UNIWERSYTET GDAŃSKI Pracownia studencka Katedry Analizy Środowiska Instrukcja do ćwiczeń laboratoryjnych Ćwiczenie nr 2 Oznaczanie benzoesanu denatonium w skażonym alkoholu etylowym metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej ANALIZA CHEMICZNA W KRYMINALISTYCE FIZYKOCHEMICZNE METODY BADAŃ W KRYMINALISTYCE Gdańsk, 2008 1
I. CEL ĆWICZENIA Celem ćwiczenia jest analiza zawartości benzoesanu denatonium w próbkach skażonego alkoholu etylowego. Analiza jakościowa zostanie wykonana poprzez porównanie czasu retencji analitu z czasem retencji wzorca otrzymanych w tych samych warunkach chromatograficznych. Analiza ilościowa zostanie wykonana metodą krzywej kalibracyjnej (krzywej wzorcowej). II. WYKONANIE ĆWICZENIA 1. Warunki analizy chromatograficznej HPLC (ćwiczenie wykonywane w sali 33) Chromatograf cieczowy WATERS 600-MS jest połączony z detektorem spektrofotometrycznym UV-Vis firmy LKB seria 2151 Variable Wavelenght Monitor oraz dozownikiem typu zaworu z pętlą o objętości 20 µl. Do analizy zostanie wykorzystana kolumna analityczna Gemini 5µ o wymiarach 150 4,6 mm (firmy Phenomenex). Wypełnienie stanowi żel krzemionkowy z chemicznie związanymi grupami alkilowymi z podstawnikami fenylowymi, czyli tzw. faza odwrócona C 6 -Phenyl. Średnica ziaren - 5 µm. Fazą ruchomą jest mieszanina: 0,1% wodny roztwór H 3 PO 4 /acetonitryl w stosunku 30:70 (v/v); rozdział izokratyczny. Prędkość przepływu fazy ruchomej: 0,6 ml/min. Należy używać rurki teflonowej A oznaczonej solvent A. Ustawienie pokrętła Absorbance range na detektorze: 0.32. Czas analizy 25 minut. Przed rozpoczęciem analiz należy przemyć kolumnę fazą ruchomą w ciągu minimum 30 minut aż do uzyskania stabilnej linii zerowej (przepływ 0,6 ml/min). Po zakończeniu analiz należy koniecznie przemyć kolumnę wodą (wcześniej odgazowaną) w ciągu minimum 30 minut aż do uzyskania stabilnej linii zerowej i pozostawić napełnione wodą rurki teflonowe zakończone filtrami zanurzone w wodzie. Uwaga: nie wolno doprowadzić do zapowietrzenia pomp poprzez zaciągnięcie powietrza przez rurki, używanie nieodgazowanych rozpuszczalników lub pozostawienie rurek, które nie są zanurzone w odpowiedniej ilości cieczy. 2
2. Odczynniki i sprzęt laboratoryjny (ćwiczenie wykonywane w sali 33) Roztwór 0,1% H 3 PO 4 w 1 litrze wody wykonany poprzez rozpuszczenie 1 ml 85% H 3 PO 4 w 1 litrze wody. Faza ruchoma o składzie: 0,1% wodny roztwór H 3 PO 4 /acetonitryl w stosunku 30:70 (v/v). Fazę ruchomą należy przed użyciem odgazować przez 15 min w łaźni ultradźwiękowej (250 ml). Acetonitryl do mycia strzykawek (25 ml). Roztwór podstawowy benzoesanu denatonium w etanolu o stężeniu równym 2 mg/ml. Roztwory wzorcowe benzoesanu denatonium w etanolu o stężeniach równych: 0, 5, 10, 20 i 40 mg/l. Strzykawka do HPLC o objętości 25 µl. Cylinder miarowy 50 ml. 3. Warunki analizy chromatograficznej HPLC (ćwiczenie wykonywane w sali 46) Chromatograf cieczowy PERKIN ELMER 200 lc jest połączony z detektorem spektrofotometrycznym UV-Vis seria 200 oraz dozownikiem typu zaworu z pętlą o objętości 100 µl. Do analizy zostanie wykorzystana kolumna analityczna o wymiarach 150 4,6 mm (firmy SUPELCO). Wypełnienie stanowi żel krzemionkowy z chemicznie związanymi grupami oktadecylowymi, czyli tzw. faza odwrócona RP-18. Średnica ziaren - 5 µm. Fazą ruchomą jest mieszanina: 0,1% wodny roztwór H 3 PO 4 /acetonitryl w stosunku 70:30 (v/v); rozdział izokratyczny. Prędkość przepływu fazy ruchomej: 0,5 ml/min. Należy używać rurki teflonowej D oznaczonej solvent D. Czas analizy 15 minut. Przed rozpoczęciem analiz należy przemyć kolumnę fazą ruchomą w ciągu minimum 30 minut aż do uzyskania stabilnej linii zerowej (przepływ 0,5 ml/min). Po zakończeniu analiz należy koniecznie przemyć kolumnę wodą (wcześniej odgazowaną) w ciągu minimum 30 minut aż do uzyskania stabilnej linii zerowej i pozostawić napełnione wodą rurki teflonowe zakończone filtrami zanurzone w wodzie. Uwaga: nie wolno doprowadzić do zapowietrzenia pomp poprzez zaciągnięcie powietrza przez rurki, używanie nieodgazowanych rozpuszczalników lub pozostawienie rurek, które nie są zanurzone w odpowiedniej ilości cieczy. 3
4. Odczynniki i sprzęt laboratoryjny (ćwiczenie wykonywane w sali 46) Roztwór 0,1% H 3 PO 4 w 1 litrze wody wykonany poprzez rozpuszczenie 1 ml 85% H 3 PO 4 w 1 litrze wody. Faza ruchoma o składzie: 0,1% wodny roztwór H 3 PO 4 /acetonitryl w stosunku 70:30 (v/v). Fazę ruchomą należy przed użyciem odgazować przez 15 min w łaźni ultradźwiękowej (250 ml). Roztwór podstawowy benzoesanu denatonium o stężeniu równym 2 mg/ml. Roztwory wzorcowe benzoesanu denatonium w etanolu o stężeniach równych: 0, 5, 10, 20 i 40 mg/l. Acetonitryl do mycia strzykawek (25 ml). Strzykawka do HPLC o objętości 100 µl. Cylinder miarowy 50 ml. 5. Wykonanie oznaczenia a. Przed każdą analizą należy przemyć strzykawkę oraz pętlę dozownika kilkakrotnie rozpuszczalnikiem a następnie jednokrotnie badaną próbką. Uwaga: dozując próbkę za pomocą strzykawki nie wolno wprowadzić do dozownika bąbli powietrza. b. Wykonać analizy HPLC roztworów wzorcowych benzoesanu denatonium o stężeniach równych: 0, 5, 10, 20 i 40 mg/l w kolejności od najniższego stężenia do najwyższego. Z otrzymanego chromatogramu odczytać czas retencji substancji wzorcowej oraz pole powierzchni piku chromatograficznego. Analizę danego roztworu wykonać trzykrotnie. Wyniki analiz przedstawić w Tabeli 1. Obliczyć średni czas retencji wzorca benzoesanu denatonium oraz jego przedział ufności. c. Narysować wykres zależności pola powierzchni piku chromatograficznego (A) od stężenia benzoesanu denatonium (c): A = f(c). Obliczyć równanie prostej opisującej krzywą wzorcową metodą najmniejszych kwadratów. d. Wykonać analizy HPLC próbek skażonego alkoholu etylowego. Porównując czasy retencji pików na otrzymanym chromatogramie próbki alkoholu etylowego z czasem 4
retencji wzorca benzoesanu denatonium należy zidentyfikować pik chromatograficzny analitu. Z otrzymanego chromatogramu odczytać czas retencji analitu oraz pole powierzchni piku chromatograficznego. Analizę danego roztworu wykonać trzykrotnie. Wyniki analiz przedstawić w Tabeli 2. e. Korzystając z wcześniej wyznaczonej krzywej wzorcowej obliczyć zawartość benzoesanu denatonium w badanych próbkach alkoholu etylowego i zamieścić wyniki w Tabeli 3. Wyniki porównać z wytycznymi zawartymi w Rozporządzeniu Ministra Finansów z dnia 10 października 2007 r. W sprawozdaniu należy dokładnie opisać sposób wykonania analizy zwracając uwagę na analizę jakościową oraz analizę ilościową, ponadto należy zamieścić wszystkie wykonane obliczenia oraz wyniki. Analizy chromatograficzne roztworów wzorcowych oraz próbek badanych należy udokumentować poprzez zamieszczenie w tekście sprawozdania odpowiednio opracowanych chromatogramów. Tabela 1. Wyniki analizy chromatograficznej HPLC roztworów wzorcowych benzoesanu denatonium Roztwór Stężenie c [mg/l] 1 5 Czas retencji [min] Pole powierzchni piku A Średnie pole powierzchni piku 2 10 3 20 4 40 5
Tabela 2. Wyniki analizy chromatograficznej HPLC próbek skażonego alkoholu etylowego Próbka Czas retencji [min] Pole powierzchni piku A Średnie pole powierzchni piku 1 2 3 4 Tabela 3. Wyniki oznaczenia zawartości benzoesanu denatonium w próbkach skażonego alkoholu etylowego Nr próbki Stężenie benzoesanu denatonium [mg/l] 1 2 3 4 Zakres wymagań: 1. Wysokosprawna chromatografia cieczowa. 2. Detektor spektrofotometryczny UV/Vis, prawo Lamberta-Beera, absorpcja promieniowania UV przez związki organiczne. Literatura: 1. Szczepaniak W., Metody instrumentalne w analizie chemicznej, PWN, W-wa, 1996. 2. Witkiewicz Z., Podstawy chromatografii, WNT, W-wa, 1995, 2005. 6