Ocena lipolitycznej aktywności szczepów Staphylococcus epidermidis i Staphylococcus haemolyticus

MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2011, 63: 99-103 Joanna Wróblewska, Alicja Sękowska, Patrycja Zalas-Więcek, Eugenia Gospodarek Ocena lipolitycznej aktywności szczepów Staphylococcus epidermidis i Staphylococcus haemolyticus Katedra i Zakład Mikrobiologii Collegium Medicum im. L. Rydygiera w Bydgoszczy Uniwersytet Mikołaja Kopernika w Toruniu Kierownik: dr hab. n. med. E. Gospodarek, prof. UMK Oceniono lipolityczną aktywność 66 szczepów Staphylococcus epidermidis i 37 szczepów Staphylococcus haemolyticus izolowanych z krwi oraz wymazów z ran i ropy, na podłożu agarowym wzbogaconym estrem kwasu tłuszczowego: Tween 20 i Tween 60. Szczepy S. epidermidis istotnie częściej wykazywały aktywność lipolityczną niż szczepy S. haemolyticus. Nie wykazano statystycznie istotnych różnic w zależności od miejsca izolacji badanych gronkowców. Staphylococcus epidermidis i Staphylococcus haemolyticus wchodzą w skład mikroflory fizjologicznej skóry i błon śluzowych człowieka (19). Należą do bakterii oportunistycznych, które mogą być czynnikiem etiologicznym zakażeń, głównie u chorych z defektami immunologicznymi, u noworodków, osób uzależnionych od narkotyków podawanych dożylnie (19). Ziarenkowce reprezentujące obydwa gatunki gronkowców mogą powodować, między innymi, zakażenia skóry oraz tkanek miękkich, w tym zakażenia ran chirurgicznych oraz zakażenia krwi powiązane z wcześniejszym wszczepieniem biomateriałów (6, 19). Lipazy to enzymy, które mogą uczestniczyć w patogenezie zakażeń skóry. Zdolne do degradacji występujących w skórze triacylogliceroli, uczestniczą w ułatwianiu kolonizacji i namnożeniu bakterii (11, 16). Badania in vitro wykazały, że oczyszczona lipaza osłabia odpowiedź immunologiczną neutrofili i granulocytów wobec bakterii (11, 16). Celem pracy była ocena lipolitycznej aktywności szczepów S. epidermidis i S. haemolyticus oraz, czy miejsce izolacji gronkowca ma związek z aktywnością enzymatyczną. MATERIAŁ I METODY S z c z e p y b a k t e r i i. Badaniem objęto 66 szczepów S. epidermidis i 37 szczepów S. haemolyticus izolowanych z materiału klinicznego w Katedrze i Zakładzie Mikrobiologii Szpitala Uniwersyteckiego nr 1 im. dr. A. Jurasza Collegium Medicum w Bydgoszczy, Uniwersytetu Mikołaja Kopernika w Toruniu i poradniach przyklinicznych tego szpitala. Każdy szczep pochodził od innego pacjenta. Z wymazów z ran i ropy izolowano 36 szczepów S. epidermidis oraz 20 szczepów S. haemolyticus, z krwi 30 szczepów S. epidermidis i 17 szczepów S. haemolyticus. Szczepy do gatunku identyfikowano na podstawie wyni-

100 J. Wróblewska i inni Nr 2 ków reakcji biochemicznych ujętych w testach API STAPH (biomérieux). Wynik reakcji biochemicznych odczytywano w systemie komputerowym ATB Expression (biomérieux) z zastosowaniem bazy danych wersji V 2.8.8 W y t w a r z a n i e e n z y m ó w l i p o l i t y c z n y c h. Zdolność do wytwarzania enzymów lipolitycznych oceniono według metody Burbianka i wsp. (1). Szczepy bakteryjne hodowano na agarze tryptozowo-sojowym (Tryptic Soy Agar, TSA, Becton-Dickinson) z dodatkiem 1% roztworu: Tween 20 (roztwór zawierający ester kwasu laurynowego) (Sigma), Tween 60 (roztwór zawierający ester kwasu stearynowego) (Sigma). Jedną kolonię badanego izolatu z 18 - godzinnej hodowli na podłożu TSA z dodatkiem 5% krwi baraniej wprowadzano do bulionu tryptozowo-sojowego (Tryptic Soy Broth, TSB, BBL) i inkubowano w temperaturze 37 o C przez 24 godziny. Po tym czasie posiewano 10 μl zawiesiny bakteryjnej na podłoże wzbogacone w odpowiedni substrat lipidowy. Po czterech dobach inkubacji oceniano zdolność badanych szczepów do hydrolizy tłuszczów. Powstanie strefy zmętnienia wokół kolonii interpretowano jako wynik dodatni. Kontrolę stanowiły te same szczepy posiane na podłoże agarowe bez dodatku substratów tłuszczowych. O b l i c z e n i a s t a t y s t y c z n e. Zastosowano test dwóch frakcji, w modyfikacji uwzględniającej próbki o niskiej liczebności. W celu weryfikacji hipotezy o równości frakcji obliczano wartość statystyki U opartej na przekształceniu arcus sinus. Funkcja arc sin x jest wyrażona w stopniach. Statystyka U ma w przybliżeniu rozkład normalny (Gaussa) (13). WYNIKI Lipolityczne właściwości badanych szczepów przedstawiono w tabeli 1. Aktywność lipolityczną na podłożu wzbogaconym w Tween 20 wykazało 63 (95,4%) szczepów S. epidermidis i 27 (72,9%) szczepów S. haemolyticus. Zdolność rozkładania Tween 60 stwierdzono u 59 (89,4%) szczepów S. epidermidis i 22 (59,4%) szczepów S. haemolyticus. Wszystkie badane szczepy izolowane z wymazów z ran i ropy hydrolizowały estry kwasu stearynowego i kwas laurynowego. Cztery szczepy S. haemolyticus wyosobnione z krwi wykazywały aktywność lipolityczną na podłożu wzbogaconym w Tween 60, natomiast nie hydrolizowały Tween 20. Sześć szczepów S. haemolyticus izolowanych z krwi rozkładało estry kwasu laurynowego, natomiast nie wykazywały one lipolitycznej aktywności wobec estrów kwasu stearynowego. Różnica w liczbie szczepów badanych gatunków gronkowców wykazujących aktywność lipolityczną jest istotna statystycznie (p < 0,004; p < 0,0004), zarówno, gdy w ocenie Tabela 1. Aktywność lipolityczna 66 szczepów S. epidermidis i 37 szczepów S. haemolyticus Pochodzenie S. epidermidis Substrat tłuszczowy S. haemolyticus Substrat tłuszczowy szczepów Liczba Tween 20 Tween 60 Liczba Tween 20 Tween 60 szczepów Liczba* % Liczba* % szczepów Liczba* % Liczba* % Krew 30 29 96,6 27 90,0 17 11 64,7 8 47,1 Rana i ropa 36 34 94,4 32 88,8 20 16 80,0 14 70,0 * liczba szczepów hydrolizujących lipidy

Nr 2 Lipolityczna aktywność Staphylococcus sp. 101 uwzględniono podłoże wzbogacone w Tween 20 i Tween 60. Szczepy S. epidermidis znamiennie częściej wytwarzają lipazy niż szczepy S. haemolyticus. Nie wykazano różnic istotnych statystycznie porównując aktywność lipolityczną szczepów izolowanych z krwi oraz z wymazów z ran i ropy (p > 0,05). Oceniając aktywność lipolityczną dla wszystkich badanych szczepów gronkowców na podłożu z dodatkiem Tween 20 i Tween 60 wykazano, że 90 (87,4%) i 81 (78,6%) i szczepów gronkowców hydrolizuje substraty tłuszczowe i nie jest to różnica istotna statystycznie (p > 0,05). DYSKUSJA Zdolność szczepów bakteryjnych do hydrolizy substratów tłuszczowych może mieć wpływ na umożliwienie przeżycia bakteriom w różnych warunkach. Szczepy wytwarzające lipazę są bardziej przystosowane do przeżycia wewnątrz ropni wywołanych w jamie otrzewnej myszy, niż szczepy, które nie wytwarzają tego enzymu (9). Do badania aktywności lipolitycznej wykorzystywane są różne metody, np. metody hodowlane, kolorymetryczne, fluorometryczna, enzymatyczne, chromatograficzne, genetyczne (5). W niniejszej pracy porównano zdolność hydrolizy przez S. epidermidis i S. haemolyticus dwóch substratów: Tween 20 i Tween 60. Wzrost liczby atomów węgla w kwasie tłuszczowym wchodzącym w skład Tween, nie wpłynął znacząco na zdolność hydrolizy danego estru, co jest zgodne z wynikami uzyskanymi dla szczepów S. epidermidis na podłożach wzbogaconych w Tween 20 i Tween 60 przez Souto i wsp. (15). Lipolityczna aktywność Staphylococcus aureus została opisana przez Eijkman (wg 11) w 1901 roku. Do chwili obecnej wykryto też lipazy u gronkowców kagulazo-ujemnych (Coagulase Negative Staphylococci, CNS). Jednak aktywność lipolityczna tych gronkowców najczęściej jest określana dla gatunków niechorobotwórczych izolowanych ze środków spożywczych (2, 3, 8, 14). Nieliczni autorzy oceniali zdolność hydrolizy estrów przez szczepy reprezentujące gatunki gronkowców izolowane z materiału klinicznego. Zdania badaczy dotyczące rozpowszechnienia aktywności lipolitycznej u szczepów gronkowców izolowanych z materiału klinicznego są podzielone. Tyski i wsp. (17, 18) określili aktywność lipolityczną dla szczepów CNS (między innymi dla S. epidermidis). Odsetek szczepów rozkładających estry kwasów tłuszczowych był znacznie niższy i wynosił 10,2% (17) i 14,8% (18). Kruszyńska i wsp. (7) wykazali, że aktywność lipolityczna występuje u S. epidermidis, S. haemolyticus, a odsetek szczepów hydrolizujących estry kwasów tłuszczowych uzależniony jest od warunków hodowli i substratu użytego w celu określenia aktywności enzymatycznej. Dla szczepów S. epidermidis, S. haemolyticus na podłożu wzbogaconym w Tween 20, aktywność lipolityczną wykazano odpowiednio u 92,3% i 70,0% szczepów i była to wartość porównywalna z odsetkiem szczepów uzyskanych w przedstawionych badaniach. W przypadku podłoża z dodatkiem Tween 60, Kruszyńska i wsp. (7) uzyskali u 71,8% szczepów S. epidermidis i 15,0% szczepów S. haemolyticus aktywność enzymatyczną i były to odsetki znacznie niższe niż otrzymane w obecnych badaniach. Gemmel i wsp. (4) oceniając częstość występowania lipaz u CNS, między innymi, u S. epidermidis i S. haemolyticus, nie wykryli aktywności lipolitycznej u S. haemolyticus. Różnice w uzyskiwanych wynikach mogą być związane z tym, że lipazy gronkowcowe, według Rosenstein i wsp. (12), wykazują różnice we

102 J. Wróblewska i inni Nr 2 właściwościach biochemicznych i katalitycznych, spowodowanych wybiórczością substratu, czy też optymalnego ph. Gemmel i wsp. (4) określili zdolność hydrolizy u S. epidermidis i S. haemolyticus estrów kwasu oleinowego, a nie kwasu laurynowego czy stearynowego. W niniejszej pracy przeprowadzone badania pozwoliły na stwierdzenie, że aktywność lipolityczna jest powszechną cechą szczepów S. epidermidis. Szczepy S. haemolyticus także posiadają zdolność hydrolizy tłuszczów, jednak odsetek szczepów wykazujących tę właściwość biochemiczną jest niższy niż wśród szczepów S. epidermidis. W dostępnym piśmiennictwie tylko nieliczni autorzy uwzględnili czy pochodzenie szczepu ma wpływ na aktywność lipolityczną. Z badań własnych wynika, że w ocenie aktywności lipolitycznej nie jest istotne pochodzenie szczepu a jedynie przynależność gatunkowa, co potwierdzają badania wykonane przez Tyskiego i wsp. (18). WNIOSKI 1. Aktywność lipolityczna jest powszechną cechą szczepów S. epidermidis; rzadziej wykazują ją szczepy S. haemolyticus, 2. Rodzaj materiału klinicznego, z którego izolowano szczepy S. epidermidis i S. haemolyticus nie ma bezpośredniego wpływu na ujawnienie zdolności hydrolizy estrów kwasu stearynowego i kwas laurynowego. J. Wróblewska, A. Sękowska, P. Zalas-Więcek, E. Gospodarek The evaluation of lipolytic activity of strains of Staphylococcus epidermidis and Staphylococcus haemolyticus SUMMARY A total of 103 isolates of CNS (66 strains of S. epidermidis and 37 strains of S. haemolyticus) were investigated. Lipolytic activity of staphylococcal strains was determined by Tryptic Soy Agar containing Tween 20 or Tween 60. The 95.4% strains of staphylococci demonstrated the lipolytic activity on Tween 20 agar and the 89.4% of strains of staphylococci degradation ester of fatty acids on Tweens 60 agar. We detected that S. epidermidis strains (respectively 95,4%, 89,4%) produced lipases more frequently than S. haemolyticus strains (respectively 72,9%, 59,4%). Studies suggest that source of isolation from clinical materials (blood, wound and pus) does not have an influence on the ability hydrolysis esters. PIŚMIENNICTWO 1. Burbianka M, Pliszka A, Burzyńska S. Mikrobiologia żywności. Wydawnictwo Lekarskie PZWL. Warszawa 1983 2. Essid I, Ismail HB, Ahmed SBH i inni. Characterization and technological properties of Staphylococcus xylosus strains isolated from a Tunisian traditional salted meat. Meat Science 2007; 77: 204-12.

Nr 2 Lipolityczna aktywność Staphylococcus sp. 103 3. Garcia-Varona M, Santos EM, Jaime I i inni. Characterisation of Micrococcaceae isolated from different varieties of chorizo. Int J Food Microbiol 2000; 54: 189-95. 4. Gemmel CG, Schumacher-Perdreau F. Extracelluar toxins and enzymes elaborated by coagulase- -negative staphylococci. In: Mardh PA, Schleifer KH (ed) Coagulase-negative staphylococci. Almqvist and Wiksell, Stockholm: 1986, 109-21. 5. Hansan F, Shah AA, Hameed A. Methods for detection and characterization of lipases: a comprehensive review. Biotechnol Adv 2009; 27: 782-98. 6. Huebner J, Goldmann DA. Coagulase-negative staphylococci: role as pathogen. Annu Rev Med 1999; 50: 223-36 7. Kruszyńska E, Janicka G, Bugalski RM i inni. Właściwości lipolityczne wybranych gatunków gronkowców. Diagn Lab 1999; 35: 121-6. 8. Leuschner RG, Kenneally PM, Arendt EK. Method for the rapid quantitative detection of lipolytic activity among food fermenting microorganisms. Int J Food Microbiol 1997; 37: 237-40. 9. Long JP, Kapral FA. Host response to coagulase-negative staphylococci in abscesses induced within mice. J Med Microbiol 1993; 39: 191-5. 10. Oh B, Kim H, Lee J i inni. Staphylococcus haemolyticus lipase: biochemical properties, substrate specifcity and gene cloning. FEMS Microbiol Lett 1999; 179:385 92. 11. Rosenstein R, Götz F. Staphylococcal lipases: Biochemical and molecular characterization. Biochimie 2000; 82: 1005-14. 12. Rosenstein R, Götz F. Staphylococcal lipases: biochemical and molecular characterization. Biochimie 2000; 82:1005-14. 13. Sachs L. Applied Statistics. Berlin Springer Verlg 1982. 14. Sørensen BB. Lipolysis of pork fat by the meat starter culture Staphylococcus xylosus at various environmental conditions. Food Microbiol 1997; 14: 153-60. 15. Souto MJ, Ferreirós CM, Criado MT. Failure of phenotypic characteristics to distinguish between carrier and invasive isolates of Staphylococcus epidermidis. J Hosp Infect 1991; 18: 327-32. 16. Stehr F, Kretschar M, Kröger C i inni. Microbial lipases as virulence factors. J Mol Catal B-Enzym 2002: 22: 347 55. 17. Tyski S, Ciborowski P, Hryniewicz W i inni. Lipolytic and proteolytic properties of staphylococcus. Zentrabl Bacteriol Mikrobiol Hyg 1983; 254: 452-8. 18. Tyski S, Hryniewicz W, Ciborowski P. Ocena lipoitycznych właściwości szczepów gronkowców izolowanych od ludzi. Med. Dośw Mikrobiol 1983; 35: 9-14. 19. von Eiff C, Peters G, Heilmann C. Pathogenesis of infections due to coagulase-negative staphylococci. Lancet Infect Dis 2002; 2: 677-85. Otrzymano: 15 III 2011 r. Adres Autora: 85-094 Bydgoszcz, ul. M. Skłodowskiej-Curie 9, Katedra i Zakład Mikrobiologii Collegium Medium im. Rydygiera w Bydgoszczy, UMK w Toruniu