Prof. Piotr Fiedor Katedra i Klinika Chirurgii Ogólnej i Transplantacyjnej Instytutu Transplantologii Warszawski Uniwersytet Medyczny Ul. Nowogrodzka 59 02-006 Warszawa Recenzja pracy doktorskiej mgr Wojciecha Łabusia pt.:"ocena metod otrzymywania żywego przeszczepu z pozbawionej komórek ludzkiej skóry allogenicznej zasiedlonej hodowanymi in vitro fibroblastami". Rozwój medycyny regeneracyjnej w oparciu o hodowle komórkowe przygotowywane in vitro stworzył nowe możliwości leczenia wielu jednostek chorobowych i opracowania innowacyjnych produktów leczniczych terapii zaawansowanych. Aktualnie większość ośrodków naukowo-badawczych prowadzi intensywne prace wdrożeniowe nad wykorzystaniem wyników badań naukowych w celu opracowania innowacyjnych technologii z wykorzystaniem materiału ludzkiego, które coraz częściej znajdują zastosowanie w codziennej praktyce lekarskiej i stanowią alternatywne możliwości leczenia w chirurgii. Jednym z podstawowych problemów w chirurgii jest leczenie ciężko chorych z rozległymi ranami oparzeniowymi pełnej grubości i zapobieganie najcięższym powikłaniom zagrażającym życiu. Wykorzystanie w leczeniu ran oparzeniowych autologicznych wolnych przeszczepów skóry pośredniej grubości stanowi standard postępowania chirurgicznego. Możliwość pozyskania własnej skóry (dawcy) nie jest możliwa w przypadku chorych z ciężkimi i rozległymi oparzeniami. Wprowadzenie do praktyki klinicznej opatrunków biologicznych (matryce, skafoldy itp.) otrzymanych ze skóry ludzkiej i następnie zasiedlanie komórkami hodowanymi in vitro stwarza nowe możliwości w leczeniu ran oparzeniowych. Najczęstsze urazy skóry stanowią uszkodzenia termiczne (ponad 95%) i wymagają specjalistycznego leczenia chirurgicznego w ośrodkach referencyjnych posiadających pełne przygotowanie i zaplecze naukowo-kliniczne. Według raportu Światowej Organizacji Zdrowia (WHO) rocznie stwierdza się ponad 1.25 mln oparzeń na świecie, a 265 000 ciężko chorych umiera. W Polsce raportowanych jest 400 000 oparzeń rocznie z czego około 20 000 chorych wymaga hospitalizacji, a 500 ciężko chorych umiera. Najnowsza metoda leczenia oparzeń drugiego stopnia została opracowana przez prof. Joerga C. Gerlacha i Zespołu Instytutu Medycyny Regeneracyjnej przy Uniwersytecie w
Pittsburghu, która polega na dyspersji zawiesiny komórek własnych skóry wokoło 2 godzin od pobrania. Ciężkie rany oparzeniowe trzeciego stopnia wymagają nadal leczenia chirurgicznego z wykorzystaniem auto i/lub allogenicznego przeszczepu skóry/opatrunku biologicznego. Jednym z trudnych problemów klinicznych, który przekłada się bezpośrednio na wyniki leczenia jest jakość życia pacjentów jak również aspekt społecznoekonomiczny oraz aktualne możliwości chirurgicznego leczenia ciężkich ran oparzeniowych. Dotychczas stosowane metody leczenia włączając najnowszej generacji produkty lecznicze takie jak skafoldy zasiedlane hodowlami komórkowymi i postępowanie chirurgiczne z użyciem najnowszych technologii znacząco poprawiło wyniki leczenia, ale nadal jest to poważny problem kliniczny szczególnie w grupie pacjentów dotkniętych głębokimi, rozległymi ranami oparzeniowymi czy też chorobami o podłożu genetycznym przypominającymi rany oparzeniowe jak w przypadku choroby rzadkiej jaką jest Epidermolysis Bullosa. Przedstawiona do recenzji praca doktorska dotyczy bardzo ważnego problemu klinicznego. Doktorant podjął ambitną próbę wykorzystania znanych metod usuwania komórek z allogenicznej skóry właściwej pobranej od dawców wielonarządowych ze zwłok i zachowaniem struktury sieci włókien kolagenowych, a następnie zasiedlenia hodowanymi in vitro fibroblastami biorcy. Praca doktorska mgr Wojciecha Łabusia ma typowy układ zawarty na 115 stronach opracowania naukowego zawierającego 4 tabele i 57 rycin. Uzupełnienie pracy naukowej stanowi wykaz skrótów co zdecydowanie ułatwia zapoznanie się tematyką pracy. Praca ta spełnia wszystkie ustawowe wymogi dopuszczenia pracy doktorskiej do publicznej obrony. Założenia pracy, wstęp stanowią wyczerpujące wprowadzenie do postawionego problemu naukowego, a analiza prac naukowych jest przedstawiona bardzo zwięźle w zrozumiały sposób dla czytającego w oparciu o piśmiennictwo, które jest prawidłowo cytowane (115 aktualnych pozycji piśmiennictwa polskiego i zagranicznego oraz 4 źródła internetowe). Obszerne wprowadzenie w oparciu o aktualny stan wiedzy i wyniki leczenia Doktorant odnosi równieź do ośrodków polskich (referencyjne, akademickie ośrodki kliniczne i naukowe), które zajmują się leczeniern ciężko chorych z ranami oparzeniowymi, którym dedykowane są wyniki tej pracy badawczej. Omówienie metodologii badań naukowych i doświadczalnych Doktorant przedstawił bardzo szczegółowo, a wprowadzenie elementów odnoszących wyniki badań do praktyki klinicznej (np. procedura usuwania komórek z ludzkiej allogenicznej skóry właściwej, hodowla in vitro ludzkich autologicznych fibroblastów na matrycach kolagenowych) powoduje, że praca doktorska spełnia w tej części wymagania, które mogą zostać wykorzystane w przyszłości dla prowadzenia badań klinicznych i przygotowania odpowiedniego protokołu badania klinicznego. Doktorant w swojej pracy uwiarygadnia dobrze przygotowany materiał badawczy na modelu doświadczalnym w celu wykorzystania go dla potrzeb analizy i oceny naukowej a przede wszystkim w celu poprawnego opracowania protokołu badania klinicznego jak również przedstawia właściwie dobrane parametry oceny jakości, bezpieczeństwa i skuteczności metody co umożliwia dalszą obserwację w badaniu klinicznym. Cele naukowe i założenia pracy dotyczą ważnego zagadnienia klinicznego i koncentrują się na ocenie niezmienionej struktury matrycy kolagenowej i ocenie
zasiedlania fibroblastami in vitro. Zastosowanie mikroskopu sił atomowych i analiza histologiczna wykazały potencjalną możliwość wdrożenia do praktyki klinicznej aliogenicznego przeszczepu z zasiedlonymi fibroblastami bez potrzeby leczenia immunosupresyjnego. Doktorant dodatkowo wykonał analizę wyników odnoszących się do bezpieczeństwa i skuteczności terapeutycznej potencjalnego produktu leczniczego. Materiał badawczy stanowiło 60 preparatów ludzkiej skóry pobranej od dawców wielonarządowych ze zwłok (2x2cm). Sześć grup badawczych stanowiły preparaty allogenicznej skóry właściwej otrzymywanej różnymi metodami ( trypsyna lub siarczan dodecylu sodu) i zasiedlane in vitro fibroblastami (500 000 żywych komórek) pochodzących od jednego dawcy w celu przyżyciowej oceny graftu za pomocą mikroskopu sił atomowych. Opis procedur oraz protokół badania Doktorant przygotował bardzo szczegółowo co umożliwia powtórzenie eksperymentu w każdym ośrodku badawczym i spełnia podstawowe kryteria dla procesów wytwarzania GMP. Najważniejsze i istotne wyniki Wyniki badań doświadczalnych wykazały, że grupa ADM 2 aliogenicznej skóry właściwej poddanej jednoetapowej procedurze usuwania komórek z tkanek w czasie 24 godzinnej inkubacji w 0.5% roztworze trypsyny w EDTA i zasiedlone fibroblastami jest optymalną procedurą wytwarzania (produkcji) żywych i trwałych substytutów skóry przeznaczonej do transplantacji. Badania histochemiczne oraz wykorzystanie mikroskopu sił atomowych potwierdziły właściwy wybór metody inkubacji i hodowli fibroblastów oraz wybór grupy doświadczalnej jako referencyjnej dla potrzeb klinicznych. Ta część pracy wymagała do Doktoranta zastosowania wielu technik i umiejętności przygotowania materiału do analizy i oceny w mikroskopie sił atomowych oraz koniecznego doświadczenia w celu dokonania właściwej oceny najlepszej metody. Należy docenić w tym momencie dokładność i solidność wykonania oceny materiału doświadczalnego z dobrze opracowaną dokumentacją, która stanowi mocną podstawę dla części badań przed klinicznych i może zostać w całości wykorzystana w procedurze badań klinicznych i późniejszego wdrożenia w chirurgii rekonstrukcyjnej leczenia głębokich ran oparzeniowych. Analiza statystyczna otrzymanych wyników została właściwie dostosowana do metody badawczej o analizy statystycznej wyników z zachowaniem przedziału ufności na poziomie istotności p< 0.05, 0.01. Wykorzystanie mikroskopu sił atomowych umożliwiło ocenę włókien kolagenowych poprzecznego prążkowania z określeniem nanostruktury macierzy pozakomórkowej ludzkiej skóry właściwej co zostało dobrze udokumentowane i stanowi oryginalny wkład w ocenę materiału klinicznego w zakresie elastyczności, tarcia, adhezji, gęstości ładunku i struktury magnetycznej badanego biomateriału. Poszczególne cele i zadania badawcze zostały sformułowane bardzo precyzyjnie w aspekcie potencjalnych problemów klinicznych. Doktorant skoncentrował uwagę
badacza na problemach z którymi nie ma na co dzień do czynienia w praktyce klinicznej, co szczególnie należy docenić. Przedstawiony problem naukowy nawiązuje do aspektów społeczno-ekonomicznych leczenia ran oparzeniowych i potrzebę opracowania w polskich warunkach biomateriałów w celu chirurgicznego leczenia. Odnosząc się do celów naukowych badań Doktorant uwzględnił możliwość dalszych badań klinicznych z zastosowaniem własnej opracowanej metody inkubacji ludzkiej skóry i in vitro hodowlą z zasiedlaniem fibroblastami. Rzetelne badania z pełną dokumentacją histochemiczną i badaniami z użyciem mikroskopu sił atomowych pozwalają na wykonanie dalszych badań w zakresie bezpieczeństwa i skuteczności leczenia ran oparzeniowych. Wyniki tych badań stanowią solidną podstawę dla przyszłej części wdrożeniowej z dobrze opracowaną dokumentacja przedkliniczną procesu wytwarzania GMP. Cele pracy zostały sformułowane jasno -charakterystyka badanych grup doświadczalnych, kryteria analizy i oceny zostały potwierdzone wynikami badań i sformułowanymi końcowymi wnioskami z końcową aplikacją kliniczną Należy w tym miejscu podkreślić, że podjęty został bardzo trudny do analizy materiał doświadczalny/przedkliniczny. Jest to bardzo ważny obszar badań, który w perspektywie może mieć znaczenie w odniesieniu do wykorzystania wyników badań w celu ich wdrożenia do praktyki klinicznej/chirurgii. Doktorant samodzielnie wykonał żmudne badania i opracował bardzo wartościowy protokół, który gwarantuje powtarzalność i skuteczność metody w doświadczeniu z zastosowaniem nowej metody wytwarzania biomateriału w celu przeszczepienia chorym z rozległymi ranami oparzeniowymi. Doktorant przedstawił w sposób praktyczny zastosowanie metod badawczych i należy podkreślić, że dokonał wyboru właściwych metod i analizy statystycznej dla uwiarygodnienia uzyskanych wyników. Stanowi to cenne uzupełnienie dotychczasowej wiedzy naukowej, a własne, oryginalne opracowanie metody umożliwia powtórzenie eksperymentu w każdym ośrodku badawczym co pozwala badaczowi potwierdzić wiarygodność uzyskanych danych w praktyce. Omówienie wyników i dyskusja stanowią najważniejszą i najciekawszą część pracy doktorskiej w oparciu o analizę statystyczną wyników badań naukowych wykonanych w badanych grupach. Omówienie wyników wskazuje, że Doktorant wnikliwie zapoznał się z literaturą, a zaproponowana nowa metoda otrzymywania żywego przeszczepu skóry (matrycy kolagenowej) pozbawionego allogenicznych komórek była właściwym wyborem tematu pracy doktorskiej o możliwej aplikacji w praktyce klinicznej. Wyniki badań przedstawione w pracy doktorskiej jednoznacznie wskazują na potencjalne możliwości wykorzystania nowej metody w praktyce klinicznej. Praca doktorska mgr Wojciecha labusia stanowi istotne uzupełnienie wiedzy w tym temacie dla badaczy jak również klinicystów poszukujących nowych, skutecznych metod chirurgicznego leczenia oparzeń i ran innego pochodzenia. Podjęcie tak ważnego tematu w warunkach niedofinansowanej opieki zdrowotnej w Polsce świadczy o pełnym zaangażowaniu w rozwiązywanie nowych problemów naukowych i klinicznych przez Doktoranta, co pozwala na bardzo wysoką ocenę tej pracy. W przedstawionej pracy doktorskiej mgr Wojciecha labuś wykazał, że jest doświadczonym pracownikiem naukowym oraz potrafi samodzielnie rozwiązywać i dokonywać analizy problemów naukowych w odniesieniu do postawionych celów. Wyniki badań potwierdzone analizą statystyczną wskazują na konieczność dalszych badań w celu opracowania i wdrożenia nowej, autorskiej metody do kliniki,
szczególnie w chirurgii i transplantologii. Najważniejszym wynikiem pracy doktorskiej i rozwiązaniem problemu naukowego jest sformułowany wniosek, który dotyczy potwierdzenia bezpieczeństwa i skuteczności opracowanej autorskiej metody wytworzenia siatki kolagenowej z ludzkiej skóry i zasiedlenia hodowanymi fibroblastami w obserwacji in vitro. Opracowana metoda może mieć praktyczne zastosowanie w wielu jednostkach chorobowych wykorzystując wytworzoną siatkę kolagenową jako opatrunek biologiczny lub przeszczep zjednoczasowym zasiedleniem komórkami hodowanymi in vitro dla potrzeb medycyny regeneracyjnej. Praca napisana jest zrozumiałym i poprawnym językiem polskim. Niektóre sformułowania językowe/medyczne i drobne błędy w żadnym stopniu nie umniejszają wartości pracy i powinny zostać uwzględnione przed planowaną publikacją Własną opinię dotyczącą eksperymentu w dalszych badaniach przekazałem osobiście Doktorantowi w celu właściwego przygotowania dokumentacji przedklinicznej w sytuacji planowanych dalszych badań na potrzeby wdrożenia nowej technologii do kliniki. Wnioski wynikające z pracy mają ważne znaczenie dla klinicystów poszukujących nowych metod chirurgicznego leczenia oparzeń oraz pogłębiają dotychczasowy stan wiedzy o możliwości wykorzystania ludzkiej skóry jako opatrunku biologicznego czy też matrycy kolagenowej do zasiedlenia hodowanych in vitro fibroblastów. Praca doktorska jest cennym wkładem i uzupełnieniem wiedzy na temat potencjalnych nowych metod leczenia ciężkich oparzeń i ran wymagających opracowania chirurgicznego. Z pewnością wyniki pracy przyczynią się w przyszłości do dalszych badań nad opracowaniem opatrunków biologicznych przeznaczonych do leczenia ciężko chorych z rozległymi i głębokimi oparzeniami. Na podstawie dokonanej recenzji pracy doktorskiej mgr Wojciecha Łabusia, która wykonana została w referencyjnym ośrodku klinicznym/akademickim w Polsce - Centrum Leczenia Oparzeń w Siemianowicach Śląskich pod kierunkiem Pana prof. Marka Kaweckiego z pełnym przekonaniem wnoszę do Pana Dziekana i Członków Rady Wydziału Lekarskiego z Oddziałem Lekarsko-Dentystycznym w Zabrzu Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach o dopuszczenie mgr Wojciecha Łabusia do dalszych etapów obrony przewodu doktorskiego. Jednocześnie korzystając z uprawnień Recenzenta wynikających z ustawy o szkolnictwie wyższym, wnoszę o wyróżnienie pracy doktorskiej mgr Wojciecha Łabusia. Argumenty za wyróżnieniem pracy doktorskiej to: badania wykonane zostały na materiale skóry ludzkiej pobranej ze zwłok nowatorskie zastosowanie metodologii badań i autorskie, oryginalne opracowanie metody usuwania komórek z ludzkiej skóry właściwej Opracowanie to stanowi podstawę do wytworzenia bezkomórkowych substytutów skóry gotowych do klinicznego wdrożenia o charakterze innowacyjnym. hodowla fibroblastów na pozbawionych komórek skórnych matrycach (ADM) istotnie nie stanowi nowego kierunku badań jednak opracowano na tej podstawie optymalną metodę produkcji żywego przeszczepu ze skóry ludzkiej
wykorzystanie do badań biomedycznych nowoczesnego i zaawansowanego technologicznie mikroskopu sił atomowych AFM stanowi wskazanie oryginalnej metody/narzędzia do oceny zaawansowanych technologii produktów leczniczych wyniki badań naukowych nie zostały dotychczas opublikowane opracowana nowa metoda jest innowacyjną technologią o dużym znaczeniu praktycznym w opracowaniu biologicznego produktu leczniczego dla terapii zaawansowanych metoda i wyniki badań mają istotne znaczenie praktyczne dla dalszych badań klinicznych w leczeniu rozległych, głębokich ran oparzeniowych doświadczenie potwierdza bezpieczeństwo zastosowania nowej metody i jej skuteczność w badaniach in vitro a także powtarzalny proces wytwarzania (GM P) produktu leczniczego terapii zaawansowanych W uzasadnieniu chciałbym zwrócić uwagę na bardzo ważny problem naukowy oraz kliniczny, który był celem pracy doktorskiej i został przedstawiony jako samodzielne, oryginalne opracowanie naukowe w formie protokołu klinicznego/doświadczalnego dla opracowania powtarzalnej metody otrzymywania żywego przeszczepu z pozbawionej komórek ludzkiej allogenicznej skóry. Wyniki tych badań mają ogromne znaczenie dla dalszego rozwoju metod otrzymywania przeszczepów tzw. "skafoldów" ze skóry ludzkiej w celu wykorzystania jako opatrunek biologiczny/rusztowanie dla zasiedlenia komórek hodowanymi in vitro w procesie leczenia ran oparzeniowych. Badania wykonane zostały w oparciu o własne, autorskie opracowanie nowej metody z wykorzystaniem allogenicznego przeszczepu zasiedlonego wyhodowanymi in vitro fibroblastami i mają potencjalną możliwość wdrożenia i zastosowania w klinice. Praca doktorska omawia ważne aspekty praktyczne, szczególnie istotne dla klinicystów zajmujących się chirurgicznym leczeniem oparzeń oraz chirurgią rekonstrukcyjną jak również leczeniem przewlekłych ran w celu zastosowania nowatorskiej technologii ludzkiego materiału w lecznictwie. Wyniki badań zostały wzorowo opracowane oraz dobrze udokumentowane. Ośrodek kliniczny z zapleczem naukowo-badawczym w postaci Banku Tkanek w którym wykonano badania należy do referencyjnych jednostek klinicznych i naukowych w Polsce współpracującym z najlepszymi jednostkami naukowo-klinicznymi w Europie i na świecie. Należy docenić działalność naukową Doktoranta pomimo, że nie ukończył medycyny i nie jest chirurgiem to opublikował dwie ważne prace z obszaru zainteresowań badawczych w fachowym czasopiśmie chirurgicznym, a Jego wysiłek został doceniony przez klinicystów. Osiągnięcia naukowe Doktoranta powstały we współpracy z chirurgami i stanowią odpowiedź młodego badacza na potrzeby kliniczne wynikające z obserwacji leczenia ciężko chorych oparzonych Pacjentów w referencyjnym ośrodku klinicznym/akademickim jakim jest Centrum Leczenia Oparzeń w Siemianowicach Śląskich.
1. Literature review concerning celi and skin substitute cultures obtained by means of tissue engineering used in the treatment of burns. Cichowski A, Kawecki M, Glik J, Klama-Baryła A, Łabuś W, Maj M, Nowak M, Dworak A, Sieroń AL. Pol Przegl Chir. 2014 Apr;86(4) 202-10 2. The role of tissue engineering in the treatment of burn wounds. Łabuś W, Kawecki M, Nowak M. Pol Przegl Chir. 2012 Mar;84(3):167-71 Warszawa, 12.08.2014r.