MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2008, 60: 91-99 Monika Brzychczy-Włoch 1, Magdalena Strus 1, Dorota Pawlik 2, Tomasz Gosiewski 1, Krzysztof Rytlewski 3, Artur Drzewiecki 1, Ryszard Lauterbach 2, Piotr B. Heczko 1 OCENA MOŻLIWOŚCI ZASTOSOWANIA METOD MOLEKULARNYCH DO DIAGNOSTYKI NOSICIELSTWA ORAZ ANALIZY PODOBIEŃSTWA IZOLATÓW STREPTOCOCCUS AGALACTIAE * 1 Katedra Mikrobiologii Collegium Medicum UJ Kraków Kierownik: Prof. dr hab. med. P. B. Heczko 2 Katedra Ginekologii i Położnictwa, Klinika Neonatologii Collegium Medicum UJ Kraków Kierownik: Prof. dr hab. med. R. Lauterbach 3 Katedra Ginekologii i Położnictwa, Klinika Ginekologii, Położnictwa i Onkologii Collegium Medicum UJ Kraków Kierownik: Prof. dr hab. med. Ai Basta Potwierdzono, że metody PCR i FISH mogą być skutecznie wykorzystywane w szybkiej diagnostyce S. agalactiae (GBS) w materiałach pobranych z przedsionka pochwy ciężarnych. Dzięki metodzie RAPD wykazano, że dzieci urodzone przez kobiety skolonizowane szczepami GBS, ulegały kolonizacji szczepami matczynymi bez względu na rodzaj i przebieg porodu. Ponadto, wykryto kolonizację S. agalactiae u dzieci urodzonych przez matki nieskolonizowane GBS w wyniku przeniesienia szczepów w środowisku szpitalnym. Przy użyciu metody PCR-multiplex wykazano obecność genów oporności na erytromycynę (erma, ermb, ermc) u izolatów z fenotypowo potwierdzonym mechanizmem oporności typu MLS B. Zalecenia Center for Disease Control and Prevention (CDC) dotyczące sposobu wykrywania kolonizacji ciężarnych przez Streptococcus agalactiae (Group B Streptococcus, GBS) obejmują konieczność wykonywania badań przesiewowych w kierunku obecności GBS wśród wszystkich kobiet powyżej 35 tygodnia ciąży, a także pobieranie próbek materiału z dwóch miejsc równolegle, to jest z pochwy i odbytu oraz ich preinkubację w odpowiednim podłożu namnażającym (12). W Polsce najbardziej dotychczas rozpowszechnioną metodą wykrywania nosicielstwa GBS jest bezpośrednia hodowla posiewu z wymazu na wzbogaconym podłożu agarowym z krwią, a następnie identyfikacja przy użyciu lateksowych testów aglutynacyjnych (8, 14). * Praca finansowana w ramach grantu numer 3PO5E08425 z Ministerstwa Nauki i Informatyzacji.
92 M. Brzychczy-Włoch i inni Nr 2 Metody tradycyjne oparte na hodowli są jednak czasochłonne, dlatego też prowadzi się badania nad możliwością zastosowania w diagnostyce GBS metod molekularnych, cechujących się znacznie większą czułością i skracających czas oczekiwania na wynik badania do zaledwie kilku godzin (1, 7). Z tego powodu, prowadząc badania nad nosicielstwem GBS u ciężarnych oparte na metodzie zalecanej przez CDC, a opisane w poprzedniej pracy (4), równolegle w wybranych przypadkach zastosowano także niektóre metody molekularne, zarówno do wykrywania nosicielstwa GBS jak i do prowadzenia analizy epidemiologicznej. W związku z tym w poniższej pracy dokonano: - oceny wartości metod PCR oraz FISH (fluorescencyjna hybrydyzacja in situ) zastosowanych do szybkiego wykrywania GBS w wymazach w porównaniu z metodą hodowli opartą na zaleceniach CDC. - analizy genotypowego podobieństwa pomiędzy izolatami GBS z zastosowaniem metody RAPD wykorzystanej do typowania epidemiologicznego. - wykazania obecności genów erm A, erm B, erm C kodujących oporność na erytromycynę u szczepów GBS z zastosowaniem metody PCR-multiplex. MATERIAŁ I METODY Materiałem do badań były wymazy z pochwy i odbytu pobrane w latach 2004-2006 w dniu porodu od 563 kobiet oraz wymazy z ucha i jamy ustnej noworodków. Materiały były diagnozowane w kierunku GBS metodą hodowli, a także przy użyciu metody PCR oraz techniki FISH. Badania metodą PCR z użyciem gatunkowo specyficznych starterów Sag59 i Sag190 (EUROGENTEC) przeprowadzono zgodnie z metodyką Ke i wsp. (7). Chromosomalne DNA izolowano przy użyciu kolumienkowego zestawu zgodnie z zaleceniami producenta (DNA Gdańsk). Typowa mieszanina reakcyjna zawierała: bufor do polimerazy (końcowe stężenia: 10 mm Tris HCl, ph 8,8; 50 mm KCl; 0.1% Triton X-100), 200 µm każdego dntp, 2,5 mm MgCl 2, 1µM starterów, 50 ng bakteryjnego DNA i 1U polimerazy Pwo - Delta2 (DNA Gdańsk). Program amplifikacji był następujący: 94 C przez 3min, następnie 40 cykli (95 C przez 1 sek, 55 C przez 30 sek i 72 C przez 2 min) oraz 72 C przez 5 min. Otrzymane produkty amplifikacji (153 pz) analizowano w 1% żelu agarozowym w obecności bromku etydyny (Bio-Rad). Badania metodą FISH z wykorzystaniem gatunkowo specyficznej sondy Saga 67 a/b (EUROGENTEC) zostały wykonane według zmodyfikowanej metody Artz i wsp. (1) oraz Harmsen i wsp. (6). Wacik z wymazem umieszczano w 1 ml NaCl i energicznie mieszano przez 1 min., a następnie zawiesinę wirowano przy 10 000 obrotów/minutę przez 5 min. Płyn znad osadu odrzucano, zaś osad rozprowadzano w 10 µl jałowej wody destylowanej. Następnie 10 µl zawiesiny nanoszono na powierzchnię specjalnego szkiełka mikroskopowego do hybrydyzacji SuperFrost Plus (Menzel-Glaser). Wyschnięty preparat zalewano 500 µl roztworu 4% paraformaldehydu (SIGMA) i umieszczano na okres 20 min w temp. 4 C. Całość przepłukiwano PBS (IITD, PAN) i zalewano 1 ml 96 % metanolu (POCh) na 15 min w temp. -20 C. Następnie przepłukiwano ciepłym (50 C) PBS i zalewano 20 µl rozcieńczonego roztworu lizozymu (8 mg/ml) z lizostafiną (1 mg/ml) (Bio-Rad). Całość inkubowano przez 3 min w temp 37 C, po czym dwukrotnie płukano ciepłym PBS. W celu
Nr 2 Molekularna diagnostyka nosicielstwa S. agalactiae 93 przeprowadzenia hybrydyzacji, mieszano 5 µl roztworu (50ng/µl) sondy Sag 67 a/b z 45 µl buforu do hybrydyzacji: 20 mm Tris HCl, ph 7,2 (SIGMA); 0,9 M NaCl (SERVA); 0,1 % SDS (SERVA) ogrzanego do temperatury około 50 C. Gotowy roztwór (50 µl) nanoszono na preparat i całość umieszczano w wilgotnej komorze na 1,5 godz. w temp. 56 C. Po dokładnym płukaniu wodą, preparat dobarwiano 50 µl roztworu DAPI (Sigma) (5 µl DAPI i 45 µl wody jałowej, destylowanej) przez 2 min w temp. pokojowej. Wybarwiony preparat dokładnie płukano i suszono w ciemności, a następnie oglądano w mikroskopie fluorescencyjnym BX51 (Olympus) wyposażonym w obiektyw immersyjny 100x z lampą UV oraz kamerę F-Viev. Uzyskany obraz analizowano przy użyciu programu komputerowego AnalySYS (Soft Imaging). W celu porównania liczb uzyskanych metodą FISH z populacjami GBS określanymi w jednostkach tworzących kolonie/ml, a tym samym wyznaczenia progu detekcji metody FISH, z pobranego od pacjentki materiału wykonywano posiew metodą dziesiętnych rozcieńczeń na stałe podłoże Columbia Blood Agar (Difco) z 5% krwią baranią, które inkubowano w 37 o C w warunkach tlenowych przez 24 godz. Analizę porównawczą szczepów GBS przeprowadzono posługując się metodą RAPD (losowa amplifikacja polimorficznych fragmentów DNA) z wykorzystaniem startera OPB17 (9). Metoda ta posłużyła do analizowania genotypowego podobieństwa pomiędzy wybranymi szczepami GBS pochodzącymi od matek i ich dzieci. Szczepy GBS przechowywane w temp. 70 o C, namnażano w bulionie zwykłym (Biocorp) w 37 C przez 24 godz. Chromosomalne DNA izolowano przy użyciu kolumienkowego zestawu zgodnie z zaleceniami producenta (DNA Gdańsk). Mieszanina reakcyjna zawierała: bufor do polimerazy (końcowe stężenia: 10 mm Tris HCl, ph 8,8; 50 mm KCl; 0,1% Triton X-100), 200 µm każdego dntp, 2,5 mm MgCl 2, 1 µm starterów, 50 ng bakteryjnego DNA i 2 U polimerazy Pwo Delta2 (DNA Gdańsk). Program amplifikacji był następujący: 94 C przez 5min, następnie 35 cykli (94 C przez 30 sek, 35 C przez 30 sek i 72 C przez 1 min) oraz 72 O C przez 5 min. Otrzymane produkty amplifikacji (200 4000 pz) analizowano w 1% żelu agarozowym w obecności bromku etydyny (Bio-Rad). Do porównawczej analizy pasków rozkładów elektroforetycznych zastosowano program Molecular Analyst (Bio-Rad). Oznaczenie genów oporności erma, ermb, ermc wykonano przy użyciu metody PCRmultiplex z odpowiednio dobranymi trzema parami zdegenerowanych starterów ErmA1, ErmA2, ErmB1, ErmB2; ErmC1, ErmC2 (13). Badaniu poddano szczepy GBS wyizolowane od matek i ich dzieci z fenotypowo wykazanym mechanizmem oporności typu MLS B. Szczepy przechowywane w temp. 70 o C, namnażano w bulionie zwykłym (Biocorp) w 37 C przez 24 godz. Chromosomalne DNA izolowano przy użyciu kolumienkowego zestawu zgodnie z zaleceniami producenta (DNA Gdańsk). Mieszanina reakcyjna zawierała: bufor do polimerazy (końcowe stężenia: 10 mm Tris HCl, ph 8,8; 50 mm KCl; 0,1% Triton X-100), 200 µm każdego dntp, 2,5 mm MgCl 2, 1 µm odpowiednich starterów, 50 ng bakteryjnego DNA i 1 U polimerazy Pwo Delta2 (DNA Gdańsk). Program amplifikacji był następujący: 93 C przez 3min, następnie 40 cykli (93 C przez 1 min, 52 C przez 1 min i 72 C przez 1 min) oraz 72 O C przez 5min. Otrzymane produkty amplifikacji analizowano w 1% żelu agarozowym w obecności bromku etydyny (Bio-Rad). Wynik badania uznawano za wiarygodny, jeśli na żelu agarozowym uzyskano przynajmniej jeden prążek, reprezentujący fragment genu: erma (645 pz) lub ermb (639 pz) lub ermc (642 pz).
94 M. Brzychczy-Włoch i inni Nr 2 WYNIKI I ICH OMÓWIENIE Potwierdzono, że metoda PCR może być skutecznie wykorzystywana w szybkiej diagnostyce S. agalactiae w wymazach pobranych z przedsionka pochwy (Ryc. 1), gdyż charakteryzuje się wysoką specyficznością i czułością oraz krótkim czasem oznaczenia, co może mieć istotne znaczenie przy profilaktyce zakażeń GBS u noworodków, których matki nie były badane w trakcie ciąży. 153 pz Ryc. 1: Produkty amplifikacji PCR otrzymane z wykorzystaniem swoistych starterów (Sag 59, Sag 150) dla gatunku S. agalactiae. Ścieżki: 1 - marker wielkości 100-500 pz, 2 8 - badane materiały pobrane z przedsionka pochwy ciężarnych, 9 - próba pozytywna, wzorzec S. agalactiae DSMZ 2134, 10 - próba negatywna. Wykazanie prążka zamplifikowanego produktu na wysokości 153 pz wskazuje na obecność GBS w badanym materiale. Przeprowadzono porównanie czułości metody opartej na ilościowej hodowli, z metodą FISH badając równolegle 30 wybranych próbek pochodzących od kobiet ciężarnych (Tabela I). Wykrycie GBS w próbce metodą FISH było możliwe tylko wówczas, gdy populacja paciorkowców przekraczała liczbę 1x10 3 c.f.u./ml. Chociaż czułość metody FISH była niższa niż metody hodowli, może to stanowić pozytywną cechę tej techniki, Tabela I: Porównanie czułości metody hodowli oraz metody FISH przy wykrywaniu obecności GBS w wymazach pobranych przed porodem z pochwy. Liczba GBS (c.f.u./ml) w badanym materiale Wynik metody FISH Liczba badanych materiałów 2,5 x 10 2-7 1,0-5,0 x 10 3 +/- 5 0,5-5,0 x 10 4 + 11 0,5-5,0 x 10 5 + 6 2,5 x 10 6 + 1 Razem 30 - brak obecności GBS w badanym materiale +/- wynik wątpliwy + obecność GBS w badanym materiale
Nr 2 Molekularna diagnostyka nosicielstwa S. agalactiae 95 gdyż istnieje związek pomiędzy intensywnością nosicielstwa GBS w ciąży, a szansą ich przeniesienia na noworodka w trakcie porodu. Największe ryzyko wystąpienia wczesnej posocznicy u noworodków występuje wtedy, gdy u matki mamy do czynienia z masywną kolonizacją GBS (>10 5 c.f.u./ml) (2). Badanie metodą FISH może zatem eliminować przypadki nosicielstwa niewielkich populacji tych bakterii. Z drugiej zaś strony technika ta umożliwia przeprowadzenie badania nosicielstwa w ciągu 4-5 godzin, co również może mieć praktyczne zastosowanie przy profilaktyce zakażeń GBS u kobiet zgłaszających się do porodu, a nie badanych podczas ciąży. Ponadto zaobserwowano, iż metoda FISH dzięki wysokiej swoistości umożliwia wykrywanie zanieczyszczeń hodowli S. agalactiae innymi paciorkowcami niezauważalnymi w hodowli. Pomimo zastosowania rutynowej metody posiewu redukcyjnego w badaniach nad nosicielstwem GBS uzyskano pojedyncze kolonie paciorkowców, w których dochodziło do koagregacji komórek S. agalactiae z S. sanguis, S. pyogenes lub Enterococcus sp. (Ryc. 2), co w istotny sposób wpływało na wyniki identyfikacji genotypowej takich koagregatów, a także na ocenę interpretacji wyników oznaczenia lekooporności, szczególnie przy wykrywaniu mechanizmu oporności typu MLS B. Możliwość zastosowania techniki fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ do rozróżniania mieszanin blisko spokrewnionych drobnoustrojów była wykorzystywana już w mikrobiologii przemysłowej (5, 11). Ryc. 2: Zastosowanie metody fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ z użyciem gatunkowo specyficznej sondy Saga 67 a/b znakowanej CY3 oraz sondy EUB, do wykrywania koagregacji szczepów S. agalactiae (ziarniaki koloru białego) z innymi paciorkowcami (ziarniaki koloru szarego) nie wykrywanymi w hodowli (powiększenie 1000x, mikroskop fluorescencyjny firmy Olympus). Posługując się metodą RAPD określono stopień genotypowego podobieństwa szczepów GBS wyizolowanych od matek i ich dzieci. Wykazano, że dzieci urodzone z matek skolonizowanych paciorkowcem grupy B ulegały kolonizacji szczepami GBS pochodzącymi od nich. Ponadto zaobserwowano, iż mimo przebiegu porodu za pomocą cesarskiego cięcia bez pęknięcia błon płodowych, noworodek zostaje skolonizowany szczepami S. agalactiae (Ryc. 3). W czterech przypadkach, na pięć badanych, wykazano 100% podobieństwa po-
96 M. Brzychczy-Włoch i inni Nr 2 Ryc. 3. Oznaczenie metodą RAPD stopnia genotypowego podobieństwa pomiędzy szczepami GBS wyizolowanymi od matek (M), a szczepami GBS wyizolowanymi od ich dzieci (C; C1, C2- para bliźniąt) urodzonych przez cesarskie cięcie bez wcześniejszego pęknięcia błon płodowych. między szczepami GBS wyizolowanymi od matek, a szczepami GBS wyizolowanymi od ich dzieci, co może sugerować, że noworodki urodzone przez cesarskie cięcie, pomimo braku wcześniejszego pęknięcia pęcherza płodowego, ulegają jednak kolonizacji szczepami GBS pochodzącymi od matek. Takie sugestie stoją jednak w sprzeczności z wcześniejszym doniesieniem autorów włoskich, którzy nie wykazali kolonizacji noworodków w takich okolicznościach (3). Dodatkowo w trakcie badania kolonizacji GBS noworodków wyłoniono grupę 12 dzieci urodzonych na dwóch oddziałach Szpitala Uniwersyteckiego CMUJ (5 dzieci z ciąży prawidłowych i 7 dzieci z ciąży wysokiego ryzyka), u których wykryto bezpośrednio po porodzie GBS, mimo braku tej bakterii u ich matek. Stosując metodę RAPD przeanalizowano genotypowe podobieństwo powyższych izolatów, w celu ewentualnego wykrycia Ryc. 4: Badanie stopnia genotypowego podobieństwa przy użyciu metody RAPD: a. pomiędzy szczepami GBS wyizolowanymi od 5 dzieci urodzonych przez matki nie skolonizowane przez S. agalactiae z ciążą prawidłowo przebiegającą na Oddziale Położniczym Szpitala Uniwersyteckiego CMUJ w Krakowie, b. pomiędzy szczepami GBS wyizolowanymi od 7 dzieci urodzonych przez nie skolonizowane matki z ciążą wysokiego ryzyka na Oddziale Patologii Ciąży Szpitala Uniwersyteckiego CMUJ w Krakowie.
Nr 2 Molekularna diagnostyka nosicielstwa S. agalactiae 97 pozamatczynego źródła kolonizacji. Na podstawie uzyskanych wyników (Ryc. 4) wykazano, że badane szczepy w większości przypadków różniły się między sobą, wykazując podobieństwo rzędu 30% do 80%. W jednym przypadku wykazano 100% podobieństwa pomiędzy dwoma badanymi szczepami: B126/C i B127/C. Szczepy te pochodziły od dwojga dzieci urodzonych w tym samym dniu na Oddziale Położniczym Szpitala Uniwersyteckiego CMUJ przez różne nie skolonizowane matki. Wynik ten może świadczyć o możliwości przeniesienia tego drobnoustroju w warunkach szpitalnych, prawdopodobnie przez personel oddziału. Takie sytuacje zostały opisane w literaturze medycznej (10). Potwierdzenie takiej hipotezy i wykrycie dróg przenoszenia wymaga jednak osobnych badań, obejmujących wykrywanie nosicielstwa GBS wśród personelu szpitalnego. Dla wszystkich wyizolowanych szczepów GBS z fenotypowo wykazaną opornością typu MLS B potwierdzono obecność sekwencji kodujących oporność na erytromycynę metodą PCR-multiplex. Zastanawiającym jest fakt, że w wybranym przypadku (Ryc. 5), w którym matka była skolonizowana dwoma klonami S. agalactiae (jeden bez mechanizmu oporności MLS B, drugi z mechanizmem oporności MLS B ), wykazano obecność genów erma, ermb, ermc u szczepów wyizolowanych od pary bliźniąt (ścieżka 4 i 5) mimo braku potwierdzenia tej oporności metodą dyfuzyjno-krążkową oraz metodą E-testów. 640 pz Ryc. 5: Wykazanie metodą PCR-multiplex obecności genów oporności na erytromycynę (erma, ermb, ermc) u wybranych szczepów GBS wyizolowanych od matki i jej dzieci (para bliźniąt). Ścieżki: 1,8- marker wielkości 700-9276 pz, 2- szczep od matki bez mechanizmu MLS B, 3- szczep od matki z mechanizmem MLS B, 4- szczep od pierwszego z bliźniąt bez mechanizmu MLS B, 5- szczep od drugiego z bliźniąt bez mechanizmu MLS B, 6- próba negatywna, 7- próba pozytywna. PODSUMOWANIE 1. Metody PCR i FISH mogą być skutecznie wykorzystywane w szybkiej diagnostyce S. agalactiae, gdyż charakteryzują się wysoką specyficznością i czułością oraz krótkim czasem oznaczenia.
98 M. Brzychczy-Włoch i inni Nr 2 2. Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ jest skuteczną metodą weryfikującą czystość hodowli szczepów S. agalactiae, które w pojedynczych przypadkach, wykazywały silną koagregację z innymi gatunkami paciorkowców. 3. Ze względu na czułość techniki FISH małe populacje, poniżej 1x10 3 c.f.u/ml, paciorkowca grupy B były nie wykrywane, co stanowiło jeszcze jedną pozytywną cechę zastosowanej techniki, gdyż pewne, niewielkie populacje tych bakterii mogą być stale lub czasowo obecne w środowisku pochwy. 4. Metoda RAPD ujawniła, że dzieci urodzone przez kobiety skolonizowane paciorkowcem grupy B ulegały kolonizacji szczepami GBS pochodzącymi od ich matek. Mechanizm ten wykazano także w stosunku do dzieci urodzonych przez cesarskie cięcie, pomimo braku wcześniejszego pęknięcia pęcherza płodowego. 5. Wykryto kolonizację S. agalactiae u dzieci urodzonych przez matki nie skolonizowane GBS w wyniku przeniesienia szczepów w środowisku szpitalnym, przy czym, poznanie dróg transmisji wymaga osobnych badań nad nosicielstwem tych bakterii wśród personelu, które przekraczają zakres tego projektu. 6. Przy użyciu metody PCR-multiplex potwierdzono wyniki fenotypowo oznaczonej oporności typu MLS B. W wybranym przypadku wykazano obecność genów oporności erma, ermb, ermc u izolatów pochodzących od pary bliźniąt mimo braku potwierdzenia tej oporności metodą dyfuzyjno-krążkową. M. Brzychczy-Włoch, M. Strus, D. Pawlik, T. Gosiewski, K. Rytlewski, A. Drzewiecki, R. Lauterbach, P.B. Heczko STUDIES ON THE POSSIBLE APPLICATION OF MOLECULAR METHODS IN DIAGNOSING CARRIERS AND IN SIMILARITY ANALYSIS OF GROUP B STREPTOCOCCI (STREPTOCOCCUS AGALACTIAE). SUMMARY The most popular method of GBS identification in Poland currently is by culturing on enriched agar and verifying the Lancefield Group using special latex agglutination kits. However, the classical methods are time-consuming and their sensitivity is insufficient therefore it is becoming more common to try and apply molecular methods which are characterized by high sensitivity and rapid results. Moreover, molecular methods give us the possibility to carry out epidemiological investigations and gene detection, for instance for antibiotic resistance. It was confirmed that PCR and FISH procedures may be effective in rapid detection of GBS. Thanks to RAPD methods we showed that newborns born to colonized mothers were colonized by GBS strains which originated from the mother, irrespective of the way and the course of labour. Additionally, we detected GBS colonization in children who were born to mothers who were not colonized by GBS. These children were probably colonized with strains coming from hospital environment. More studies are needed to elucidate the route of transmission and the role of colonization of the medical staff. Using multiplex PCR we showed the presence of erma, ermb and ermc genes in phenotypically confirmed MLS B GBS strains.
Nr 2 Molekularna diagnostyka nosicielstwa S. agalactiae 99 PIŚMIENNICTWO 1. Artz L A, Kempf VA, Autenrieth I B. Rapid screening for Streptococcus agalactiae in vaginal specimens of pregnant women by fluorescent in situ hybridization. J Clin Microbiol 2003; 5, 2170-3. 2. Benitz W E, Gould JB, Druzin M L. Risk factors for early-onset group B streptococcal sepsis: estimation of odds ratios by critical literature review. Pediatrics 1999; 103, e77. 3. Berardi A, Rossi K, Pizzi C i inni. Absence of neonatal streptococcal colonization after planned cesarean section. Acta Obstet Gynecol Scand. 2006. 85:1012-3. 4. Brzychczy-Włoch M, Strus M, Pawlik D, Machlarz H, Gosiewski T, Drzewiecki A, Rytlewski K, Lauterbach R, Heczko P.B. Narastanie stopnia kolonizacji u kobiet w ciąży i noworodków przez Streptococcus agalactiae na obszarze Polski południowo-wschodniej - w druku. 5. Burrell PC, O Sullivan C, Song H i inni. Identification, detection, and spatial resolution of Clostridium populations responsible for cellulose degradation in a methanogenic landfill leachate bioreactor. Appl Environ Microbiol. 2004; 70: 2414-9. 6. Harmsen HJM, Gibson GR, Elfferich P i inni. Comparison of viable cell counts and fluorescence in situ hybridization using specific rrna-based probes for the quantification of human fecal bacteria. FEMS Microbiol Let, 2000; 183: 125-9. 7. Ke D, Menar C, Picard FJ i inni. Development of conventional and real-time PCR assays for the rapid detection of group B streptococci. Clin Chem 2000; 46, 324-31. 8. Kowalska B, Niemiec KT, Drejewicz H i inni. Częstość występowania kolonizacji paciorkowcami hemolizującymi grupy B kobiet ciężarnych i noworodków określona na podstawie badań przesiewowych u pacjentek Polikliniki i Kliniki Położnictwa i Ginekologii Instytutu Matki i Dziecka- badania pilotażowe. Ginekol Pol 2003; 74: 1223-7. 9. Martinez G, Harel J, Higgins R i inni. Characterization of Streptococcus agalactiae isolates of bovine and human origin by randomly amplified polymorphic DNA analysis. J Clin Microbiol. 2000; 38:71-8. 10. Puopolo KM, Madoff LC, Eichenwald EC. Early-onset group B streptococcal disease in the era of maternal screening. Pediatrics 2005; 115: 1240-1246. 11. de los Reyes FL, Rothauszky D, Raskin L. Microbial community structures in foaming and nonfoaming full-scale wastewater treatment plants. Water Environ Res 2002; 74: 437-49. 12. Schrag S, Gorwitz R, Fultz-Butts K i inni. Prevention of perinatal group B streptococcal disease. Revised guidelines from CDC. MMWR 2002; 15: 1-22. 13. Sutcliffe J, Grebe T, Tait-Kamradt A, Wondrack L. Detection of erythromycin-resistant determinants by PCR. Antimicrob Agents Chemother. 1996; 40: 2562-6. 14. Szewczyk E. Diagnostyka bakteriologiczna. PWN, W-wa, 2005; 34-36, 312. Otrzymano:26 II 2008 Adres Autora: 31-121 Kraków, ul. Czysta 18, Katedra Mikrobiologii CM UJ e-mail: mbrzych@cm-uj.krakow.pl