Proceedings of ECOpole Vol. 1, No. 1/2 27 Agata ŚWIĘCIŁO 1 ODDZIAŁYWANIE BENZOESANU SODU NA WYBRANE PROCESY FIZJOLOGICZNE W KIEŁKUJĄCYCH NASIONACH RZODKIEWKI Raphanus sativus L. INFLUENCE OF SODIUM BENZOATE ON SOME PHYSIOLOGICAL PROCESSES TAKING PLACE IN GERMINATING SEEDS OF RADISH Raphanus sativus L. Streszczenie: Zbadano wpływ benzoesanu sodu na proces kiełkowania nasion rzodkiewki Raphanus sativus L. Uzyskane wyniki sugerują, że benzoesan sodu w stężeniach mniejszych niż,3 mol dm 3 obniżał energię, a w mniejszym stopniu zdolność kiełkowania nasion rzodkiewki. Nie modyfikował jednak dynamiki wzrostu siewek i nie indukował cech patomorfologicznych. Natomiast zastosowany w stężeniach większych niż,3 mol dm 3 całkowicie hamował proces kiełkowania nasion. Zarodki tych nasion były żywe, ale charakteryzowały się małą aktywnością katalazy w porównaniu do nasion skiełkowanych. Słowa kluczowe: benzoesan sodu, kiełkowanie, rzodkiewka Raphanus sativus, katalaza Kwas benzoesowy oraz jego sole sodowe i potasowe, produkowane na skalę przemysłową, znalazły zastosowanie głównie jako konserwanty w przemyśle spożywczym, farmaceutycznym i kosmetycznym. Substancje te występują także w stanie naturalnym w niektórych owocach jagodowych oraz są intermediatami szlaków metabolicznych. Ze względu na ich powszechne wykorzystanie przyczyniają się one do chemizacji środowiska życia człowieka. W prezentowanej pracy badano oddziaływanie benzoesanu sodu na wybrane parametry procesu kiełkowania nasion rzodkiewki Raphanus sativus L. Rzodkiewka była często wykorzystywanym organizmem w badaniach nad mechanizmami allelopatii [1, 2] oraz odpowiedzi na ksenobiotyki, takie jak metale ciężkie [3-6], długołańcuchowe alkohole alifatyczne [7] czy zmiany natężenia pola magnetycznego [8]. Kiełki i młode siewki charakteryzują się większą wrażliwością na czynniki środowiskowe niż dojrzały organizm rośliny, z tego względu proces kiełkowania i wydłużania korzeni jest wykorzystywany jako krótkoterminowy test w badaniach ekotoksykologicznych (American Society for Testing and Materials, 1991). Materiały i metody W badaniach wykorzystano nasiona rzodkiewki Raphanus sativus L., odmiany Rowa z Przedsiębiorstwa Nasiennictwa Ogrodniczego i Szkółkarstwa Ożarów Mazowiecki. Nasiona rzodkiewki wysiano po 5 sztuk na szalki Petriego, wyłożone krążkiem bibuły filtracyjnej. Podłoże do kiełkowania nasion stanowiły wodne roztwory benzoesanu sodu o stężeniu: ;,2;,5;,8;,1;,3;,5 mol dm 3. Wartości ph tych roztworów wahały się od 7,2 do 7,6. Szalki z nasionami inkubowano w ciemności w cieplarce w temperaturze 25ºC. 1 Katedra Biochemii i Chemii Środowiskowej, Wydział Nauk Rolniczych w Zamościu, Akademia Rolnicza w Lublinie, ul. Szczebrzeska 12, 22-4 Zamość, tel. 84 677 27, e-mail: amyszka@wnr.edu.pl
254 Agata Święciło Po 48, 96 i 144 godzinach od wysiewu policzono liczbę wykiełkowanych nasion. Za kryterium kiełkowania przyjęto ukazanie się korzenia zarodkowego o długości większej niż 2 mm [13]. Według przepisów ISTA procent wykiełkowanych nasion rzodkiewki po 4 dobach (96 godzinach) od ich wysiewu określa energię kiełkowania. Procent wykiełkowanych nasion rzodkiewki po 6 dobach (144 godzinach) od ich wysiewu określa ich zdolność kiełkowania. Żywotności nasion rzodkiewki inkubowanych z benzoesanem sodu oznaczono za pomocą barwienia chlorowodorkiem 2,3,5 trójfenylotetrazoliny [9]. Do badań biochemicznych sporządzono ekstrakty zawierające białka rozpuszczalne według procedury zamieszczonej w pracy Libik i współpr. [1]. Ekstrakty wykonano z różnych faz rozwojowych siewek uzyskanych po 48- i 96-godzinnej inkubacji w obecności wybranych stężeń benzoesanu sodu. Białko w ekstraktach oznaczono metodą Lowry i współpr. [11]. Aktywność katalazy oznaczono za pomocą metody spektrofotometrycznej [12]. Wyniki przedstawione w pracy są średnią z co najmniej trzech niezależnie przeprowadzonych doświadczeń. Ilościowa analiza statystyczna wyników polegała na wyliczeniu przedziałów ufności dla średniej długości siewek na poziomie istotności α =,5. Przedziały ufności podano w tabelach po znaku ±. Wyniki W pierwszym etapie badań oznaczono wpływ benzoesanu sodu na dynamikę procesu kiełkowania. Wpływ benzoesanu sodu na dynamikę kiełkowania nasion rzodkiewki Raphanus sativus L. Stężenia benzoesanu sodu [mol dm 3 ],2,5,8,1,3,5,8 wykiełkowanych nasion po 48 h od wysiewu 92, 9,2 87, 81,5 85.3 4, wykiełkowanych nasion po 96 h od wysiewu 93,6 93,3 92,6 92,3 9, 1, 2, Tabela 1 wykiełkowanych nasion po 144 h od wysiewu Benzoesan sodu w zastosowanych stężeniach obniża procent wykiełkowanych nasion tylko w pierwszym terminie (po 48 godzinach od wysiewu nasion). W drugim terminie, który określa energię kiełkowania nasion, oraz w trzecim terminie, oznaczającym zdolność kiełkowania nasion, tylko stężenia benzoesanu sodu większe niż,1 mol dm 3 w wyraźny sposób zmniejszały procent wykiełkowanych nasion. W przypadku benzoesanu sodu o stężeniu,3 i,5 mol dm 3 zaobserwowano tylko pojedyncze epizody przebicia okrywy nasiennej przez korzeń zarodkowy, ale nie wiązało się to z dalszym rozwojem kiełka. W kolejnym etapie badano wpływ benzoesanu sodu na długość siewek rzodkiewki wyrosłych w obecności wybranych stężeń benzoesanu sodu. Długość siewek oznaczono 94,2 94,5 94, 92,2 93, 1, 2,
Oddziaływanie benzoesanu sodu na wybrane procesy fizjologiczne w kiełkujących nasionach 255 jako łączną długość korzeni i łodyg zarodkowych. W tabeli nie uwzględniono długości kiełków. Tabela 2 Wpływ benzoesanu sodu na długość siewek rzodkiewki Stężenia benzoesanu Średnia długość siewek [cm] sodu [mol dm 3 ] po 48 h kiełkowania po 96 h kiełkowania po 144 h kiełkowania,2,5,8,1,3,5,8 1,57 (±,12) 1,21(±,8) 1,2 (±,11),5 (±,32),5 (±,4) 4,5 (±,2) 4,2 (±,13) 3,8 (±,5) 3,4 (±,9) 2,8 (±,8) 5,5 (±,32) 5,4 ((±,16) 5,1 (±,14) 4,2 (±,12) 3,5 (±,7) Siewki, które rozwijały się w obecności benzoesanu sodu o stężeniu mniejszym niż,3 mol dm 3 charakteryzowały się mniejszą średnią długością niż siewki pochodzące z prób kontrolnych. W przypadku benzoesanu sodu o stężeniu równym bądź większym niż,3 mol dm 3 w badanych terminach nie zaobserwowano przekształcenia kiełka w siewkę. Pomimo różnic dotyczących średniej długości siewek dynamika ich wydłużania była podobna, co sugeruje, że benzoesan sodu w małych dawkach ma niewielkie znaczenie w mechanizmach kontrolujących procesy wzrostu siewki. Siewki, które wyrosły w podłożu zawierającym benzoesan sodu, charakteryzowały się prawidłową budową morfologiczną. Wyniki wcześniejszych doświadczeń (tabele 1 i 2) wskazują, że benzoesan sodu o stężeniu większym niż,3 mol dm 3 hamuje proces kiełkowania prawie całej populacji wysianych nasion. Zbadano zatem żywotność zarodków tych nasion metodą tetrazolinową. Nasiona kontrolne poddane 2-godzinnemu pęcznieniu w wodzie destylowanej oraz nasiona pochodzące z próby zawierającej benzoesan sodu o stężeniu,8 mol dm 3 w wyniku barwienia tetrazoliną zabarwiły się na kolor czerwony, co wskazuje na to, że są one aktywne metabolicznie. Uzyskane wyniki sugerują, że benzoesan sodu nawet w największym badanym stężeniu nie jest toksyczny dla zarodków nasion rzodkiewki. Procesowi kiełkowania towarzyszy zjawisko wydzielania przez rozwijający się zarodek i łupinę nasienną reaktywnych form tlenu (RFT) [13], w tym nadtlenku wodoru. Zbadano zatem aktywność komórkowego systemu antyoksydacyjnego poprzez pomiar aktywności katalazy, enzymu usuwającego nadtlenek wodoru. Aktywność katalazy oznaczono spektrofotometrycznie w ekstraktach sporządzonych z różnych faz rozwojowych roślin uzyskanych po inkubacji z benzoesanem sodu. Uzyskane wartości wyrażono w procentach. Za 1 przyjęto aktywność katalazy uzyskaną dla próbki kontrolnej. Czas kiełkowania [h] 96 144 Tabela 3 Aktywność katalazy [] w ekstraktach z materiału roślinnego po inkubacji z benzoesanem sodu Stężenie benzoesanu sodu [mol dm 3 ],2,5,8,1,3,5,8 1 1 16,3 95,3 95,5 16,1 82,4 92,3 85,5 89,3 14,3 16,5 16,7 18,6 13,3 15,7
256 Agata Święciło Relatywnie dużą aktywność katalazy zanotowano w próbkach uzyskanych z siewek inkubowanych w roztworze benzoesanu sodu o stężeniu mniejszym od,1 mol dm 3. Wraz ze wzrostem stężenia benzoesanu sodu w środowisku obserwowano spadek aktywności katalazy. Najmniejszą aktywność katalazy zanotowano dla próbek pozyskanych z nasion, które nie były zdolne do kiełkowania. Obserwowany wzrost aktywności katalazy w ekstraktach z kiełków i młodych siewek może stanowić odpowiedź organizmu na obecność w środowisku potencjalnie niebezpiecznej, bo łatwo przenikającej przez błony biologiczne, molekuły, jaką jest nadtlenek wodoru. Wnioski 1. Benzoesan sodu zastosowany w stężeniach mniejszych niż,3 mol dm 3 obniża energię i zdolność kiełkowania nasion. Siewki uzyskane z tych nasion były mniejsze niż siewki kontrolne, ale bez cech patomorfologicznych. Charakteryzowały się one dużą aktywnością katalazy. 2. Benzoesan sodu zastosowany w stężeniach większych niż,3 mol dm 3 hamuje proces kiełkowania nasion rzodkiewki, ale nie obniża żywotności zarodków tych nasion. Ekstrakty z tych nasion charakteryzowały się małą aktywnością katalazy. Literatura [1] Basile A., Sorbo S., López-Sáez J.A. i Castaldo Cobianchi R.: Effects of seven pure flavonoids from mosses on germination and growth of Tortula muralis HEDW (Bryophyta) and Raphanus sativus L (Magnoliophyta). Phytochemistry, 2, 62(7), 1145-1151. [2] Chiapusio G., Pellissier F. i Gallet C.: Uptake and translocation of phytochemical 2-benzoxazolinone (BOA) in radish seeds and seedlings. J. Exp. Bot., 24, 55(42), 1587-1592. [3] Chen Y.X., He Y.F., Luo Y.M., Yu Y.L., Lin Q. i Wong M.H.: Physiological mechanism of plant roots exposed to cadmium. Chemosphere, 23, 5(6), 789-793. [4] Nath K., Saini S. i Sharma Y.K.: Chromium in tannery industry effluent and its effect on plant metabolism and growth. J. Environ. Biol., 25, 26(2), 197-24. [5] Wieczorek J., Wieczorek Z. i Olszewski J.: Wrażliwość rzodkiewki (Raphanus sativus L.) i sałaty (Lactuca sativa L.) na niskie stężenia antracenu podawanego dolistnie. Zesz. Probl. Post. Nauk Rol., 24, 496, 527-536. [6] Zhang K. i Zhou Q.: Toxic Effects of Al-Based Coagulants on Brassica chinensis and Raphanus sativus growing in acid and neutral conditions. Inc. Environ. Toxicol., 25, 2, 179-187. [7] Blamowski Z., Borowski E. i Blamowska M.: Wpływ długołańcuchowych alkoholi alifatycznych na wzrost, wymianę gazową i rozdział asymilatów w roślinach rzodkiewki. Acta Agrobot., 1998, 54, 5-1. [8] Yano A., Ohashi Y., Hirasaki T. i Fujiwara K.: Effects of a 6 Hz magnetic field on photosynthetic CO2 uptake and early growth of radish seedlings. Bioelectromagnetics, 24, 25(8), 572-581. [9] Uziak Z.: Przewodnik do ćwiczeń z fizjologii roślin. WAR, Lublin 1979. [1] Libik M., Konieczny R., Pater B., Slesak I. i Miszalski Z.: Differences in the activities of some antioxidant enzymes and in H2O2 content during rhizogenesis and somatic embryogenesis in callus cultures of the ice plant. Plant Cell Rep., 25, 23(12), 834-841. [11] Lowry O.H., Rosenbrough N.J., Farr A.L. i Randall R.J.: Protein measurement with the Folin phenol reagent. Biol. Chem., 1951, 193(1), 265-275. [12] Beers R.F. i Sizer I.W.: A spectrophotometric method for measuring the breakdown of hydrogen peroxide by catalase. J. Biol. Chem., 1952, 195(1), 133-14. [13] Schopfer P., Plachy C. i Frahry G.: Release of reactive oxygen intermediates (superoxide radicals, hydrogen peroxide, and hydroxyl radicals) and peroxidase in germinating radish seeds controlled by light, gibberellin, and abscisic acid. Plant Physiol., 21, 125(4), 1591-162.
Oddziaływanie benzoesanu sodu na wybrane procesy fizjologiczne w kiełkujących nasionach 257 INFLUENCE OF SODIUM BENZOATE ON SOME PHYSIOLOGICAL PROCESSES TAKING PLACE IN GERMINATING SEEDS OF RADISH Raphanus sativus L. Summary: Derivatives of benzoate acid are produced at industrial level and are used as preservatives in food, pharmaceutical and cosmetic industries. They also occur naturally in some berries and are intermediates of metabolic trails. In over-physiological doses they have a destructive effect on human body and other living organisms. The aim of this study was determine the influence of sodium benzoate on germination processes of radish seeds Raphanus sativus L. The results that were obtained reveal that sodium benzoate in concentration lower than.3 mol dm 3 decreases energy, and to a smaller extent germination ability of radish seeds. However, sodium benzoate does not modify growth dynamics of seedlings, nor does it induce pathomorphological features. In concentration higher than.3 mol dm 3 sodium benzoate totally inhibits seed germination process. Despite the lack of signs of seed germination in the investigated samples, no decrease in germ vitality in the seeds was observed. The results suggest that biological tests based on seed germination process can be used to determine potential toxicity of preservatives. Keywords: sodium benzoate, seed germination, radish Raphanus sativus, catalase