zarówno u biorców przeszczepów jak i chorych na AIDS. Wirus EB został włączony do rodziny herpeswirusów ze względu na charakterystyczną morfologię. Wszystkie herpeswirusy są zdolne do utrzymywania się w stanie latencji po zakażeniu gospodarza. Mononukleoza zakaźna jest ostrym, samoograniczającym się zakażeniem, przejawiającym się proliferacją zakażonych wirusem limfocytów. Mimo, że pierwotne zakażenie EBV w dzieciństwie przeważnie przebiega bezobjawowo, blisko połowa do dwóch-trzecich z pierwotnych infekcji rozwija się u starszej młodzieży lub młodych dorosłych w postać mononukleozy zakaźnej, z następującymi objawami klinicznymi: zapalenie gardła, migdałków, uogólnione powiększenie węzłów chłonnych, złe samopoczucie, ból głowy, bóle mięśniowe, powiększenie śledziony i wątroby, wysypka i leukocytoza. W odpowiedzi na zakażenie wirusem EB następuje wytwarzanie przeciwciał przeciwko czterem głównym kompleksom antygenowym: antygenowi jądrowemu, indukowanemu przez wirus (EBNA EB nuclear antigen), wczesnemu antygenowi, indukowanemu przez wirus (EA early antigen), antygenowi kapsydu wirusa (VCA viral capsid antigen) i antygenowi błonowemu, indukowanemu przez wirus (MA membrane antigen). Kompleks EA zawiera dwa składniki EA-D (składnik dyfundujący) i EA-R (składnik ograniczony). Przeciwciałav klasy IgM przeciwko antygenowi VCA są wykrywane we wczesnej fazie zakażenia. Poziom przeciwciał wzrasta dość szybko i osiąga szczyt po 3-4 tygodniach, a następnie spada do wartości nie wykrywalnych. 3 ZASADA OZNACZENIA Testy immunoenzymatyczne (ELISA) wykorzystują zdolność materiałów biologicznych (np. antygenów) do adsorbowania się na plastikowych powierzchniach, takich jak polistyren (faza stała). Test PLATELIA EBV-VCA IgM wykorzystuje technikę ELISA, w której oczyszczony chromatografią powinowactwa antygen VCA jest związany z dołkami mikropłytki. W wyniku kontaktu antygenu z surowicą pacjenta, obecne w surowicy swoiste przeciwciała zwiążą się z antygenem, tworząc na fazie stałej kompleksy antygen-przeciwciało. Roztwór do opracowywania próbek używany jest do usunięcia z badanej przeciwciał IgG i IgM-RF, mogących potencjalnie interferować z oznaczeniem. Nadmiar przeciwciał zostaje usunięty podczas płukania. Następnie dodawany jest koniugat kozie przeciwciała przeciwko ludzkim immunoglobulinom IgM, znakowane peroksydazą, które wiążą się z utworzonym kompleksem antygen-przeciwciało. Nadmiar koniugatu zostaje usunięty podczas płukania, następnie dodawany jest substrat dla peroksydazy, czterometylobenzydyna (TMB). O obecności przeciwciał IgM przeciwko antygenowi EBV-VCA w badanej surowicy świadczy powstanie niebieskiej barwy. Zatrzymanie reakcji enzymatycznej następuje po dodaniu 1N kwasu siarkowego; studzienki zmieniają barwę na żółtą. Natężenie barwy jest proporcjonalne do stężenia przeciwciał w surowicy. Gęstość optyczną odczytuje się spektrofotometrycznie w czytniku mikropłytek. Czułość, swoistość i powtarzalność testu ELISA jest porównywalna do innych metod serologicznych, wykrywających przeciwciała, jak immunofluorescencja, odczyn wiązania dopełniacza, hemaglutynacja i radioimmunologia. 2

4 SKŁAD ZAESTAWU Odczynniki są przeznaczone wyłącznie do diagnostyki in vitro. Oznaczenie Charakterystyka odczynnika Opakowanie Mikropłytka: 12 pasków po 8 studzienek R1 Microplate opłaszczonych inaktywowanym oczyszczonym 1 płytka antygenem kapsydu wirusa EB (gp125); w foliowej torebce z pochłaniaczem wilgoci. Concentrated Stężony bufor do płukania (20 x): 1 x 50 ml R2 Washing Solution (20x) Bufor Tris (ph 7.2± 0.2), 1% Tween 20 Konserwant: Proclin 300 (0.1%) R3 Kontrola ujemna (ludzka) pod względem przeciwciał Non IgM anty-ebv-vca, ujemna pod względem HBs Ag i 1 x 0.4 ml reactive przeciwciał anty-hcv, anty-hiv-1 i anty-hiv-2. control Konserwant: azydek sodu (<0.1%) i pen/strep (0.01%) R4a R4b R5 R6 R7 R9 R10 Positive Control I Positive Control II Calibrator Conjugate Diluent II Chromogen TMB Stopping Solution 5 ZALECENIA DLA UŻYTKOWNIKA Kontrola dodatnia I (ludzka) pod względem przeciwciał IgM anty-ebv-vca, ujemna pod względem HBs Ag i przeciwciał anty-hcv, anty-hiv-1 i anty-hiv-2. Konserwant: azydek sodu (<0.1%) i pen/strep (0.01%) Kontrola dodatnia II (ludzka) dodatnia pod względem przeciwciał IgM anty-ebv-vca, ujemna pod względem HBs Ag i przeciwciał anty-hcv, anty-hiv-1 i anty-hiv-2. Konserwant: azydek sodu (<0.1%) i pen/strep (0.01%) Kalibrator (ludzki) dla przeciwciał IgM anty-ebv-vca, ze swoistym dla zestawu czynnikiem, oznaczonym na etykiecie zewnętrznej, ujemny pod względem HBs Ag i przeciwciał anty-hcv, anty-hiv-1 i anty-hiv-2. Konserwant: azydek sodu (<0.1%) i pen/strep (0.01%) Koniugat (gotowy do użycia): Kozie przeciwciała przeciwko ludzkim IgM, skoniugowane z peroksydazą chrzanową Konserwant: ProClin 300 (0.1%) i gentamycyna. Rozcieńczalnik II: gotowy do użycia bufor (ph 7.5) z białkowymi stabilizatorami. Zawiera kozie/owcze przeciwciała przeciwko ludzkim IgG w celu zaadsorbowania i usunięcia kompetycyjnych IgG. Konserwant: 0.1% ProClin 300 Substrat-chromogen (gotowy do użycia): Czterometylobenzydyna (TMB) Nie używany odczynnik musi być szczelnie zamknięty; w przeciwnym razie w studzienkach powstanie osad. Roztwór zatrzymujący (gotowy do użycia): 1 N kwas siarkowy Instrukcja użytkownika 1 x 0.4 ml 1 x 0.4 ml 1 x 0.4 ml 1 x 16 ml 2 x 45 ml 1 x 15 ml 1 x 15 ml 1 szt. Zalecenia Uzyskanie prawidłowego wyniku zależy od przestrzegania zasad Dobrej Praktyki Laboratoryjnej: Nie używać odczynników po upływie terminu przydatności. Podczas jednego oznaczenia używać wyłącznie odczynników o tym samym numerze serii. UWAGA: Podczas danego oznaczenia można wymiennie używać następujących odczynników, lecz w jednym teście powinny być one z tej samej serii: roztwór płuczący (R2), substrat/ chromogen (R9) oraz roztwór zatrzymujący (R10). Odczynników tych można używać wspólnie z testami Bio-Rad: Platelia EBV-VCA IgG, Platelia EB-NA-1 IgG i Platelia EBV-EA-D IgG; dalszych informacji udzieli nasz serwis techniczny. 3

Przed użyciem przenieść odczynniki w celu stabilizacji na 30 minut do temp. pokojowej. Unikać zanieczyszczenia podczas rekonstytucji odczynników. Nie wykonywać testu w obecności kurzu ani reaktywnych par związków zasadowych, kwasów i aldehydów, które mogą wpływać na aktywność enzymatyczną koniugatu. Używać szkła dokładnie umytego i przepłukanego wodą destylowaną, lub, co jest wskazane, materiałów jednorazowych. Nie dopuszczać do wysuszenia mikropłytki pomiędzy etapem płukania a dodawaniem kolejnego odczynnika. Reakcja enzymatyczna jest bardzo wrażliwa na działanie metali i jonów metali. Należy unikać kontaktu elementów metalowych z roztworami zawierającymi koniugat lub substrat. Roztwór chromogen/substrat powinien być bezbarwny. Wystąpienie barwy świadczy o nie przydatności roztworu do użycia. Do każdej badanej próbki zmieniać końcówkę pipety. Płukanie studzienek jest istotnym etapem oznaczenia; należy przestrzegać przewidzianych cykli płukania, oraz zwracać uwagę, czy studzienki są prawidłowo napełniane i całkowicie opróżniane. Nieprawidłowe płukanie jest przyczyną fałszywych wyników. Nigdy nie używać tego samego pojemnika na koniugat i roztwór substrat/chromogen. Sprawdzać, czy pipety i sprzęt są prawidłowo nastawione oraz, czy aparatura prawidłowo pracuje. Nie wprowadzać zmian do procedury oznaczenia. HIGIENA I BEZPIECZEŃSTWO PRACY Odczynniki przeznaczone wyłącznie do diagnostyki in vitro. Podczas pracy z odczynnikami należy używać rękawiczek jednorazowych. Nie pipetować ustami. Ludzkie surowice używane do przygotowania odczynników były ujemne pod względem antygenu powierzchniowego wirusa hepatitis B (HBs Ag), przeciwciał przeciwko wirusowi hepatitis C (anty- HCV) oraz przeciwciał przeciwko ludzkim wirusom niedoboru odporności HIV-1 i HIV-2. Ponieważ nie ma metod absolutnie wykluczających obecność czynników zakaźnych, odczynniki pochodzące z materiału ludzkiego powinny być traktowane jako materiał potencjalnie zakaźny. Materiały mające kontakt z próbkami lub odczynnikami pochodzenia ludzkiego, w tym także zużyty roztwór płuczący, należy traktować jako materiał zakaźny. Unikać rozlania próbek i odczynników je zawierających. W przypadku rozlania zmyć 10% roztworem podchlorynu sodu. W przypadku rozlania kwasu należy go najpierw zneutralizować dwuwęglanem sodu, wytrzeć i dopiero zmyć powierzchnię 10% roztworem podchlorynu i osuszyć bibułą. Materiał używany do czyszczenia wyrzucić do pojemnika na odpady. Próbki, materiały i produkty zanieczyszczone materiałem biologicznym zawsze należy dekontaminować przed wyrzuceniem. - przez moczenie w 5% podchlorynie sodu przez 30 minut, - lub autoklawowanie w temp. 121 C przez co najmniej 2 godziny Autoklawowanie przez co najmniej godzinę w temp. 121 C jest najlepszą metodą inaktywacji wirusów HIV i wirusa zapalenia wątroby typu B. UWAGA: NIE AUTOKLAWOWAĆ ROZTWORÓW ZAWIERAJĄCYCH PODCHLORYN. Z odczynnikami chemicznymi należy pracować i utylizować je zgodnie z zasadami Dobrej Praktyki Laboratoryjnej. Unikać kontaktu substratu/chromogenu oraz roztworu zatrzymującego ze skórą i błonami śluzowymi, ze względu na możliwość zatrucia, podrażnienia lub oparzenia. Niektóre odczynniki zawierają azydek sodu jako konserwant. Związek ten może reagować z miedzią i ołowiem w kanalizacji, tworząc wybuchowe azydki metali. Aby zapobiec gromadzeniu się azydków w rurach, po wylaniu inaktywowanych odczynników do zlewu należy spłukać dużą ilością wody. Karta charakterystyki substancji jest dostępna na życzenie. Uwaga: Niektóre odczynniki zawierają ProClin 300 < 1,5% R43: W przypadku kontaktu ze skórą może wywołać uczulenie S28-37: W przypadku kontaktu ze skórą, należy natychmiast przemyć miejsce kontaktu wodą i mydłem. Używać odpowiednich rękawic Xi - Środek drażniący 4

6 INNE NIEZBĘDNE MATERIAŁY I SPRZĘT Worteks Czytnik mikropłytek* z filtrami 450 nm Pojemnik na materiał zakaźny i zanieczyszczone odpady Podchloryn sodu (wybielacz) i dwuwęglan sodu Jałowa woda destylowana lub dejonizowana Cylindry miarowe Rękawiczki jednorazowe Okulary ochronne Bibuła Pipety lub multipipety automatyczne lub półautomatyczne, regulowane lub o stałej pojemności, pobierające 10 μl, 100 μl i1000 μl. Płuczka mikropłytek: manualna, półautomatyczna lub automatyczna * Próbówki jednorazowe * Informacji w sprawie wyposażenia w sprzęt udzieli serwis techniczny Bio-Rad 7 PRZYGOTOWANIE I PRZECHOWYWANIE ODCZYNNIKÓW Zestaw należy przechowywać w temp. +2-8 C zgodnie z datą ważności wydrukowana na opakowaniu (z wyjątkiem specjalnych instrukcji). Przed użyciem przenieść odczynniki w celu stabilizacji na 30 minut do temp. pokojowej (+21-25 C). Po użyciu, odczynniki od razu schować do lodówki. 1) Odczynniki gotowe do użycia Odczynnik 1 (R1): mikropłytka Każda płytka zawierająca 12 pasków jest zapakowana oddzielnie w foliową torebkę. Należy ją przeciąć na wysokości 0.5 1 cm ponad linią i wyjąć potrzebną liczbę pasków. Pozostałe paski szczelnie zamknąć i przechowywać w temp. +2-8 C. Po otwarciu oryginalnego opakowania studzienki mikropłytek zachowują zdolność reakcyjną przez 1 miesiąc w temp. 2-8 C, przechowywane w szczelnie zamkniętej torebce. Odczynnik 3 (R3): kontrola ujemna Odczynnik 4a (R4a): kontrola dodatnia I Odczynnik 4b (R4b): kontrola dodatnia II Odczynnik 5 (R5): kalibrator Odczynnik 6 (R6): koniugat Odczynnik 7 (R7): rozcieńczalnik II Odczynnik 9 (R9): roztwór substrat / chromogen Odczynnik 10 (R10): roztwór zatrzymujący 2) Odczynniki do rekonstytucji: Odczynnik 2 (R2): roztwór płuczący stężony 20x 50 ml stężonego 20x roztworu rozcieńczyć w 1.0 l wody destylowanej lub dejonizowanej, wymieszać. Rozcieńczony roztwór do płukania można przechowywać 5 dni w temp. +2-8 C. 8 PRÓBKI Próbki krwi należy pobierać zgodnie z rutynową procedurą. Oznaczenie powinno być wykonane z nie rozcieńczonej surowicy. Jak najszybciej należy oddzielić surowicę od skrzepu lub czerwonych krwinek, aby uniknąć hemolizy. Silna hemoliza może wpływać na wynik testu. Próbki z widocznymi cząstkami organicznymi należy odwirować przed oznaczeniem. Cząstki lub agregaty fibryny w próbce mogą być przyczyną fałszywie dodatnich wyników. Jeśli test będzie wykonany w ciągu 5 dni, próbki można przechować w temperaturze +2-8 C. Jeśli test będzie wykonany później, należy je zamrozić w temp. -20 C na kilka miesięcy. Unikać powtórnego odmrażania/zamrażania. Do transportu próbki (najlepiej zamrożone) należy zapakować zgodnie z przepisami określającymi zasady przewożenia materiałów zakaźnych. NIE UŻYWAĆ PRÓBEK ZANIECZYSZCZONYCH, SILNIE LIPEMICZNYCH, ŻÓŁTACZKOWYCH, ZHEMOLIZOWANYCH I ZINAKTYWOWANYCH TERMICZNIE. 5

9 PROCEDURA OZNACZENIA Należy postępować dokładnie wg opisanej procedury. Podczas każdego testu używać kalibratora i surowic wzorcowych, co zapewni walidację testu. Przestrzegać zasad Dobrej Praktyki Laboratoryjnej. 1. Zanotować rozkład nanoszenia próbek i kontroli. 2. Przygotować rozcieńczony roztwór płuczący R2 (patrz p.7). 3. Wyjąć potrzebną liczbę pasków (R1), pozostałe zamknąć ponownie w oryginalnym opakowaniu. Paski do testu umieścić w ramce mikropłytki. Pozostawić 1 studzienkę na ślepą próbę, 3 na kalibrator, i po 1 na każdą z kontroli: ujemną, dodatnią I i dodatnią II. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A B1 S2 B R3 S3 C R4a S4 D R4b S5 E R5 S6 F R5 S7 G R5 S8 H S1 S9 4. Wszystkie próbki, kontrole i kalibrator przed naniesieniem wymieszać na worteksie Rozcieńczyć badane próbki, kalibrator i kontrole 1:81, (np. 10 μl + 800 μl) w rozcieńczalniku próbek II (R7), w próbówce lub na płytce do rozcieńczeń. 5. Do studzienek nanieść po 100 μl rozcieńczonych kontroli R3, R4a i R4b, kalibratora R5 oraz rozcieńczonych badanych próbek. Do pierwszej studzienki nanieść 100 μl rozcieńczalnika II (R7) jako ślepą próbę. 6. Inkubować mikropłytkę w temp. pokojowej (21-25 C) przez 30 ± 2 minuty. 7. Zaaspirować zawartość studzienek (do pojemnika z podchlorynem sodu). Wykonać 5 cykli płukania za pomocą 300 μl roztworu płuczącego i osuszyć odwróconą mikropłytkę na bibule. 8. Do wszystkich studzienek nanieść po 100 μl gotowego do użycia koniugatu (R6). 9. Inkubować mikropłytkę w temp. pokojowej (21-25 C) przez 30 minut ± 2 minuty. 10. Zaaspirować zawartość studzienek (do pojemnika z podchlorynem sodu). Wykonać 5 cykli płukania za pomocą 300 μl roztworu płuczącego i osuszyć odwróconą mikropłytkę na bibule. 11. Do wszystkich studzienek szybko nanieść po 100 μl roztworu chromogenu/substratu (R9). 12. Pozostawić reakcję w ciemności na 10 minut (± 2 minuty) w temp. pokojowej (21-25 C). Nie zakrywać folią adhezyjną. Studzienki zawierające przeciwciała IgM anty-ebv-vca zmienią barwę na niebieską. 13. Zatrzymać reakcję enzymatyczną przez dodanie do każdej studzienki 100 μl roztworu zatrzymującego. O zatrzymaniu reakcji świadczy zmiana barwy studzienek z niebieskiej na żółtą. 14. Odczekać co najmniej 5 minut i odczytać wyniki. Wytrzeć spód mikropłytki i w ciągu 30 minut od zatrzymania reakcji zmierzyć gęstość optyczną (OD) każdej studzienki w czytniku mikropłytek, przy długości fali 450 nm, wobec ślepej próby. (przed odczytem chronić płytkę przed światłem) 15. Przed opisem wyników sprawdzić zgodność kolejności odczytu z ustalonym na początku rozkładem studzienek, oraz zgodność pomiędzy odczytem spektrofotometrycznym a wizualnym. 10 OBLICZENIE I INTERPRETACJA WYNIKÓW 1. Obliczenie średniej absorbancji 1. Średnia wartość OD (gęstość optyczna) kalibratora cut-off: Obliczyć średnią dla trzech wartości uzyskanych dla kalibratora R5. Jeśli jedna z wartości odbiega od pozostałych o ponad 15%, należy ja pominąć i obliczyć średnią z dwóch pozostałych. 2. Współczynnik korekcji: współczynnik przypisany do każdej serii odczynników, stosowany jest w celu uwzględnienia codziennej zmienności temperatury pokojowej i czasu trwania poszczególnych etapów. Wartość współczynnika jest podana na etykiecie kalibratora. 3. Wartość OD kalibratora cut-off: Dla każdego oznaczenia wartość ta wynika z pomnożenia czynnika korekcji przez średnią OD kalibratora cut-off, obliczona w p.1. 6

4. Wartość ISR: Obliczenie współczynnika statusu immunologicznego (Immune Status Ratio) dla każdej próbki przez podzielenie wartości OD próbki przez wartość OD kalibratora cut-off, obliczona w p. 3. Przykład: Wartości OD uzyskane dla kalibratora = 0.380, 0.400, 0.420 Średnia OD dla kalibratora = 0.400 Czynnik korekcji = 0.5 Wartość cut-off kalibratora = 0.5 x 0.400 = 0.200 OD próbki = 0.600 Wartość ISR = 0.600 / 0.200 = 3.00 2. Walidacja testu 1. Ślepa próba (odczyt wobec powietrza): przy 450 nm OD < 0.150: OD RB < 0.150 2. Kontrola ujemna R3 (odczyt wobec ślepej próby): przy 450 nm OD R3 0.250 3. Każdy kalibrator R5 (odczyt wobec ślepej próby): przy 450 nm OD R5 0.250 4. Kontrola dodatnia R4b (odczyt wobec ślepej próby): przy 450 nm OD R5 0.500 5. Wartość ISR dla kontroli ujemnej, kontroli dodatniej I i kontroli dodatniej II powinna mieścić się w zakresie podanym na fiolce. Jeśli nie spełnione są kryteria kontroli jakości, uzyskane wartości wykraczają poza podane zakresy, test należy powtórzyć. 3. Interpretacja wyników Wartość ISR (współczynnik statusu immunologicznego) należy interpretować następująco: Wartość Wynik Interpretacja 0.90 Ujemny Niewykrywalne przeciwciała IgM anty-ebv-vca 0.91 1.09 Wątpliwy Próbki należy oznaczyć powtórnie 1.10 Dodatni Znamienne miano przeciwciał IgM anty-ebv-vca. Wskazuje na aktualne lub niedawne zakażenie. 1. Zalecane wyrażenie uzyskanego wyniku: W teście Platelia EBV-VCA IgM uzyskano następujący wynik: Nie można zamiennie przyjmować wartości uzyskanych inną metodą. Określona wartość uzyskana dla przeciwciał IgM nie może być uznawana za miano przeciwciał. 2. Diagnostyka zakażenia EBV, w celu uzyskania pełnego obrazu zakażenia, obejmuje analizę wyników uzyskanych dla czterech rodzajów przeciwciał: IgG przeciwko antygenowi jądrowemu (EB- NA), IgG przeciwko wczesnemu antygenowi (EBV-EA), IgG i IgM przeciwko antygenowi kapsydu (EBV-VCA). Właściwa diagnostyka zakażenia EBV opiera się na czterech powyższych testu, i zwyczajowo nie powinna bazować na wyniku pojedynczego oznaczenia. 3. Próbki dla których mimo powtórzenia oznaczenia uzyskano wynik wątpliwy, należy oznaczyć inną metodą, np. immunofluorescencyjną (IFA). Jeśli wynik nadal jest niejednoznaczny, należy pobrać i oznaczyć kolejną próbkę. 4. Wartości oczekiwane Ostre zakażenie Poziom przeciwciał IgM anty-ebv-vca wzrasta gwałtownie w ostrej fazie zakażenia i przeciwciała te są wykrywalne przed lub równocześnie z IgG anty-ebv-vca, IgM anty-eb-na-1 oraz z przeciwciałami heterofilnymi. Poziom IgM anty-ebv-vca spada w późnej fazie zakażenia, gdy nadal utrzymują się przeciwciała IgM anty-eb-na-1 i IgG anty-ebv-vca. Faza przejściowa Poziom przeciwciał IgM anty-ebv-vca spada do poziomu niskiego i mniej więcej odpowiadającego poziomowi przeciwciał IgG anty-eb-na-1, który zaczyna rosnąć. Utrzymują się przeciwciała IgG anty- EBV-VCA. Faza rekonwalescencji Poziom przeciwciał IgM anty-ebv-vca jest bardzo niski do ujemnego przy wysokim wzroście poziomu przeciwciał IgG anty-eb-na-1. 7

5. Prewalencja W teście Platelia EBV-VCA IgM oznaczano 158 surowic od osób z normalnej populacji, w różnym wieku, płci i z różnych regionów geograficznych USA. Wynik dodatni uzyskano dla 2.5% próbek, natomiast wynik wątpliwy dla 1.9% próbek. Rozkład wartości ISR uzyskanych w tym badaniu przedstawia diagram poniżej. Rozkład wartości ISR w populacji normalnej (n=158) W tabeli przedstawiono rozkład wyników w grupach wiekowych: WYNIK WIEK Ujemny Wątpliwy Dodatni Ogółem 20 8 3 0 11 21 30 47 0 1 48 31 40 48 0 3 51 41 50 29 0 0 29 51-60 19 0 0 19 Ogółem 151 3 4 158 6. Ograniczenia metody 1. Postępowanie niezgodne z opisana procedurą może spowodować uzyskanie wyników wątpliwych. Wyniki nie interpretacyjne mogą być spowodowane: - Niedostatecznym płukaniem mikropłytki - Niewłaściwym czasem inkubacji 8

- Zanieczyszczeniem próbek ujemnych próbkami dodatnimi - Zanieczyszczeniem roztworu substratu/chromogenu czynnikami utleniającymi (wybielacz, jony metali..) - Zanieczyszczeniem roztworu zatrzymującego Dla surowic zanieczyszczonych, żółtaczkowych, lipemicznych, zhemolizowanych lub inaktywowanych termicznie można uzyskać fałszywe wyniki; oznaczenie należy powtórzyć. Właściwości testu nie zostały ustalone dla próbek innych niż surowica. 2. Wynik testu należy interpretować w świetle objawów klinicznych i wyników innych testów laboratoryjnych. Test jest przeznaczony, przede wszystkim, do oznaczania statusu immunologicznego w celu różnicowania pierwotnego zakażania i reaktywacji. Nie badano właściwości testu dla próbek od pacjentów z rakiem jamy nosowo-gardłowej, chłoniakiem Burkitta, z innymi stanami uogólnionego powiększenia węzłów chłonnych, związanymi z zakażeniem EBV, oraz z innymi chorobami poza mononukleozą zakaźną, związanymi z zakażeniem EBV. Wynik uzyskany w teście Platelia EBV-VCA IgM dla pacjentów podlegających immunosupresji należy interpretować ostrożnie. Właściwości testu nie badano dla populacji dziecięcej. Brak wykrywalnego poziomu przeciwciał IgM anty-ebv-vca nie wyklucza niedawnego lub aktualnego zakażenia. Próbka może być pobrana przed wzrostem poziomu przeciwciał lub na etapie ich zanikania. Przy dalszym podejrzeniu zakażenia wirusem EB należy pobrać kolejną próbkę po 5-7 dniach. Często jednakże, na etapie prezentacji, zmniejsza się stężenie przeciwciał klasy IgM. Swoiste IgG mogą konkurować z IgM o miejsce wiązania, co może prowadzić do wyniku fałszywie ujemnego. I odwortnie, czynnik reumatoidalny w obecności swoistych IgG jest odpowiedzialny za wyniki fałszywie dodatnie. Zastosowane kozie/baranie immunoglobuliny przeciwko ludzkim IgG, w rozcieńczalniku surowicy (Serum Diluent Plus), ograniczają wiązanie swoistych IgG i minimalizują interferencję czynnika reumatoidalnego. Wyniki fałszywie dodatnie w testach ELISA mogą powodować niektóre autoprzeciwciała przeciwjądrowe. 11 CHARAKTERYSTYKA TESTU 1. Względna czułość i swoistość dla próbek surowicy Właściwości testu Platelia EBV-VCA IgM określono, oznaczając w laboratorium klinicznym 166 wybranych próbek surowicy. Próbki były sklasyfikowane jako seronegatywne (brak serologicznych dowodów na obecne lub minione zakażenie EBV), pobrane w ostrej fazie (obecne IgM anty-ebv-vca i przeciwciała heterofilne, przy braku IgG anty-eb-na), i seropozytywne (obecność IgG anty-ebv-vca i IgG anty-eb-na, przy braku IgM anty-ebv-vca i przeciwciał heterofilnych, co świadczy o przebytym zakażeniu). Próbki były oznaczone przy pomocy komercyjnych testów ELISA; porównywano czułość, swoistość i zgodność wyników uzyskanych następnie w teście Platelia EBV-VCA IgM. Zakładano, iż wynik ujemny EBV_VCA IgM powinny dawać próbki seronegatywne i próbki z okresu rekonwalescencji, natomiast wyniku dodatniego oczekiwano dla próbek pobranych w ostrej fazie zakażenia. Uzyskano następujące wyniki (tabela poniżej): Platelia EBV-VCA IgM Dodatnie Wątpliwe Ujemne Ogółem Ostra faza EBV-VCA IgM+ EB-NA IgG- Heterofilne+ 37 1 1 39 Seropozytywne EBV-VCA IgG+ EB-NA IgG+ EBV-VCA IgM- Heterofilne- 1 0 98 99 Seronegatywne EBV-VCA IgG- EB-NA IgG- EBV-VCA IgM- Heterofilne- 1 0 27 28 9

Względna czułość (ostra faza) = 37/38 = 97.4% 95% przedział ufności = 92.2% - 100% Względna swoistość (seronegatywne) = 27/28 = 96.4% 95% przedział ufności = 89.4% - 100% Względna swoistość (seropozytywne) = 98/99 = 99.0% 95% przedział ufności = 97.0% - 100% Względna zgodność = 162/165 = 98.2% 95% przedział ufności = 96.1% - 100% Podczas obliczeń nie uwzględniono wyników wątpliwych. Próbek tych nie oznaczano ponownie. Zostały one ostatecznie sklasyfikowane jako wątpliwe. Przedział ufności 95% został obliczony przyjmując normalny (symetryczny) rozkład wartości. Określenie względne odnosi się do porównania wyników dla omawianego testu wyników z wynikami uzyskanymi w podobnym teście. Nie było zamierzonym określenie korelacji wyniku testu z występowaniem lub brakiem zakażenia. Na podstawie zgodności wyników obu testów nie można wnioskować o występującej chorobie. 2. Powtarzalność (zgodność wewnątrz-testowa) Powtarzalność wewnątrz-testową dla testu Platelia EBV-VCA IgM określono oznaczając 3 próbki surowicy 10 razy na tej samej płytce. Średnią wartość ISR, odchylenie standardowe (SD) oraz procentowy współczynnik zmienności (%CV) dla każdej z próbek przedstawia tabela poniżej: Surowica n X S.D. CV% Ujemna 10 0.06 0.03 54 Nisko dodatnia 10 1.71 0.16 9.2 Dodatnia 10 4.15 0.21 5.1 X S.D. C.V. = średnia wartość ISR = odchylenie standardowe = współczynnik zmienności 3. Odtwarzalność (zgodność pomiędzy-testowa) Odtwarzalność pomiędzy-testową dla testu Platelia EBV-VCA IgM określono oznaczając 3 próbki 10 razy każdą, przez 3 dni. Średnią wartość ISR, odchylenie standardowe (SD) oraz procentowy współczynnik zmienności (%CV) dla każdej z próbek przedstawia tabela: Surowica n X S.D. CV% Ujemna 30 0.05 0.03 65.6 Nisko dodatnia 30 1.61 0.2 12.1 Dodatnia 30 4.47 0.42 10.6 X S.D. C.V. = średnia wartość ISR = odchylenie standardowe = współczynnik zmienności 4. Reakcje krzyżowe Oznaczono próbki dodatnie w komercyjnych testach ELISA pod względem obecności przeciwciał klasy IgM przeciwko wirusom Herpes Simplex 1 i 2, wirusowi cytomegalii i wirusowi Varicella-Zoster. Przebadano także próbki dodatnie pod względem obecności czynnika reumatoidalnego. Dane zebrane w tabeli pokazują, przeciwciała przeciwko innym herpeswirusom ani surowice z czynnikiem reumatoidalnym nie reagują krzyżowo w teście Platelia EBV-VCA IgM. 10

Surowica Platelia EBV-VCA IgM Inny test RF+ 0.04-1.87 + RF+ 0.03-1.82 + RF+ 0.01-1.73 + RF+ 0.01-1.80 + RF+ 0.02-1.85 + VZV IgM+ 0.33-3.28 + VZV IgM+ 0.10-5.46 + VZV IgM+ 0.04-4.98 + VZV IgM+ 0.08-2.34 + VZV IgM+ 0.03-2.18 + HSV 1 IgM+ 0.02-2.53 + HSV 1 IgM+ 0.02-1.65 + HSV 1 IgM+ 0.01-1.34 + HSV 1 IgM+ 0.01-1.32 + HSV 2 IgM+ 0.06-1.76 + HSV 2 IgM+ 0.05-1.60 + HSV 2 IgM+ 0,03-2.09 + HSV 2 IgM+ 0.04-1.96 + CMV IgM+ 0.07-1.23 + CMV IgM+ 0.04-1.92 + CMV IgM+ 0.04-3.83 + CMV IgM+ 0.06-1.32 + 12 LITERATURA 1. Epstein, M.A., B.B. Achong, and Y.M. Barr. 1964. Virus Particles in Cultured Lymphoblasts from Burkitt s Lymphoma. Lancet. 1:702-703. 3. Epstein, M.A., Y.M. Barr, and B.G Achong. 1965. Studies wilth Burkitt s Lymphoma. Wister Inst. Sympos. Monogr. 4:69-82. 4. Schooley, R.T. and R. Dolin. 1985. Epstein-Barr Virus (Infectious Mono-nucleosis), 2 nd edition. In: Principles and Practices of Infectious Diseases. Mandell, G.L., R.G.Douglas, and J.E. Bennett, eds. John Wiley and Sons, New York. Pp.97-982. 5. Henle, W. and Henle G. Epstein-Barr Virus and Infectious Mononucleosis. Human Herpesvirus Infections. Glaser and Gottlieb-Stematsky, eds. Marcel Dekker, Inc. NR. Basel. 1982. 6. Tobi, M. and S.E. Straus. 1985. Chronic Epstein-Barr Virus Diseas: A Workshop Held by the National Institute of Allergy and Infectious Diseases. Ann. Intern. Med. 103 (6(pt. 1)):951-953. 7. Birx, D. L., R.R. Redfield, and G. Tosarto. 1986. Defective Regulation of Epstein-Barr Virus Infection in Patients with Aquired Immunodefiency Syndrome (AIDS) or AIDSRelated Disorders. New Eng. J. Med. 314 (14):874-879. 8. Gottlieb-Sematsky, T. and Glaser, R. 1982. Assocation of Epstein-Barr Virus with Neurological Diseases. Human Herpesvirus Infections. Glaser and Gottlieb-Sematsky, eds. Marcel Dekker, Inc., NR. Basel. 9. Henle, G., W. Henle and V. Diehl. 1968. Relation of Burkitt s Tumor-Associated Herpes-Type Virus to Infectious Mononucleosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 59:94-101. 10. Henle G., and W. Henle. 1978. The Virus as the Etiologic Agent of Infectious Mononucleosis. In: The Epstein-Barr Virus. Berlin Sprihger-Verlag. Pp297-320. 11. Sumaya, C.V. 1986. Infectious Mononucleosis and Other EBV Infections: Diagnostic Factors. Lab. Mgmt. Oct., pp37-46. 11

12. Lenelle, E.T. and W. Henle. 1987. Epstein-Barr Virus Infections: Clinical and Serological Features. Laboratory Mgmt. Oct., pp37-46. 13. Nikoskelainen, J. and P. Hanninen. 1975. Antibody Response to Epstein-Barr Virus in Infectious Mononucleosis. Infect. Immun. 11:42-51. 14. Sumaya, C.V. 1987. Infectious Mononucleosis and other EBV Infections: Diagnostic Factors. Laboratory Management. pp37-45. 15. Henle, W. and G. Henle. 1973. Epstein-Barr Virus and Infectious Mononucleosis. New Eng. J. Med. 228:263-264. 16. Engvall, E. and P. Perlman. 1972. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA. III. Quantitation of Specific Antibodies by Enzyme-Labeled Anti-Immunoglobulins in Antigen Coated Tubes. J. Immunol. 109:129-135. 17. Van Weeman, B.K. and A.H.W.M. Schuurs. 1971. Immunoassay Using Antigen-Enzyme Conjugates. FEBS Letter. 15:232-235. 18. Engvall, E., and P. Perlman. 1971. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, (ELISA) Quantitative Assay of Immunoglobulin G. Immunochemistry. 8:871-874. 19. Engvall, E. and P. Perlman. 1971. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA. In: Proteins of the Biological Fluids, H. Peeters, ed., Proceedings of the Nineteenth Colloquium, Brugge Oxford. Pergamon Press. p. 553-556. 20. Engvall, E., K. Jonsson, and P. Perlman. 1971. Enzyme- Linked Immunosorbent Assay. II. Quantitative Assay of Protein Antigen, Immunoglobulin-G, By Means of Enzyme-Labelled Antigen and Antibody-Coated Tubes. Biochem. Biophys. Acta., 251:427-434. 21. CDC/NIH Interagency Working Group. 1993. BioSafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. 3rd edition. U.S. Dept. of Health and Human Services, Public Health Service. pp18-24. 22..Drew, W.L. 1983. Diag. Med. 6:61-66. 23. Lennete, E.T. Manual of Clinical Microbiology. 5th ed. Chapter 78. 24. Okano, M. 1988. Clinical Microbiology Reviews. Epstein-Barr Virus and Human Diseases. Recent Advances in Diagnosis. Vol.1, p300-312. 25. Baltz, M. 1992. Identifying Stages of EBV Infection. In: American Clinical Lab. pp. 20-22. 26. Ambinder, R.F., Mullen, M., Chang, Yung-Nien, Hayward, G.S., and Hayward, S.D. 1991. Functional Domains of Epstein-Barr Virus Nuclear Antigen EBNA-1. Journal of Virology, ASM. Vol. 65, No.3, pp. 1466-1478. 27. Davidsohn, I. 1937. Serologic Testing of Infectious Mononucleosis. Journal of American Medical Association. 183: 289-295. 28. Evans, A.S. 1974. History of Infectious Mononucleosis. In: American Journal of Medical Science. 267: 189-195. 29. Lennette, E.T. 1988. Herpesviridae: Epstein-Barr Virus. In: Laboratory Diagnosis of Infectious Diseases, Principles and Practice. Vol. II. Lennette, E.H., Halonen, P., Murphy, F.A., eds. Springer-Verlag, NY. pp. 230-246. 30. Bakerman, S. 1980. Enzyme Immunoassays. Lab. Mgmt. August, pp 21-29. 31. Voller, A. and D. E. Bidwell, 1972. Brit. J. Exp. Pathology 56 :338-339. 32. R. Sohier, R.J. Freund, G. de-thé, N.E. Day, A. Geser and G. Denhaut. 1973. Seroepidemiology of Herpesvirus Type Epstein-Barr in Blood Donors from Communities around Lyon. American Journal of Epidemiology. Vol. 99, No.6, pp 414-424. 12

CE marking (European directive 98/79/CE on in vitro diagnostic medical devices) Znak CE (Dyrektywa Parlamentu Europejskiego i Rady nr 98/79/CE o wyrobach diagnozy medycznej in vitro) For in vitro diagnostic use Wyrób do diagnostyki in vitro Catalogue number Numer katalogowy Manufacturer Wytwórca Authorised Representative Autoryzowany przedstawiciel Batch code Kod partii Expiry date YYYY/MM/DD U y przed RRRR/MM/DD Storage temperature limitation Przestrzega zakresu temperatur Consult Instruction for use Sprawd w instrukcji obsługi TRINITY BIOTECH, Jamestown NY 14702-1059 - USA TRINITY BIOTECH, Bray, Co. Wicklow - IRELAND DISTR. Bio-Rad 3, Bd Raymond Poincaré 92430 Marnes-la-Coquette France Tél. : 33 (0) 1 47 95 60 00 Fax.: 33 (0) 1 47 41 91 33 07/2008 13