MIKROBIOLOGIA w medycynie, przemyśle i ochronie środowiska II edycja Łódź 2011
Książka konferencyjna Mikrobiologia w Medycynie, Przemyśle i Ochronie Środowiska, II edycja Organizator Instytut Mikrobiologii, Biotechnologii i Immunologii Wydział Biologii i Ochrony Środowiska, Uniwersytet Łódzki ul. Banacha 12/16, 90-237 Łódź tel.: +42 635 44 63, fax: +42 665 58 18 inmik@biol.uni.lodz.pl, http://biol.uni.lodz.pl/ Współorganizatorzy Komitet Mikrobiologii Polskiej Akademii Nauk Polskie Towarzystwo Mikrobiologów Komitet Organizacyjny prof. dr hab. Barbara Różalska mgr Aleksandra Budzyńska mgr Marcin Grzybowski mgr Kinga Ostrowska mgr Małgorzata Paszkiewicz mgr Karolina Rudnicka mgr Piotr Szpakowski mgr Marcin Włodarczyk studenci zrzeszeni w Sekcji Mikrobiologicznej SKNB UŁ Komitet Naukowy prof. dr hab. Wiesława Rudnicka prof. dr hab. Henryka Długońska prof. dr hab. Jerzy Długoński prof. dr hab. Jarosław Dziadek prof. dr hab. Adam Jaworski prof. dr hab. Magdalena Mikołajczyk-Chmiela prof. dr hab. Barbara Różalska prof. dr hab. Antoni Różalski Skład i projekt okładki mgr Marcin Grzybowski Druk Drukarnia Uniwersytetu Łódzkiego 2
Podziękowania Składamy serdeczne wyrazy wdzięczności Sponsorom za wsparcie finansowe, bez którego niniejsza konferencja nie mogłaby zostać zrealizowana. Pragniemy podziękować również Patronom Medialnym i Partnerom za profesjonalną współpracę przy promocji konferencji. Serdecznie Państwu dziękujemy, Komitet Organizacyjny Sponsor główny BRUKER Polska Sp. z o.o. Sponsor strategiczny MAXIMUS, Polskie Agarozy Pozostali sponsorzy ABE-IPS sp. z o.o. A.G.A. Analytical Alab Sp. z o.o. BIOCORP Polska Sp. z o.o. GRASO Biotech PZ HTL S.A. Olympus Polska sp. z o.o. PZO Sp. z o.o. Patronat honorowy Urząd Marszałkowski w Łodzi Patroni medialni Biotechnolog.pl Biotechnologia.pl Biolog.pl Mikrobiolodzy.pl LAB-ALL.COM Czasopismo LAB Laboratorium Przegląd Ogólnopolski LSI Laboratoryjny Serwis Informacyjny INVESTIN Kombinatorium Fundacja Zaawansowanych Technologii Partnerzy MERCK Grafika Multimedia Internet www.mariuszoracz.pl 3
4
Spis treści Harmonogram konferencji 6 Streszczenia prezentowanych prac Sesja I Nowe metody diagnostyki chorób zakaźnych człowieka i zwierząt. Metody badawcze Sesja II Zakażenia bakteryjne, czynniki patogenności drobnoustrojów oraz nowe metody leczenia zakażeń Sesja III Wyzwania, nadzieje i nowe kierunki w biotechnologii i mikrobiologii środowiskowej Sesja IV Nowe zagadnienia z zakresu genetyki, biochemii i biologii molekularnej mikroorganizmów 9 29 65 101 Alfabetyczny indeks autorów 121 5
Harmonogram konferencji Dzień I (sobota, 22 X 2011) 08.00 10.00 Rejestracja uczestników 10.00 10.30 Uroczyste otwarcie konferencji Sesja I Nowe metody diagnostyki chorób zakaźnych człowieka i zwierząt. Metody badawcze (prowadzący: prof. Magdalena Mikołajczyk-Chmiela, Bartłomiej Micota) 10.30 11.15 Wykład plenarny: Metody immunologiczne w diagnostyce infekcji wirusowych i pasożytniczych, prof. H. Długońska 11.15 11.45 Prezentacja firmy BRUKER Polska Sp. z o.o.: MALDI Biotyper Microbial Identification for the 21 st Century, dr Guido Mix 11.45 12.15 Przerwa kawowa 12.15 12.30 Metoda gradientowo-dyfuzyjna w modyfikacji własnej. Ocena synergizmu leków przeciwgrzybiczych i olejków eterycznych, mgr A. Budzyńska 12.30 12.45 Wykrywanie obecności pałeczek Salmonella sp. w mięsie z zastosowaniem immunoenzymatycznej metody VIDAS Salmonella Xpress, mgr inż. W. Chajęcka-Wierzchowska 12.45 13.00 OMP-34 białko błony zewnętrznej Shigella flexneri 3a jako uniwersalny marker diagnostyczny zakażeń pokarmowych, mgr A. Jarząb 13.00 13.15 Nowoczesna metoda diagnostyki ukrytego zakażenia wirusa wątroby typu B, N. Kurantowicz 13.15 14.30 Przerwa obiadowa 14.30 15.15 Sesja plakatowa (wspólna dla sesji I i II) Sesja II Zakażenia bakteryjne, czynniki patogenności drobroustrojów oraz nowe metody leczenia zakażeń (prowadzący: prof. Henryka Długońska, Artur Ruszczak) 15.15 16.00 Wykład plenarny: Patogeneza zakażeń z udziałem biofilmów możliwości interwencji, dr hab. B. Sadowska 16.00 16.30 Przerwa kawowa 16.30 16.45 Rola oksydazy cholesterolowej Mycobacterium tuberculosis w infekcji ludzkich makrofagów prątkami gruźlicy, mgr M. Brzezińska 16.45 17.00 Formy morfologiczne H. pylori i ich przypuszczalna rola w transmisji zakażeń, M. Graczykowski 17.00 17.15 Izolacja i charakterystyka środowiskowych bakteriofagów wykazujących aktywność lityczną wobec wielolekoopornych szczepów Klebsiella sp., mgr A. Kęsik-Szeloch 6
17.15 17.30 Poszukiwanie zwierzęcego rezerwuaru enterokrwotocznych szczepów E. coli (EHEC), A. Solecka 17.30 17.45 Podsumowanie pierwszego dnia konferencji 20.00 Impreza integracyjna Dzień II (niedziela, 23 X 2011) Sesja III Wyzwania, nadzieje i nowe kierunki w biotechnologii i mikrobiologii środowiskowej (prowadzący: dr hab. Katarzyna Lisowska, Adam Janowski) 09.00 09.45 Wykład plenarny: Pozytywne i negatywne skutki aktywności degradacyjnej drobnoustrojów w środowisku, prof. J. Długoński 09.45 10.15 Przerwa kawowa 10.15 10.30 Nanosrebro w kosmetykach i produktach chemii gospodarczej fakt czy chwyt marketingowy?, K. Juś 10.30 10.45 Wpływ czynników Nod na kiełkowanie i wzrost wyki oraz wydajność symbiozy w układzie Rhizobium leguminosarum bv. viciae Vicia villosa cv. Wista, mgr D. Kidaj 10.45 11.00 Biosynteza nanocząstek srebra z wykorzystaniem grzybów w warunkach in vitro, mgr A. Ogar 11.00 11.15 Zastosowanie wielowarstwowych nanorurek węglowych do ekstrakcji patuliny z soków jabłkowych metodą SPE, mgr inż. A. Śliwińska 11.15 12.00 Sesja plakatowa (wspólna dla sesji III i IV) 12.00 13.15 Przerwa obiadowa Sesja IV Nowe zagadnienia z zakresu genetyki, biochemii i biologii molekularnej mikroorganizmów (prowadzący: dr hab. Paweł Stączek, mgr Aleksandra Strzelczyk) 13.15 14.00 Wykład plenarny: Poszukiwania nowych tarcz dla leków przeciwdrobnoustrojowych, prof. J. Dziadek 14.00 14.15 Kasety DIY podstawa do konstrukcji nowych narzędzi genetycznych dla Alphaproteobacteria, mgr M. Adamczuk 14.15 14.30 Zastosowanie metody RAPD w oparciu o sekwencje mikrosatelitarne do różnicowania szczepów M. canis izolowanych od ludzi i zwierząt w Polsce, mgr J. Dębska 14.30 14.45 Charakterystyka mykobakterialnej primazy DnaG jako miejsca docelowego dla nowych leków przeciwgruźliczych, mgr A. Kuroń 14.45 15.00 Izolacja aktywności przeciwdrożdżowych i przeciwprątkowych z endosymbiotycznych dla dżdżownicy Dendrobaena veneta bakterii Raoultella ornithinolytica, K. Pernach 15.00 15.45 Uroczyste zamknięcie konferencji oraz wręczenie nagród i wyróźnień 7
8
Sesja I Nowe metody diagnostyki chorób zakaźnych człowieka i zwierząt. Metody badawcze 9
10
Wykład plenarny Metody immunologiczne w diagnostyce infekcji wirusowych i pasożytniczych Długońska H. Katedra Immunologii i Biologii Infekcyjnej, Uniwersytet Łódzki e-mail: hdlugo@biol.uni.lodz.pl Laboratoryjna diagnostyka chorób wirusowych i pasożytniczych obejmuje szeroką paletę metod, wśród których bardzo znaczącą rolę odgrywają metody immunologiczne. Metody te mają charakter uniwersalny, bowiem mogą służyć do wykrywania zarówno czynnika infekcyjnego, jak i produktów wzbudzonej przez niego nabytej odpowiedzi immunologicznej: humoralnej (swoistych przeciwciał) oraz komórkowej (swoistych limfocytów T). W postępowaniu diagnostycznym wykorzystuje się najczęściej oznaczanie obecności i poziomu swoistych przeciwciał przeciw wirusom oraz pasożytom w surowicy krwi badanej osoby lub zwierzęcia. Metody te jako pośrednie obarczone są z natury pewnymi ułomnościami, dlatego też interpretacja otrzymanych wyników powinna być rozważna, a zatem wymaga dobrze wykształconego i doświadczonego personelu laboratoryjnego. Niektóre ze stosowanych obecnie w laboratoriach wirusologicznych i parazytologicznych metod immunodiagnostycznych są używane w prawie niezmienionej formie od kilkudziesięciu lat (np. odczyn neutralizacji wirusów w diagnostyce wścieklizny czy odczyn cytolizy Sabina-Feldmana w diagnostyce toksoplazmozy). Inne metody, jak np. liczne techniki immunochromatografii, zostały opracowane i wprowadzone w ostatnich latach. Cieszą się one dużym powodzeniem głównie dlatego, że spełniają kryteria tzw. szybkiej diagnostyki, w której otrzymuje się na wynik w ciągu kilku-kilkunastu minut. Idealny test diagnostyczny powinien być nieinwazyjny dla pacjenta, czuły, swoisty, tani, nieuciążliwy dla diagnostów i szybki. Powinien precyzyjnie odpowiadać na postawione cele badania, wnosząc m.in. informacje, co do fazy infekcji, profilu wytworzonej odpowiedzi immunologicznej (wskaźnika istnienia lub braku ochronnej odporności) i skuteczności zastosowanej terapii. Stałe udoskonalanie i wprowadzanie do praktyki nowych testów świadczy o dążeniu do opracowania metod zbliżonych do ideału. Wśród różnorodnych metod immunologicznych pierwszoplanowy udział mają techniki immunoenzymatyczne, używane z reguły do wykrywania swoistych przeciwciał w surowicy pacjenta, rzadziej do wykrywania antygenów wirusów lub pasożytów i rzadko do wykazania obecności swoistych kompleksów antygen-przeciwciało. Dominująca w tej grupie metod technika ELISA jest prosta, tania, może być zastosowana niemal w każdym laboratorium, poddaje się automatyzacji i nadaje do badań przesiewowych, ale wiele testów komercyjnych ELISA odznacza się niezadowalającą czułością i swoistością. Celem wykładu jest przedstawienie technik immunologicznych na przykładzie diagnostyki kilku wybranych infekcji wirusowych i inwazji pasożytniczych. Metody te mają różną wartość diagnostyczną, dlatego czasem wymagają łącznego zastosowania, a z pewnością zawsze krytycznej interpretacji wyników przez personel laboratorium. 11
Nadesłane streszczenia I-1 P Antygeny ESAT-6 i CFP 10 w rozpoznaniu zakażenia Mycobacterium tuberculosis Borkowska D., Zwolska Z., Augustynowicz-Kopeć E. Zakład Mikrobiologii, Instytut Gruźlicy i Chorób Płuc, Warszawa e-mail: d.borkowska@igichp.edu.pl Wstęp: Ogromny postęp w dziedzinie genetyki umożliwił otrzymanie w formie rekombinowanej dwóch specyficznych antygenów prątka gruźlicy ESAT-6 i CFP 10. Białka te kodowane są przez region RD-1 genomu Mycobacterium tuberculosis, którego brak w genomie Mycobacterium bovis BCG i większości prątków środowiskowych. Nowe metody diagnostyczne umożliwiające rozpoznanie zakażenia prątkiem gruźlicy oparte są na specyficznych antygenach, dzięki którym możliwe jest wyeliminowanie reakcji krzyżowej z szczepionką BCG i prątkami niegruźliczymi MOTT. Obecnie na rynku są dostępne dwa, komercyjne testy IGRA (interferon-γ release assay): QuantiFERON-TbGold i T-SPOT.TB. Cel: Celem pracy była ocena przydatność diagnostycznej nowego testu IGRA T-SPOT.TB w rozpoznaniu zakażenia prątkiem gruźlicy. Metody: Zakażenie prątkiem gruźlicy diagnozowano przy użyciu próby tuberkulinowej i testu T-SPOT.TB wykorzystującego metodę ELISpot. Test IGRA wykonano z krwi obwodowej oceniając liczbę limfocytów T, które po stymulacji antygenami ESAT-6 i CFP 10 wydzielały IFN-γ. Wyniki: W badaniach wykazano częściową rozbieżność wyników uzyskanych za pomocą próby tuberkulinowej i testu IGRA. Niezgodność typu TST(dodatni)/T.SPOT.TB(ujemny) mogła być związana z krzyżową reakcją ze szczepieniem BCG lub zakażeniem prątkami MOTT. Drugi typ niezgodności TST(ujemny)/T- SPOT.TB(dodatni) stwierdzono u pacjentów w podeszłym wieku i złym stanie zdrowia, co mogło być przyczyną braku reakcji skórnej na tuberkulinę. Stwierdzono, że liczba pozytywnych wyników testów IGRA wzrastała wraz ze wzrastającą wartością średnicy nacieku odczynu tuberkulinowego. Wnioski: Zaletą testu T-SPOT.TB (Oxford Immunotec, Wielka Brytania) jest wykorzystanie specyficznych antygenów ESAT-6 i CFP 10 kodowanych przez region RD1 genomu prątka gruźlicy. Dzięki ich zastosowaniu T-SPOT.TB jest obarczony mniejszym błędem w kierunku rozpoznania zakażenia M. tuberculosis. W naszej ocenie test IGRA T-SPOT.TB może być stosowany obok próby tuberkulinowej i testu Quanti- FERON-TbGold jako test pomocniczy w rozpoznaniu zakażenia prątkiem gruźlicy. I-2 P/O Metoda gradientowo-dyfuzyjna w modyfikacji własnej. Ocena synergizmu leków przeciwgrzybiczych i olejków eterycznych Budzyńska A., Różalska B. Instytut Mikrobiologii, Immunologii i Biotechnologii, Uniwersytet Łódzki e-mail: albudzal@biol.uni.lodz.pl Wstęp: W świetle faktu narastania lekooporności grzybów i częstego braku skuteczności wdrożonej chemioterapii zakażeń, lecznicze wykorzystanie fitozwiązków ma aktualnie coraz większe znaczenie. Ich poszukiwanie obejmuje identyfikację preparatów o bezpośrednim działaniu grzybobójczym, modulujących lekooporność lub działających synergistycznie albo addytywnie do klasycznych leków. Zachodzi więc potrzeba dysponowania prostą metodą skryningową służącą do znalezienia związków naturalnych o takich pożądanych cechach. Cel: Ocena wrażliwości drożdżaków z rodzaju Candida na wybrane leki przeciwgrzybicze, w ich połączeniu z olejkami eterycznymi. Ustalenie parametrów metodycznych badania. Metody: Badano synergizm działania worykonazolu oraz flukonazolu z olejkiem geraniowym, goździkowym i ze składnikami olejków: cytronelalem i cytralem, wobec C. albicans ATCC 10231 i C. glabrata G1 (szczep kliniczny). Fitozwiązki użyto w ich stężeniach subinhibicyjnych - w fazie nielotnej (metoda rozcieńczeń w agarze Sabouraud a) i w fazie lotnej (kontrolowana ilościowo mikroatmosfera nad podło- 12
żem z posiewem powierzchniowym). Synergizm oceniano stosując komercyjny test paskowy MIC Test Strip (LiofilChem, Włochy). Wyniki: Wykazano przydatność powyższej zmodyfikowanej metody w ocenie synergizmu leków przeciwgrzybiczych i olejków eterycznych oraz ich składników. Z uwagi na zastosowanie standardowych pasków z gradientem stężeń chemioterapeutyku, zaproponowana metodyka pozwala w sposób wiarygodny zauważyć nawet niewielką zmianę wartości MIC, odzwierciedlającą efekt synergizmu. W metodzie rozcieńczeń w agarze, subinhibicyjne stężenie olejku geraniowego spowodowało 20-25 krotny spadek wartości MIC obu leków wobec C. albicans. Podobny stopień redukcji MIC leków uzyskano w badaniu wrażliwości C. glabrata. Cytronelal i cytral użyte w stężeniach ½ MIC również działały skutecznie, choć słabiej. Olejki eteryczne/składniki zastosowane w fazie lotnej wykazywały też działanie synergistyczne - uzyskany efekt był nieco niższy, jednakże znaczący. Wnioski: Zastosowana metodyka skryningowego badania synergizmu może być równie użyteczna w ocenie skuteczności połączeń dowolnych antybiotyków, antyseptyków i nowych związków o potencjalnej aktywności wobec grzybów i bakterii. I-3 P Ocena działania wybranych olejków eterycznych, w fazie nielotnej/lotnej, na hodowle biofilmowe Candida albicans i Staphylococcus aureus. Własne rozwiązania metodyczne Budzyńska A., Sadowska B., Paszkiewicz M., Różalska B. Instytut Mikrobiologii, Immunologii i Biotechnologii, Uniwersytet Łódzki e-mail: albudzal@biol.uni.lodz.pl Wstęp: Z uwagi na znaną wysoką lekooporność biofilmów, wypracowanie standardów alternatywnego leczenia zakażeń przebiegających z ich udziałem jest wyzwaniem nowoczesnej mikrobiologii i medycyny. Stąd, wzrasta zainteresowanie badaniem skuteczności bezpośredniej różnych czynników biobójczych pochodzenia naturalnego lub ich połączeń z antybiotykami. W celu ewaluacji efektu ich działania na biomasę drobnoustrojów stosuje się różnorodne techniki barwienia - polimeru pozakomórkowego biofilmu albo samych komórek. Istnieje jednak wciąż potrzeba opracowania nowych lub modyfikacji znanych testów oceny żywotności biofilmu. Powinny one być dostosowane do charakteru fizyko-chemicznego badanych związków a jednocześnie oparte o prostą procedurę, minimalizującą ryzyko uszkodzenia biofilmu podczas barwienia. Cel: Opracowanie testu oceny efektu działania olejków eterycznych na biofilm bakterii i grzybów. Metody: Na insertach umieszczonych w 24-studzienkowej płytce hodowlanej zakładano biofilmy S. aureus ATCC 6538 i C. albicans ATCC 10231 (24-godzinne). Następnie poddano je bezpośredniemu działaniu olejku goździkowego (przez zanurzenie insertu w roztworze olejku) lub działaniu frakcji lotnej olejku (bez kontaktu bezpośredniego faz). Po 4-ro godzinnej inkubacji, biofilmy drobnoustrojów na insertach barwiono MTT (ocena ilościowa - odczyt spektrofotometryczny), wyznaczając stężenie powodujące co najmniej 50% redukcję aktywności metabolicznej drobnoustrojów (MBEC50). Wyniki: Stwierdzono, że olejek goździkowy, jak również jego lotne składniki, wykazują aktywność przeciwbiofilmową. MBEC50 fazy płynnej olejku wobec biofilmu S. aureus ATCC 6538 i C. albicans ATCC 10231 utworzonego na membranie insertów wynosiło 31 l ml -1, natomiast aktywność frakcji lotnej - 31 l ml -1 dla biofilmu S. aureus i 62 l ml -1 dla biofilmu C. albicans. W kolejno wykonanych doświadczeniach uzyskano wysoką powtarzalność wyników, tym samym uznano opracowaną metodykę za przydatną w dalszych planowanych badaniach z tego zakresu. Wnioski: Proponowany model oceny in vitro efektywności przeciwbiofilmowej olejków, z zastosowaniem membranowych insertów do płytek hodowlanych, zapewnia minimalne naruszenie jego integralności podczas badania. Pozwala na łatwe zbadanie aktywności frakcji lotnej tych preparatów, ułatwia ustalenie kinetyki ich działania oraz umożliwia analizę jakościową i ilościową produktów metabolizmu populacji biofilmowej, uwalnianych do podłoża wzrostu. 13
I-4 P/O Wykrywanie obecności pałeczek Salmonella sp. w mięsie z zastosowaniem immunoenzymatycznej metody VIDAS Salmonella Xpress Chajęcka-Wierzchowska W., Zadernowska A., Kłębukowska L., Łaniewska-Trokenheim Ł. Katedra Mikrobiologii Przemysłowej i Żywności, Wydział Nauki o Żywności, Uniwersytet Warmińsko-Mazurski w Olsztynie e-mail: wioleta.chajecka@uwm.edu.pl Wstęp: Celem przyspieszenia wykrywania drobnoustrojów patogennych w żywności jako alternatywę czasochłonnych badań opracowuje się nowe szybkie metody. Stosuje się metody hybrydyzacji, reakcje łańcuchowe polimerazy i wiele metod opartych na reakcjach immunoenzymatycznych m. in. system mini VIDAS (biomérieux). Testy VIDAS Salmonella Xpress (SLMX) opierają się na wykrywaniu w badanej próbce specyficznych antygenów, wykorzystując reakcję typu ELFA z końcowym odczytem fluorescencji. Cel: Celem badań było określenie przydatności metody do oznaczania obecności pałeczek Salmonella sp. w mięsie drobiowym (mimo braku walidacji na tego rodzaju matryce) z wykorzystaniem procedury opracowanej w laboratorium Katedry Mikrobiologii Przemysłowej i Żywności. Metody: W badaniu zastosowano wyizolowane z drobiu szczepy Salmonella Typhimurium oraz Salmonella Enteritidis. Materiałem do badań było mięso drobiu rzeźnego: kaczek, indyków, gęsi oraz kurcząt zakupione w sieci detalicznej. Mięso kontaminowano pałeczkami, tak aby uzyskać trzy poziomy zanieczyszczenia: wysoki (rzędu 1000 kom/25g), średni (rzędu 100 kom/25g) oraz niski (rzędu 10 kom/25g). Jednocześnie określano tzw. matrycę produktu oznaczając ogólną liczbę bakterii mezofilnych tlenowych oraz pałeczek z rodziny Enterobacteriaceae. Po kontaminacji próbek pałeczkami Salmonella, przeprowadzano analizę z użyciem aparatu mini Vidas i równolegle dalsze etapy badań zgodnie z PN-ISO-6579:2003. Wyniki: Wyniki zarówno w metodzie hodowlanej jak i przy użyciu aparatu były zależne od rodzaju badanego mięsa oraz od mikrobiologicznego zanieczyszczenia surowca. Testy zdecydowanie lepiej sprawdzały się dla mięsa o niższej matrycy tj. mięsa kaczki i gęsi. W pozostałych próbach obecność mikroflory towarzyszącej stanowiła konkurencję dla wprowadzanych do próbki pałeczek Salmonella. W takich przypadkach aparat wskazywał na wyniki fałszywie dodatnie. Wnioski: Czas trwania analizy przy użyciu urządzenia mini- VIDAS był zdecydowanie krótszy niż w przypadku procedury ISO 6579. Analiza, bez konieczności wykonywania potwierdzeń zajmowała 20-26 godzin. Badania wykazały 100% czułość testów VIDAS Salmonella Xpress (SLMX) dla wszystkich rodzajów badanego mięsa. Względna specyficzność oraz dokładność metody zależne były od rodzaju badanego mięsa oraz od mikrobiologicznego zanieczyszczenia surowca. I-5 P Żywność, jako potencjalne źródło występowania opornych na antybiotyki szczepów Enterococcus ssp. i Staphylococcus ssp. Chajęcka-Wierzchowska W.*, Sierpińska M., Łaniewska-Trokenheim Ł. Katedra Mikrobiologii Przemysłowej i Żywności, Wydział Nauki o Żywności, Uniwersytet Warmińsko-Mazurski w Olsztynie e-mail: wioleta.chajecka@uwm.edu.pl Wstęp: W ostatnich latach obserwowany jest systematyczny wzrost liczby szczepów opornych na antybiotyki w otoczeniu człowieka. Podejrzewa się, że żywność może pełnić znaczącą rolę w rozprzestrzenianiu drobnoustrojów opornych. Dotychczas prace z tego zakresu dotyczyły występowania szczepów opornych na antybiotyki w surowcach zarówno pochodzenia zwierzęcego jak i roślinnego. Niewiele istnieje publikacji dotyczących występowania szczepów opornych na antybiotyki w żywności gotowej do spożycia. Cel: Celem badań było określenie oporności na antybiotyki szczepów Enterococcus ssp i Staphylococcus ssp izolowanych z żywności gotowej do bezpośredniego spożycia oferowanej w sprzedaży detalicznej, spełniającej wymagania jakościowe. Materiał i metody: Próbki żywności: sery 14
dojrzewające, wędliny, ryby po wstępnym namnożeniu na podłożu bulionowym z glukozą, przesiewano na podłoża: RPF (izolacja Staphylococcus ssp) i Slanetz a (Enterococcus ssp). Inkubację prowadzono w temperaturze 37 o C przez 24 godz. Oporność na antybiotyki wyizolowanych szczepów określono zgodnie z wytycznymi NCCLS ( National Committee for Clinical Laboratory Standars). Do określenia oporności stosowano standardowe podłoże Müellera-Hintona. Antybiogram szczepów z rodzaju Enterococcus ssp. obejmował 16 antybiotyków: penicylinę, ampicylinę, streptomycynę, gentamicynę, tetracyklinę, tigecyklinę, wankomycynę, teikoplaninę, ciprofloksacynę, norfloksacynę, lewofloksacynę, linezolid, chloramfenikol, rifampicynę, nitrofurantoinę, fosfomycynę, chinupristynę/dalfopristynę. Antybiogram szczepów z rodzaju Staphylococcus ssp. obejmował 14 antybiotyków: erytromycynę, klindamycynę, cefoksytynę, norfloksacynę, nitrofurantoinę, trimetoprim/sulfaketoksazol, tetracyklinę, chloramfenikol, ciprofloksacynę, rifampicylinę, gentamycynę, linezolid, oraz qinaprystynę/dalfoprystynę. Wyniki: Ze 169 próbek żywności pochodzenia zwierzęcego: sery dojrzewające (82 próbki), wędliny (58 próbek), ryby i wyroby z ryb (29 próbek), wyizolowano 115 szczepów Enterococcus ssp oraz 42 szczepy Staphylococcus ssp. Szczepy z rodzaju Enterococcus ssp. były oporne na tetracykliny (tetracyklina, tigecyklina), wysokie stężenia aminoglikozydów (szczególnie na streptomycynę), fosfomycynę, rifampicynę oraz chinupristynę/dalfopristynę. Pojedyńcze szczepy były oporne na linezolid, chloramfenikol, nitrofurantoinę, rifampicynę i teikoplaninę. Wszystkie badane szczepy były wrażliwe na wankomycynę i ciprofloksacynę. Szczepy z rodzaju Staphylococcus ssp. były oporne na klindamycynę, cefoksytynę, trimetoprim/sulfaketoksazol, norfloksacynę oraz chloramfenikol. Wśród izolatów wstępowały szczepy wielooporne. * Autor otrzymał stypendium współfinansowane przez Unię Europejską w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego. Badania były współfinansowane przez grant Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa Wyższego (N N312 236138). I-6 P Liczebność bakterii z rodzajów Clostridium, Lactobacillus i Enterococcus (typ Firmicutes) w kale dzieci w wieku od 5 do 14 lat Gajek A., Lewandowska M. Instytut Technologii Fermentacji i Mikrobiologii, Wydział Biotechnologii i Nauk o Żywności, Politechnika Łódzka e-mail: anna.gajek@edu.p.lodz.pl, malgorzata.lewandowska@edu.p.lodz.pl Wstęp: W zespole mikroorganizmów jelitowych zdrowego, dorosłego człowieka dominującymi są gatunki bakterii należące do typów Firmicutes i Bacteroidetes, które stanowią ponad 90% całej flory jelitowej człowieka. Skład mikroflory jelitowej zależy od wielu czynników, m.in. wieku, diety, przebytych chorób. Liczebność bakterii z rodzaju Bifidobacterium oraz Clostridium jest większa w jelitach dzieci niż u dorosłych. Ponieważ 80% bakterii tworzących mikroflorę jelitową to mikroorganizmy niehodowlane, dlatego obok metod hodowlanych stosuje się metody biologii molekularnej, takie jak fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH). Cel pracy: Celem pracy jest zbadanie liczebności bakterii z rodzajów Clostridium, Lactobacillus i Enterococcus w kale dzieci w wieku 5-14 lat. Metody: Materiałem badanym był kał niemrożony, 48h po pobraniu, pochodzący od 10 zdrowych dzieci w wieku 5-14 lat. Analizę przeprowadzono metodami hodowlanymi, stosując selektywnie namnażające podłoża: DRCM dla Clostridium, Rogosa dla Lactobacillus i agar z żółcią, eskuliną i azydkiem dla Enterococcus. Próby kału rozcieńczano w zbuforowanej wodzie peptonowej. Równolegle liczebność bakterii określono metodą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) z wykorzystaniem dwóch sond molekularnych - dla Clostridium (Erec 484) i Lactobacillus-Enterococcus (Lab 158). Wyniki: Liczba Clostridium w kale dzieci w wieku 5-14 lat określona metodami hodowlanymi wynosiła 10 7-10 8 jtk/g mokrej masy, natomiast liczba bakterii z rodzajów Lactobacillus i Enterococcus wynosiła 10 5-10 9 jtk/g mokrej masy i nie była zależna od wieku dzieci. Liczba Clostridium określona metodą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ była dwa rzędy wielkości wyższa i wynosiła 10 9-15
10 10 kom/g mokrej masy kału. Liczba Lactobacillus i Enterococcus określona tą samą metodą wynosiła 10 10-10 11 kom/g. Również analiza metodą FISH nie wykazała zależności liczebności bakterii od wieku. Wnioski: U dzieci w grupie 5-14 lat wiek nie wpływa na liczebność bakterii z rodzajów Clostridium, Lactobacillus i Enterococcus w kale. Metoda fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ pozwala na oznaczenie od 10 2 do 10 5 razy większej liczby bakterii. I-7 P Wpływ dezynfektantów na właściwości chemiczne komórek bakterii Gernand A., Żakowska Z. Katedra Mikrobiologii Technicznej, Instytut Technologii Fermentacji i Mikrobiologii, Politechnika Łódzka e-mail: anna.gernand@edu.p.lodz.pl Wstęp: Tworzenie biofilmów jako wynik adhezji komórek do powierzchni jest szeroko opisane oraz poznane. Nie jest ono jednak dostatecznie wyjaśnione pod kątem zmian zachodzących pod wpływem używania środków dezynfekcyjnych powszechnych w przemyśle spożywczym. Jedną z przyczyn powstawania biofilmów wg danych literaturowych może być zmienność charakteru chemicznego zewnętrznych struktur powierzchni komórek oraz zmiana powierzchni produkcyjnych wywołana stosowanymi na co dzień środkami chemicznymi. Cel pracy: Badania maja na celu wyjaśnienie czy środki dezynfekcyjne o różnym charakterze chemicznym stosowane w przemyśle zmieniają charakter chemiczny zewnętrznych struktur komórkowych, wpływając na proces ich adhezji do polimerowych powierzchni instalacji produkcyjnych. Metody: W celu zbadania tego zjawiska użyte są środki stosowane w przemyśle browarniczym oraz winiarskim. Badania będą przeprowadzone z użyciem bakterii wyizolowanych z powierzchni urządzeń produkcyjnych po procesie mycia, które wykazują oporność na stosowane środki chemiczne. W celu zidentyfikowania tych oddziaływań zbadane zostały komórki bakteryjne pod kątem ich hydrofobowości/hydrofilowości za pomocą metody BATH (bacterial adhesion to hydrocarbons). Wyniki: Komórki bakterii wyizolowanych ze środowiska produkcyjnego były zbadane za pomocą metody BATH. Metoda ta wykazała dużą wrażliwość na śladowe ilości środków dezynfekcyjnych zawartych w badanych zawiesinach komórek. Wyniki zebrane za pomocą tej metody są trudne do zinterpretowania. Konieczne jest zastosowanie alternatywnej metody badawczej dla tego typu oddziaływań. Wnioski: Niezbędna jest wiedza dotycząca zwilżalności powierzchni komórek, ponieważ ich charakter decyduje o pierwszym etapie adhezji. Bardziej hydrofobowy charakter będzie sprzyjał tworzeniu się powłoki bakteryjnej, natomiast hydrofilowy charakter nie jest sprzyjający dla tego rodzaju procesu. W późniejszym etapie prac porównane zostaną właściwości komórek, które nie były wcześniej poddawane wpływowi środków dezynfekcyjnych z tymi, które zmieniły swój charakter pod wpływem substancji chemicznych i jaki to ma wpływ na proces adhezji. Badania te pomogą wskazać, jakiego rodzaju środki chemiczne będą bardziej efektywnie zapobiegać tworzeniu się biofilmów. I-8 P/O OMP-34 białko błony zewnętrznej Shigella flexneri 3a jako uniwersalny marker diagnostyczny zakażeń pokarmowych Jarząb A. 1, Witkowska D. 1, Szostko B. 1, Szkudlarek J. 1, Hirnle L. 2, Gamian A. 1 1 Instytut Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN, Wrocław, 2 Akademia Medyczna im. Piastów Śląskich, Wrocław e-mail: anna.jarzab@iitd.pan.wroc.pl Wstęp: Gram-ujemne pałeczki należące do rodziny Enterobacteriaceae są jednym z czynników etiologicznych zakażeń pokarmowych, które są przyczyną śmierci 1,9 miliona osób rocznie i pod względem śmiertelności zajmują trzecie miejsce wśród chorób trapiących ludzi na całym świecie. Ważnym aspek- 16
tem w zapobieganiu zakażeniom pokarmowym jest nie tylko zachowanie odpowiedniej higieny sanitarnej i skierowanie uwagi na badania dotyczące nowych leków i skutecznych szczepionek, lecz także opracowanie odpowiednich markerów umożliwiających szybką diagnostykę i monitorowanie zakażeń. Obecnie nie jest dostępny żaden test diagnostyczny, gwarantujący szybką identyfikację patogenu stanowiącego czynnik etiologiczny zatrucia, co warunkuje podjęcie skutecznego leczenia. Białko OMP-34 izolowane z błony zewnętrznej ściany komórkowej pałeczek Shigella flexneri 3a jest brane pod uwagę, jako potencjalny marker diagnostyczny, umożliwiający szybką identyfikację patogenu w próbkach biologicznych. Cel pracy: Produkcja przeciwciał monoklonalnych skierowanych na epitopy białka OMP-34 znajdujące się na powierzchni komórki bakterii S. flexneri 3a i wykorzystanie ich do opracowania testu diagnostycznego. Metody: Białka błony zewnętrznej (OMPs) pałeczek S. flexneri 3a wyizolowano przy użyciu szybkiej i wydajnej metody ekstrakcji z użyciem kwasu walerianowego. Myszy BALB/c immunizowano trzykrotnie preparatem OMPs w określonych odstępach czasu. Po izolacji komórek śledziony immunizowanej myszy przeprowadzono ich fuzję z komórkami plazmocytoma SP 2/0. Przeszukiwanie biblioteki uzyskanych klonów przeprowadzono z wykorzystaniem zarówno testu ELISA, w którym jako antygenu do opłaszczania płytek używano komórek bakteryjnych S. flexneri 3a, a także testu Western blot z wykorzystaniem preparatów białek błony zewnętrznej z różnych gatunków bakterii należących do rodziny Enterobacteriaceae oraz innych gatunków reprezentujących zarówno drobnoustroje Gram-ujemne jak i Gramdodatnie. Wyniki: Badania wykazały, że otrzymane przeciwciało monoklonalne jest skierowane na epitop białka OMP-34, eksponowany na powierzchni komórki bakteryjnej S. flexneri 3a, z której zostało wyizolowane. Testy dodatkowe pozwoliły na sformułowanie hipotezy, że epitop ten występuje także na powierzchni białek błonowych E. coli, gatunku należącego do rodziny Enterobacteriaceae, blisko spokrewnionego z S. flexneri. Wnioski: Uzyskanie swoistego przeciwciała monoklonalnego, rozpoznającego unikalne epitopy białek błonowych zlokalizowanych w błonie zewnętrznej bakterii z gatunków należących do Enterobacteriaceae, co stwarza realne szanse na opracowanie testu umożliwiającego szybką identyfikację tych patogenów w próbkach materiału biologicznego. I-9 P Markery stresu oksydacyjnego w osoczu pacjentów ze stwardnieniem rozsianym Kontek B. 1, Kulifer A. 1, Miller E. 2, Wachowicz B. 1 1 Katedra Biochemii Ogólnej, Uniwersytet Łódzki, Pomorska 141/3, 90-236 Łódź, Polska, 2 III Szpital Miejski im. K. Jonschera w Łodzi, Oddział Rehabilitacji, Milionowa 14, 93-113 Łódź, Polska e-mail: kontekb@biol.uni.lodz.pl Wstęp: Stwardnienie rozsiane (MS) jest zapalno demielinizacyjną chorobą ośrodkowego układu nerwowego, która na skutek zniszczenia osłonki mielinowej zaburza komunikację pomiędzy mózgiem a całym organizmem. Przyczyn upatruje się w czynnikach genetycznych, infekcyjnych, sposobie odżywiania (dostarczanie egzogennych antyoksydantów) oraz stresie oksydacyjnym towarzyszącym tej chorobie. Zachwianie równowagi redox i nadprodukcja reaktywnych form tlenu i azotu (RFT i RFA) prowadzi do zniszczenia kluczowych dla organizmu struktur komórkowych neuronów oraz zaburzeń w przekaźnictwie sygnałów. Cel pracy: Celem pracy było oznaczenie w osoczu chorych na stwardnienie rozsiane poziomu biomarkerów stresu oksydacyjnego peroksydacji lipidów określanych poprzez stężenie związków reagujących z kwasem tiobarbiturowym (TBARS), 3-nitrotyrozyny (3-NT) oraz grup karbonylowych w białkach osocza. Metody: Stres oksydacyjny badano poprzez pomiar stężenia grup karbonylowych w białkach przy zastosowaniu dwóch metod immunoenzymatycznych (testu ELISA i konkurencyjnego testu ELISA) oraz stężenia produktów peroksydacji lipidów - TBARS w osoczu. Wyniki: Przeprowadzone badania wykazały, że u chorych na stwardnienie rozsiane ma miejsce podwyższona peroksydacja lipidów (w porównaniu do poziomu TBARS w osoczu osób zdrowych). Oznaczanie stężenia grup karbonylowych osocza, wykazało, że w remisyjno-nawracającej postaci stwardnienia rozsianego występuje najwyższe stężenie grup karbonylowych w białkach osocza. W białkach osocza chorych na stwardnienie rozsiane 17
zanotowano także znaczny wzrost powstawania 3-NT. Wykazano również, że nadtlenoazotyn powoduje w sposób istotny statystycznie (p < 0,01) zwiększoną karbonylację i nitrowanie białek osocza osób chorych na MS w porównaniu do osób zdrowych. Wnioski: 1. Przeprowadzone badania potwierdziły udział stresu oksydacyjnego w powstawaniu zaburzeń jakie występują w poszczególnych postaciach stwardnienia rozsianego. 2. Dochodzi do oksydacyjno-nitracyjnych modyfikacji białek osocza i peroksydacji lipidów. Praca finansowana z działalności statutowej UŁ nr 506/810. I-10 P Oznaczanie parametrów stresu oksydacyjnego w osoczu chorych na raka piersi Kontek B. 1, Kędzierska M. 1, Sekret J. 1, Olas B. 1, Wachowicz B. 1, Czernek U. 2, Szydłowska-Pazera K. 2, Potemski P. 2, Piekarski J. 3, Jeziorski A. 3 1 Katedra Biochemii Ogólnej, Uniwersytet Łódzki, Pomorska 141/3, 90-236 Łódź, Polska 2 Klinika Chemioterapii Nowotworów Katedry Onkologii, Uniwersytet Medyczny, Wojewódzki Szpital Specjalistyczny im. M. Kopernika w Łodzi, Pabianicka 62, 93-513 Łódź, Polska 3 Klinika Chirurgii Onkologicznej Katedry Onkologii, Uniwersytet Medyczny, Wojewódzki Szpital Specjalistyczny im. M. Kopernika w Łodzi, Pabianicka 62, 93-513 Łódź, Polska e-mail: kontekb@biol.uni.lodz.pl Wstęp: Stres oksydacyjny towarzyszy różnorodnym schorzeniom, m.in. chorobom układu krążenia, nowotworom (rak piersi) czy chorobom neurodegeneracyjnym. Podczas stresu oksydacyjnego dochodzi do znacznego wzrostu reaktywnych form tlenu (RFT), a to w konsekwencji powoduje zniszczenie kluczowych dla organizmu struktur komórkowych. Niekontrolowany wzrost stężenia RFT inicjuje łańcuchową reakcję wolnorodnikową, w wyniku której uszkadzane są białka, lipidy, cukrowce jak również kwasy nukleinowe. Negatywne działanie stresu oksydacyjnego niejednokrotnie wyprzedza zjawiska toksyczności hematologicznej i niehematologicznej u chorych z rakiem piersi. Cel pracy: W niniejszej pracy określono poziom wybranych biomarkerów stresu oksydacyjnego w osoczu chorych na raka piersi przed i po zabiegu operacyjnym oraz podczas chemioterapii (doksorubicyna + cyklofosfamid). Uzyskane wyniki porównano z grupą kontrolną złożoną ze zdrowych kobiet. Metody: Stres oksydacyjny badano poprzez pomiar stężenia wybranych markerów: grup karbonylowych w białkach osocza metodą ELISA, oraz produktów peroksydacji lipidów - TBARS w osoczu. Wyniki: Uzyskane wyniki wykazały wzrost (ok. 20%) poziomu TBARS u kobiet chorych na raka piersi po zabiegu operacyjnym w porównaniu do osób zdrowych. Poziom grup karbonylowych w białkach osocza kobiet chorych na nowotwór piersi po zabiegu operacyjnym był także wyższy w porównaniu do białek osocza kobiet zdrowych. Wnioski: Otrzymane wstępne wyniki potwierdzają istnienie stresu oksydacyjnego u kobiet cierpiących na raka piersi. Świadczy o tym podwyższone stężenie substancji reagujących z kwasem tiobarbiturowym - TBARS oraz poziom grup karbonylowych w białkach osocza. Stres oksydacyjny jest spotęgowany przez zabieg chirurgiczny oraz stosowaną chemioterapię. Praca finansowana z działalności statutowej UŁ nr 506/810. I-11 P Czystość mikrobiologiczna powierzchni użytkowych oraz materiałów biologicznych Kubala N., Szczęsna E., Stańczyk J., Malinowska M., Stanuch M., Agier J., Ibran J., Mazurczyk M., Pali M., Mądrzak K., Micota B., Moryl M., Sadowska B. Studenckie Koło Naukowe Biologów Sekcja Mikrobiologiczna, Uniwersytet Łódzki e-mail: nkl@poczta.fm Wstęp: Przedmioty codziennego użytku mogą być rezerwuarem drobnoustrojów stanowiących zagrożenie dla człowieka. Znane są przypadki ludzi, którzy chwytają klamki jedynie przez chusteczkę. Osoby 18
cierpiące na mizofobię chorobliwie unikają zabrudzenia, często mają przy tym natręctwo kompulsywnego mycia rąk. Drobnoustroje nie żyją jedynie na powierzchniach sztucznych, ale przede wszystkim na materiałach biologicznych. Dłonie poprzez ciągły kontakt ze środowiskiem a także sprzyjające warunki na powierzchni skóry sprawiają, że są one dogodną niszą dla ich bytowania. Cel pracy: W niniejszej pracy oceniono czystość mikrobiologiczną przedmiotów codziennego użytku. Obliczono także ilość drobnoustrojów na dłoniach biorąc pod uwagę płeć oraz wiek ochotników. Metody: Zarówno powierzchnie jak i dłonie badano metodą płytek kontaktowych. Powierzchnie użykowe badano płytkami z trzema rodzajami podłóż tj. Sabourauda w kierunku grzybów, TSA aby wyznaczyć ogólną liczbę bakterii i Chapmana w kierunku gronkowców. Każdą płytkę trzymano 6 sekund na każdej z powierzchni następnie inkubowano 24h w 37 stopniach Celsjusza. Dłonie ochotników badano płytkami z podłożem TSA przytrzymując każdą przez 3 sekundy na 3 środkowych palcach. Wyniki: W przypadku powierzchni codziennego użytku najwięcej drobnoustrojów wyizolowano z klamki w męskiej toalecie. W przypadku dłoni natomiast zaobserwowano duże zróżnicowanie jeżeli chodzi o ogólną liczbę drobnoustrojów. Liczba drobnoustrojów na dłoniach jest cecha osobniczą i nie zależy ani od wieku ani od płci badanego. Wnioski: Drobnoustroje są obecne w naszym życiu codziennym, czy to na naszych dłoniach, czy też na powierzchniach, z którymi się codziennie stykamy. Następuje ciągła wymiana mikroflory pomiędzy środowiskiem nieożywionym i ożywionym. Obawa przed podaniem ręki czy dotknięciem klamki może wydawać się uzasadniona. I-12 P Markery endotoksyny w materiale biologicznym - zastosowanie chromatografii gazowej sprzężonej z tandemową spektrometrią mas Kuder P. 1, Szponar B. 2 1 Politechnika Wrocławska, Wydział Chemiczny, kierunek Biotechnologia 2 Instytut Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN we Wrocławiu e-mail: szponar@iitd.pan.wroc.pl Wstęp: Zastosowanie 3-hydroksylowych kwasów tłuszczowych (3-OH FAs) jako markerów endotoksyny daje unikalną możliwość analitycznego, ilościowego oznaczania LPSu za pomocą GC-MSMS (chromatografii gazowej sprzężonej z tandemową spektrometrią mas) w próbkach różnego pochodzenia, w tym biologicznych. Istotą metody jest ilościowe oznaczanie na specyficznych 3-OH FAs kwasy tłuszczowe tego typu występują wyłącznie w lipopolisacharydach, u bakterii Gram-ujemnych. Cel pracy: Dostosowanie metodyki oznaczania 3-OH FAs jako ilościowych markerów endotoksyny, do rodzaju badań i materiału, w którym są one oznaczane, tj. ustalenie warunków rozdziału chromatograficznego i detekcji w zakresie gradientu temperatur oraz doboru stężenia standardu wewnętrznego. Metody: Analiza standardów 3-OH FAs (C10-C18) w chromatografii gazowej sprzężonej ze spektrometrią mas, za pomocą aparatu TSQ Quantum (Thermo), wyposażonego w kolumnę kapilarną Restek Rxi-5ms oraz detektor z potrójnym kwadrupolem. Wyniki: Optymalizacja warunków analizy markerów endotoksyny została osiągnięta, wyniki dla zastosowanych standardów zewnętrznych skorelowano ze stężeniem standardu wewnętrznego. Wnioski: Wartość diagnostyczną chemicznych markerów endotoksyny wykazano w posocznicy (na modelu zwierzęcym) 1,2 oraz w monitorowaniu bakteriemii/endotoksemii u pacjentów poddawanych zabiegom kardiochirurgicznym 3. Oryginalnym podejściem diagnostycznym było zastosowanie 3-hydroksylowych kwasów tłuszczowych jako markerów zapalenia przyzębia (periodontitis) oznaczanych w ślinie pacjentów 4 oraz u chorych cierpiących na przewlekłe zapalenia jelita grubego (inflammatory bowel diseases, IBD), u których profil 3-OH FAs w stolcu okazał się charakterystyczny dla różnych wariantów choroby, ale także wskazywał na korelację między stanem flory jelitowej, określanym przez profil 3-OH FAs, a stanem klinicznym pacjentów 5. Uzyskane wyniki pozwolą na dalsze zastosowania metody, m.in. w ustaleniu wzorca profilu 3-OH FAs bakteryjnego konsorcjum jelitowego u noworodków w celu monitorowania zmian mikroflory w odniesieniu do rozwoju alergii i chorób autoimmunologicznych. 19
I-13 P/O Nowoczesna metoda diagnostyki ukrytego zakażenia wirusa wątroby typu B Kurantowicz N. Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego, Wydział Rolnictwa i Biologii, Warszawa Instytut Hematologii i Transfuzjologii, Pracownia Biologii Molekularnej Wirusów, Zakład Wirusologii, Warszawa e-mail: natalia.kurantowicz@gmail.com Wstęp: Wirus zapalenia wątroby typu B (HBV) jest niezwykle istotnym i rozpowszechnionym na świecie patogenem człowieka. Około jedna trzecia ludzkości została zainfekowana HBV, a w Azji i w Afryce ciągle odnotowywane są epidemie. W Polsce 15-20% ludzi przebyło to zakażenie w przeszłości, a 2% jest chronicznie chora. Ukryte zakażenie wirusem HB (OBI, ang., occult HBV infection) jest definiowane obecnie jako: obecność DNA HBV w wątrobie, przy wykrywalnym lub nie HBV DNA w osoczu, oraz niewykrywalnym antygenie HBs za pomocą dostępnych metod serologicznych, nie przekraczająca wartości 200 IU/ml. OBI jest szczególnym przypadkiem zakażenia HBV, którego reaktywacja może w skrajnych przypadkach doprowadzić między innymi do marskości wątroby. Cel pracy: Opracowanie ultraczułej metody diagnostyki OBI przy bardzo niskim stężeniu DNA wirusa za pomocą real-time PCR z osocza. Metody: Osocze było preinkubowane z buforem zawierającym protezę, a następnie izolowano z niego DNA w urządzeniu wykorzystującym złoże krzemionkowe (EasyMag, Biomerieux). Detekcja DNA HBV przeprowadzana była za pomocą real-time PCR (Rotor Gene 3000, Corbett Research). Wyniki: Otrzymana metoda diagnostyki OBI posiada wysoką czułość detekcji DNA HBV, która wynosi 100% na poziomie 5 IU/ml i 75% na poziomie 2,5IU/ml. Wnioski: Metoda ta pozwala nam na wykrywanie bardzo niskich stężeń DNA HBV, z którymi mamy do czynienia w przypadku OBI. Jest to wysoce specyficzny test diagnostyczny o unikalnej kombinacji sekwencji sondy i primerów zdegenerowanych, która umożliwia wykrywanie 7 genotypów HIV. I-14 P Surowica monowalentna przeciwko mutantowi Rc Yersinia enterocolitica O:3 jako narzędzie do badania ECA-immunogenności Rabsztyn K. 1,2, Łukasik M. 1, Kasperkiewicz K. 1, Li C-M. 2, Duda K.A. 3, Radziejewska-Lebrecht J. 1, Skurnik M. 2 1 Department of Microbiology, University of Silesia, Katowice, Poland 2 Haartman Institute, University of Helsinki, Helsinki, Finland 3 Research Center Borstel, Division of Structural Biochemistry, Borstel, Germany e-mail: magdalena.lukasik@us.edu.pl Wstęp: Wspólny Enterobakteryjny Antygen (ECA) jest obok lipopolisacharydu (LPS) ważnym składnikiem powierzchniowym błony zewnętrznej bakterii z rodziny Enterobacteriaceae. Sugerowano, że ekspresja ECA w pałeczkach Yersinia enterocolitica O:3 (YeO3) jest regulowana temperaturą. Badania z wykorzystaniem surowic monowalentnvch bogatych w przeciwciała specyficzne dla ECA, otrzymanych dla mutantów Rc YeO3 hodowanych w 22 C i 37 C, umożliwiłyby ustalenie zależności ekspresji ECA od temperatury hodowli pałeczek YeO3. Cel pracy: Usunięcie przeciwciał anty-lps z poliwalentnych surowic odpornościowych przeciwko YeO3-c-trs8-R (z 22 C i 37 C) poprzez absorpcję martwymi i żywymi bakteriami ECA-ujemnymi, celem uzyskania surowic monowalentnvch bogatych w przeciwciała specyficzne dla ECA. Metody: W pilotowym doświadczeniu do absorpcji użyto bakterie ECA-ujemne, które gotowano przez 2,5 h. W kolejnej analizie wykorzystano do absorpcji żywe komórki. Nieabsorbowane i dwukrotnie absorbowane surowice analizowano techniką Western blot z preparatem standardowym ECAPG S. Montevideo SH94, preparatami LPSPCP i lizatami komórkowymi szczepów Yersinia enterocolitica O:3 oraz S. Montevideo SH94. Wyniki: Surowicę przeciwko YeO3-c-trs8-R absorbowaną martwymi bakteriami ECA-ujemnymi analizowano techniką Western blot z preparatem standardowym ECAPG 20
i preparatami LPSPCP szczepów Ye75S, Ye75R i YeO3-c-trs8-R. Standard ECAPG silnie reagował w postaci charakterystycznego dla ECA profilu drabinkowego z nieabsorbowaną surowicą anty-yeo3-ctrs8-r. Dla dwukrotnie absorbowanej surowicy obserwowano słabe immunobarwienie ze standardem ECAPG. Preparaty LPSPCP wykazały silną reakcję w wysokim i niskim regionie cząsteczkowym zarówno z surowicą poliwalentną, jak i surowicą absorbowaną. Otrzymane wyniki sugerowały, że zastosowana metoda absorpcji nie pozwoliła na efektywne usunięcie przeciwciał anty-lps z badanej surowicy poliwalentnej. Stąd, do kolejnej analizy Western blot wykorzystano surowicę absorbowaną żywymi ECAujemnymi bakteriami. Jako antygenów użyto LPSPCP YeO3-c-trs8-R i lizatów komórkowych szczepów: YeO3-c-trs8-R, YeO3-c-OCR-ECA, S. Montevideo SH94. Nieabsorbowana surowica anty-yeo3-c-trs8-r zawierała przeciwciała przeciwko wszystkim w/w antygenom. Surowica absorbowana nie reagowała z lizatem ECA-ujemnego szczepu, co sugerowało usunięcie przeciwciał anty-lps z surowicy poliwalentnej. Wnioski: Otrzymane wyniki sugerują, że absorpcja żywymi bakteriami ECA-ujemnymi pozwoliła na bardziej efektywne usunięcie przeciwciał anty-lps z poliwalentnej surowicy przeciwko YeO3-c-trs8-R niż absorpcja martwymi komórkami. I-15 P Aktywność β-glukuronidazy i β-glukozydazy Escherichia coli izolowanych z kału ludzi ze zdiagnozowanymi chorobami jelita grubego oraz ludzi zdrowych Mroczyńska M. 1, Lubudzisz Z. 1, Gałęcka M. 2, Szachta P. 2, Cichy W. 3, Roszak D. 3 1 Politechnika Łódzka, Instytut Technologii Fermentacji i Mikrobiologii, Łódź 2 Instytut Mikroekologii w Poznaniu, Poznań 3 Klinika Gastroenterologii Dziecięcej i Chorób Metabolicznych Uniwersytetu Medycznego w Poznaniu e-mail: mmroczynska@interia.pl Wstęp: Nieswoiste zapalenia jelit (IBD, ang.: inflammatory bowel diseases) to choroby, których etiologia nie została ostatecznie wyjaśniona. Najczęściej występują w postaci choroby Leśniowskiego - Crohna (ang.: Crohn Diseases) oraz wrzodziejącego zapalenia jelita grubego (łac.: colitis ulcerosa). Prawdopodobnie istotną rolę w patogenezie choroby odgrywa czynnik mikrobiologiczny, który w połączeniu z defektem układu immunologicznego i podatnością genetyczną pacjenta przyczynia się do rozwoju i podtrzymania stanu zapalnego. Nieswoiste choroby zapalne jelit predysponują do rozwoju nowotworów przewodu pokarmowego. Obecnie około 25 40% przypadków IBD diagnozuje się u osób poniżej 20 roku życia i liczba ta ciągle rośnie. U zdrowego człowieka układ jakościowy i ilościowy mikroflory jelitowej zawiera dominującą przewagę mikroorganizmów korzystnych dla zdrowia. Jednak nadmierna aktywność enzymów bakterii dominujących w jelicie grubym może doprowadzić do generowania wielu produktów genotoksycznych, mutagennych i karcynogennych. Cel: Celem badań było określenie aktywności β-glukuronidazy i β-glukozydazy bakterii Escherichia coli wyizolowanych z kału ludzi ze zdiagnozowanymi nieswoistymi chorobami zapalnymi jelit, w wieku od 3 do 57 lat oraz zdrowych osób, w wieku od jednego roku do 30 lat. Metody: Analizie poddano 9 izolatów Escherichia coli pochodzących od osób chorych oraz 30 szczepów wyizolowanych od zdrowych osób. Aktywność enzymów oznaczono spektrofotometrycznie, stosując właściwe substraty do oznaczanych enzymów. Za jednostkę aktywność przyjęto taką ilość fenoloftaleiny (dla -glukuronidazy) oraz p-nitrofenolu ( -glukozydazy) wyrażoną w mm, która została uwolniona podczas reakcji w czasie 1 godz. w przeliczeniu na mg białka. Wyniki: Badania dowiodły, że aktywność β-glukuronidazy szczepów Escherichia coli pochodzących od młodych osób chorych (do 15 roku życia) mieściła się w przedziale 0,047-6,587 mm/h/mg białka, natomiast od zdrowych osób (do 30 roku życia), 0,053-2,589 mm/h/mg białka. Aktywność β-glukozydazy szczepów Escherichia coli wyizolowanych od osób ze zdiagnozowanymi chorobami jelita grubego mieściła się w przedziale 0,001-0,01mM/h/mg białka natomiast aktywność izolatów pochodzących od zdrowych osób 0-0,012mM/h/mg białka. Stwierdzono, że aktywność β-glukozydazy szczepów E.coli wyizolowanych od ludzi młodych z chorobami jelita grubego była dwukrotnie wyższa od aktywności izolatów uzyskanych od 21
osób zdrowych. Wnioski: Stwierdzono, że aktywność β-glukozydazy szczepów E.coli wyizolowanych od ludzi młodych z chorobami jelita grubego była dwukrotnie wyższa od aktywności izolatów uzyskanych od osób zdrowych. Aktywność β-glukuronidazy izolatów pochodzących od ludzi chorych była o 28% wyższa od aktywności izolatów pochodzących od zdrowych osób. I-16 P Ocena obecności genów warunkujących produkcję enterotoksyny niehemolitycznej NHE u emetycznych szczepów z grupy Bacillus cereus Seifert K., Bednarczyk-Drąg A., Daczkowska-Kozon E.G., Dąbrowski W. Katedra Mikrobiologii i Biotechnologii Stosowanej, Wydział Nauk o Żywności i Rybactwa, Zachodniopomorski Uniwersytet Technologiczny w Szczecinie e-mail: agnieszka.bednarczyk@zut.edu.pl; seifert.katarzyna@gmail.com Wstęp: Grupa Bacillus cereus obejmuje sześć gatunków. Są one szeroko rozprzestrzenione w środowisku, w tym w żywności. Jedną z głównych przyczyn wywołujących zatrucia pokarmowe typu biegunkowego na tle B.cereus są enterotoksyny, w tym enterotoksyna niehemolityczna NHE. Budują ją 3 jednostki, a mianowicie NheA, NheB, NheC. Są one kodowane przez geny (odpowiednio) nhea, nheb oraz nhec. Do wywołania reakcji chorobowej konieczne jest wystąpienie 3 jednostek toksyny jednocześnie. Dotychczas sądzono, iż ten typ zatruć mogą wywoływać jedynie szczepy enterotoksyczne. Cel: Za cel pracy postawiono sobie ocenę potencjału emetycznych szczepów B. cereus wyizolowanych z produktów żywnościowych do produkcji enterotoksyny hehemolitycznej (NHE), tj. oceny występowania genów kodujących trzy komponenty tej toksyny (nhea, nheb oraz nhec) u grupy wymiotnych bakterii B.cereus. Metody: Materiał badawczy wyizolowany został z produktów żywnościowych (artykułów zbożowych). Ekstrakcję bakteryjnego przeprowadzono DNA metodą kolumienkową. Badane szczepy wcześniej zaklasyfikowano do grupy B.cereus oraz określono ich zdolność do produkcji toksyny emetycznej. Obecność trzech fragmentów genów oznaczano techniką jakościowej Real-Time PCR. Wyniki weryfikowano analizując profile topnienia amplikonów oraz przy pomocy elektroforezy w żelu agarozowym, porównując rezultaty z tymi uzyskanymi dla szczepów referencyjnych.wyniki: Na podstawie przeprowadzonych analiz Real-Time PCR stwierdzono, że 100% badanych szczepów było nośnikami fragmentu genu nhea oraz nheb, natomiast 87% szczepów posiadało także gen nhec. Należy uznać, iż 87% przebadanych szczepów wymiotnych miało potencjał wywoływania także zatrucia typu biegunkowego. Wnioski: Badania wykazały, iż emetyczne szczepy mogą być nośnikami genów kodujących enterotoksynę niehemolityczną NHE. We wszystkich próbach oznaczono jednocześnie obecność fragmentów nhea oraz nheb, a dodatkowo nhec wystąpił aż w 87% prób. Na podstawie przebadanego materiału stwierdzono łączne występowanie u emetycznych B. cereus genów nhea i nheb, przy obecności lub braku genu nhec. Stwierdzono zatem, że emetyczne B.cereus posiadają wyższy potencjał chorobotwórczy niż dotychczas sądzono. Badania były finansowane z projektu badawczego MNiSW N N312 234538. I-17 P Ocena stanu zdrowia pacjentów z podejrzeniem alergii pokarmowej w kontekście składu mikroflory jelitowej. Wróblewska B. 1.; Ogrodowczyk A. 1, Kaliszewska A. 1.; Wasilewska E. 1., Zakrzewska M. 2 1 Instytut Rozrodu Zwierząt i Badań Żywności, Polska Akademia Nauk, Olsztyn 2 Niepubliczny Zakład Opieki Zdrowotnej Poradnia Alergologiczna Allergica w Olsztynie e-mail: a.ogrodowczyk@pan.olsztyn.pl Wstęp: Badania potwierdzają, że zaburzenia składu mikroflory jelitowej odgrywają kluczową rolę w etiopatogenezie chorób alergicznych. Śluzówka przewodu pokarmowego pozostaje w stałym kontakcie 22