MIKOLOGICZNA ANALIZA PRÓBEK MATERIAŁU KLINICZNEGO UZYSKANEGO OD CHORYCH ŻYWIONYCH POZAJELITOWO

Transkrypt

1 MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2010, 62: * Maria Dąbkowska 1, Magdalena Sikora 1, Ewa Swoboda-Kopeć 1, Irena Netsvyetayeva 1, Sylwia Jarzynka 1, Marek Pertkiewicz 2, Grażyna Młynarczyk 1 MIKOLOGICZNA ANALIZA PRÓBEK MATERIAŁU KLINICZNEGO UZYSKANEGO OD CHORYCH ŻYWIONYCH POZAJELITOWO Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej, Warszawski Uniwersytet Medyczny, Kierownik: prof. dr hab. med. G. Młynarczyk Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej, Warszawski Uniwersytet Medyczny 1 Klinka Żywienia i Chirurgii, Szpital Kliniczny im. Prof. W. Orłowskiego w Warszawie 2 Chorzy po zabiegach chirurgicznych, żywieni pozajelitowo, są szczególnie narażeni na zakażenie grzybicze o etiologii Candida. Dokonano analizy mikologicznej próbek materiałów klinicznych pozyskanych od chorych żywionych pozajelitowo, a także od chorych, u których nie zastosowano tej metody leczenia. W materiale klinicznym pochodzącym od chorych żywionych pozajelitowo, dominującym gatunkiem była Candida glabrata. W posiewach materiałów klinicznych pozyskanych od chorych nie otrzymujących żywienia pozajelitowego dominował gatunek Candida albicans Szczególnie aktualnym problem klinicznym, u chorych po zabiegach chirurgicznych, żywionych pozajelitowo są zakażenia grzybicze (1, 13). Stosowanie TPN (total parenteral nutrition) w leczeniu ambulatoryjnym jest uważane za skuteczną terapię przewlekłej niewydolności jelitowej u osób dorosłych. Żywienie pozajelitowe jest niezbędne w leczeniu niektórych schorzeń przewodu pokarmowego i niedożywienia. Mieszanina aminokwasów, dekstrozy i tłuszczów w postaci emulsji, stanowiąca podstawowe komponenty tych mieszanek, jest jednocześnie znakomitym medium dla rozwoju bakterii i grzybów chorobotwórczych. Najczęstszymi patogenami zakażeń grzybiczych u chorych otrzymujących TPN są drożdżopodobne grzyby z rodzaju Candida. Wrotami zakażenia w tej grupie chorych są najczęściej zanikające kosmki jelita cienkiego, przez które dochodzi do translokacji patogenu z jego fizjologicznego miejsca bytowania, czego efektem jest zakażenie endogenne. Możliwe jest także zakażenie egzogenne, którego źródłem jest skolonizowany drożdżakami cewnik żyły centralnej (13). Żywienie pozajelitowe stanowi 54% wszystkich czynników predysponujących do zakażenia grzybiczego (1). U chorych żywionych pozajelitowo mogą wystąpić powikłania w postaci zakażenia cewnika żylnego, odcewnikowej kandydemii (fungemii), grzybiczego zapalenia wsierdzia oraz grzybiczego zapalenia gałki ocznej (13). Odcewnikowe fungemie najczęściej występują u chorych długotrwale żywionych poza- * Praca wykonana w ramach grantu KBN N N

2 164 M. Dąbkowska i inni Nr 2 jelitowo i powodowane są przez patogenne, lekooporne szczepy grzybów. Wśród wielu gatunków drożdżaków, drobnoustrojem najczęściej wywołującym infekcje grzybicze jest Candida albicans. Inne gatunki drożdżaków takie jak C. parapsilosis, C. glabrata czy C. tropicalis mogą wywoływać zakażenia zarówno endogenne jak i egzogenne przebiegające w postaci zakażeń układowych i fungemii ( 2,7,13). Przebieg zakażenia grzybiczego zależy od patogenności szczepu, czynników ryzyka i odpowiedzi immunologicznej organizmu. O patogenności szczepów grzybiczych decyduje ich zdolność wytwarzania proteaz, lipaz oraz innych enzymów hydrolitycznych, a także zdolność tworzenia biofilmu na powierzchniach biomateriałów stosowanych w celach diagnostycznych i terapeutycznych. Źródłem zakażenia biomateriałów są najczęściej grzyby z rodzaju Candida występujące fizjologicznie w jamie ustnej, jelicie grubym, pochwie i na skórze (2, 3 5, 7, 9, 14). Celem pracy była mikologiczna analiza próbek materiału klinicznego pozyskanego od chorych otrzymujących żywienie pozajelitowe (grupa badana) oraz próbek materiału pochodzącego od chorych, leczonych w Klinice Chorób Wewnętrznych, u których nie stosowano żywienia pozajelitowego (grupa kontrolna). MATERIAŁ I METODY Badany materiał stanowiło 55 szczepów grzybów drożdżopodobnych wyizolowanych z próbek materiału klinicznego pozyskanego od 37 chorych leczonych w Klinice Żywienia i Chirurgii Szpitala Klinicznego im.prof. W.Orłowskiego w Warszawie, którym podawano wspomagające żywienie pozajelitowe ( grupa badana ) oraz 35 szczepów drożdżaków wyizolowanych z 30 próbek materiału klinicznego pochodzącego od chorych, nie otrzymujących żywienia pozajelitowego (grupa kontrolna ). Próbki materiału klinicznego posiewano na podłoże Sabourauda z dodatkiem chloramfenikolu i gentamicycny. Po godzinnej inkubacji w temperaturze 30 C, identyfikowano drożdżaki do gatunku za pomocą testów ID32C (biomerieux). Wyizolowane szczepy grzybów poddano fenotypowej analizie przy użyciu enzymatycznych testów API ZYM (bio- Merieux) celem określenia ich aktywności enzymatycznej. Do studzienek testu nanoszono po 65 µl zawiesiny komórek drożdżaków o gęstości 5-6 w skali McFarlanda i inkubowano w temperaturze 37 º C w ciągu 4 godzin. Następnie dodawano po 1 kropli reagentów ZYM A i ZYM B, reakcję barwną w skali 0-5 odczytywano po upływie 5 min. Równolegle określono aktywność proteolityczną i lipolityczną wszystkich wyizolowanych szczepów. Aktywność proteaz oznaczano na podłożu Steiba, a lipaz na podłożu Wernera (3, 10). Do badań przygotowano zawiesiny komórek o gęstości 0,5 w skali McFarlanda, z 48 godzinnej hodowli i nanoszono na powierzchnię tych podłoży po 10 µl. Płytki inkubowano w temperaturze 37 C przez 24, 48 i 72 godziny. Obserwacji dokonywano w ciągu 1-7 dni określając strefę proteolizy dla proteaz i strefy opalescencji dla lipaz, powstające po upływie 24, 48 i 72 godzin. Aktywność enzymatyczną oceniano na podstawie czasu występowania zmian wokół kolonii. Interpretacja wyników badań aktywności enzymatycznej: obecność strefy proteolizy po 24 godz. inkubacji (++++), wystąpienie proteolizy po 48 godz. (+++), po 72 godz. (++), powyżej 72 godz. (+) brak aktywności enzymatycznej po 7 dniach ( - ).

3 Nr 2 Kandydioza u chorych żywionych pozajelitowo 165 WYNIKI I ICH OMÓWIENIE Z posiewu materiału klinicznego uzyskanego od 37 chorych z grupy osób badanych, poddanych żywieniu pozajelitowemu wyizolowano 55 szczepów grzybów drożdżopodobnych z rodzaju Candida. Z posiewu 24 próbek różnych materiałów klinicznych pobranych jednorazowo, uzyskano wzrost kolonii należących do jednego gatunku Candida. W 5 przypadkach uzyskano wzrost kolonii należących do 2 różnych gatunków. W tej samej grupie od 7 chorych pozyskano materiał kliniczny pobierany dwu i trzykrotnie otrzymując czystą hodowlę, złożoną z jednego lub dwóch gatunków drożdżaków Candida: Candia albicans i Candida glabrata; Candida glabrata i Candida tropicalis; Candida albicans i Candida lusitaniae (Tabela I). Z posiewu materiału klinicznego pochodzącego od 30 chorych z grupy kontrolnej uzyskano 35 izolatów. W pięciu przypadkach z posiewu 4 próbek plwociny i jednej próbki moczu wyizolowano po dwa różne gatunki drożdżaków: Candida albicans i Candida inconspicua, Candida inconspicua i Candida parapsilosis, Candida kefyr i Candida inconspicua; Candida tropicalis i Candida glabrata oraz Candida albicans i Candida glabrata. Z materiału klinicznego uzyskanego od chorych z grupy badanej zidentyfikowano 31 szczepów Candida glabrata (56,4%), 13 szczepów Candida albicans (23,6%), 3 szczepy Candida tropicalis, (5,5 %) 2 szczepy Candida krusi (3,6%) 2 szczepy Candida lusitaniae (3,6%) i 1 szczep Candida inconspicua (1,8%). Z materia- Tabela I. Szczepy grzybów drożdżopodobnych izolowanych z próbek materiału klinicznego od chorych poddanych żywieniu pozajelitowemu - grupa badana Gatunek (liczba izolatów) Krew Mocz Stomia Wymaz z jamy ustnej Wymaz z odbytu Plwocina Wydzielina oskrzelowa Wymaz z szyjki macicy Candida glabrata (31) Candida albicans (13) Candida tropicalis (3) Candida parapsilosis (3) Candida krusei (2) Candida lusitaniae (2) Candida inconspicua (1) Ogółem n= Tabela II. Szczepy grzybów drożdżopodobnych izolowanych z próbek materiału klinicznego od chorych nie otrzymujących żywienia pozajelitowego -grupa kontrolna Gatunek (liczba izolatów) Plwocina Mocz Wymaz z gardła Candida albicans (23) Candida glabrata (5) Candida kefyr (2) Candida inconspicua (3) Candida tropicalis (1) Candida parapsilosis (1) Ogółem n=

4 166 M. Dąbkowska i inni Nr 2 łów klinicznych grupy kontrolnej zidentyfikowano 23 szczepy Candida albicans (65,7%), pochodzące głównie z posiewu plwociny. Candida glabrata stanowiła znacznie mniejszą grupę 5 izolatów.(14,5%) Pozostałe gatunki drożdżaków występowały nielicznie (Tabela I). Określenie aktywności enzymatycznej wyhodowanych szczepów grzybów. Szczepy Candida glabrata charakteryzowała wysoka aktywność fosfatazy kwaśnej (E XI) arylamidazy leucynowej (E VI), arylamidazy wanilowej (E VII), fosfatazy kwaśnej (E XI). Ponad to wszystkie szczepy uwalniały enzymy: E III, E IV, E- VII. Żaden szczep gatunku Candida glabrata nie uwolnił α -glukozydazy (E XVI) i N-acetylo-β glukozyloamidazy. Szczepy Candida albicans uwolniły 10 spośród badanych 19 enzymów. Wszystkie szczepy uwolniły: esterazę (C4), lipazę esterazową, arylamidazę walinową, kwaśną fosfatazę, α - glukozydazę i N acetylo-β-glukozyloamidazę o aktywności 10->40 n.mol. Zdolność wydzielania proteaz wykazało 12 szczepów Candida albicans, 2 szczepy Candida parapsilosis, 2 szczepy Candida tropicalis, 1-Candida lusitaniae i 2 szczepy Candida krusei wyizolowane z materiałów klinicznych badanej grupy chorych. W grupie kontrolnej 21 szczepów Candida albicans uwolniło proteazę o różnym stopniu aktywności. Wszystkie szczepy Candida glabrata pochodzące z materiału klinicznego pobranego od chorych zarówno z grupy badanej jak i kontrolnej wykazały zdolność wytwarzania proteaz. Lipazę uwolnił tylko 1 szczep Candida albicans w badanej grupie chorych i 2 w grupie kontrolnej. Nie stwierdzono obecności tego enzymu u szczepów Candida glabrata. Zdolność wytwarzania lipaz wykazały 2 szczepy Candida tropicalis, 2 szczepy Candida krusei i 1 szczep Candida inconspicua, wyizolowane z materiału klinicznego pobranego od chorych poddanych TPN (Tabela III) DYSKUSJA Żywienie pozajelitowe sprzyja rozwojowi grzybic narządowych i kandydemii. Do rozwoju zakażenia dochodzi w następstwie kolonizacji grzybami drożdżopodobnymi błon śluzowych jamy ustnej, przewodu pokarmowego, dróg moczowych, dróg oddechowych i cewników żylnych (13). Niektórzy autorzy twierdzą, że prawidłowe prowadzenie żywienia pozajelitowego nie zwiększa ryzyka fungemii (11). W naszych badaniach 14,5 % izolatów stanowiły szczepy grzybów wyhodowane z krwi. Candida albicans, uważana dotychczas za główny czynnik etiologiczny kandydoz u chorych z grup wysokiego ryzyka, stanowi jedynie niewielki odsetek wśród ogólnej liczby wyizolowanych drożdżaków. Równocześnie obserwuje się wzrost częstości kolonizacji i zakażeń wywołanych przez drożdżopodobne grzyby należące do gatunków innych niż Candida albicans (2,7,9). W zależności od lokalizacji zakażenia, Candida glabrata obecnie zajmuje drugie miejsce wśród najczęściej izolowanych gatunków grzybów (2,7). Obserwacje te potwierdzają wyniki naszych badań przedstawione w niniejszej pracy. Spośród 55 szczepów grzybów drożdżopodobnych wyizolowanych z materiału klinicznego pozyskanego od chorych żywionych pozajelitowo, Candida albicans stanowiło tylko 23,5% badanych szczepów, natomiast 56,4% należało do gatunku Candida glabrata. W materiale klinicznym pobranym od chorych leczonych w Klinice Chorób Wewnętrznych, którym nie zastosowano żywienia pozajelitowego, dominującym gatunkiem była Candida albicans i stanowiła 65,7% wyizolowanych szczepów grzybów drożdżopodobnych. W zakażeniach grzybiczych, związanych zwłaszcza ze sto-

5 Nr 2 Kandydioza u chorych żywionych pozajelitowo 167 Tabela III. Aktywność enzymatyczna proteaz i lipaz oznaczona dla szczepów Candida albicans i Candida glabrata Candida albicans Candida glabrata Nr szczepu Proteaza Lipaza Nr szczepu Proteaza Lipaza C2 + - C3 + - C C4 + - C8/ C7/1 + - C9/ C8/2 + - C C9/2 + - C C C C C C C C C24/2 + - C C C C39/ C C C K C K2 + - C K C K4 + - C K5 - - C K6 + - C K7/1 + - C K C K C39/2 + - K C K C K C K C K C K C K C K C K C K K K26/2 + + K18/1 + - K K K K26/ K K C- szczep należący do grupy badanej K- szczep należący do grupy kontrolnej

6 168 M. Dąbkowska i inni Nr 2 sowaniem różnych biomateriałów, istotnym czynnikiem wirulencji niektórych szczepów grzybów jest ich zdolność do tworzenia biofilmu (8,9,12,14,15). Grzyby wykazują zdolność adherencji do wszystkich biomateriałów używanych w medycynie (8). Wytwarzane enzymy hydrolityczne takie jak esterazy, lipazy, fosfatazy ułatwiają adherencję oraz inwazję komórek grzybów do tkanek i są szczególnie ważne w początkowej fazie zakażenia grzybiczego (4). Ocena zależności pomiędzy aktywnością enzymatyczną, a opornością grzybów na niektóre antymikotyki, zwłaszcza na pochodne azoli, w tym flukonazol lek powszechnie stosowany w profilaktyce kandydoz, jest obecnie przedmiotem badań wielu autorów. Wysoka oporność na flukonazol szczepów Candida glabrata może być związana z wysoką aktywnością fosfatazy kwaśnej i brakiem wytwarzania β glukozydazy ( E-16 ) i N-acetylo glukozaminidazy ( E-18) (16). Candida glabrata były uznawane do niedawna za gatunki niezdolne do tworzenia inwazyjnych form i do tworzenia pseudomycelium (9). Liczne badania wykazały, że Candida glabrata wytwarza kinazę białkową Yak 1p, która jest odpowiedzialna za ekspresję adhezyn i powstawanie biofilmu (9). Li i wsp. (6) w badaniach nad biofilmem wykazali wyższą zdolność adherencji Candida glabrata niż Candida albicans do biomateriałów. Większość patogennych gatunków Candida wytwarza proteinazy, które prawdopodobnie wspomagają proces adherencji komórek do nabłonków, mogą być też odpowiedzialne za degradację keratyn i kolagenu przez co przyczyniają się do inwazji komórek drożdżakowych do tkanek. Prawie wszystkie badane przez nas szczepy grzybów drożdżopodobnych wytwarzały proteazy. Lipaza jest uważana za szczególnie ważny enzym we wczesnym procesie zakażenia grzybiczego (4). W naszych badaniach nieliczne szczepy Candida sp.wykazały zdolność wytwarzania lipazy: 3 Candida albicans, 2 Candida tropicalis, 2 Candida krusei i 1 Candida inconspicua. Żaden szczep Candida glabrata nie uwalnia tego enzymu. Wyniki badań wielu autorów prac nad patogennością grzybów dowodzą że nie tylko gatunek Candida albicans wykazuje szczególne cechy patogenności. W świetle najnowszych badań, gatunki inne niż Candida albicans wykazują również liczne czynniki wirulencji, które decydują o rozwoju zakażeń grzybiczych. WNIOSKI 1. Candida glabrata jest gatunkiem dominującym w materiale klinicznym uzyskanym od chorych poddanych żywieniu pozajelitowemu, w przeciwieństwie do chorych z grupy kontrolnej, gdzie dominującym gatunkiem jest Candida albicans. 2. Znaczny udział drożdżaków Candida glabrata w materiale klinicznym uzyskanym od chorych poddanych żywieniu pozajelitowemu, może być związany z selekcją szczepów naturalnie opornych na pochodne azoli, a także ze zdolnością tego gatunku do tworzenia biofilmu na powierzchniach biomateriałów.

7 Nr 2 Kandydioza u chorych żywionych pozajelitowo 169 M. Dąbkowska, M. Sikora, E. Swoboda-Kopeć, I. Netsvyetayeva, S. Jarzynka, M. Pertkiewicz, G. Młynarczyk MYCOLOGICAL ANALYSIS OF CLINICAL MATERIALS OF PATIENTS RECEIVING TOTAL PARENTERAL NUTRITION. SUMMARY The most frequent etiological factors of fungal infections in patients receiving total parenteral nutrition (TPN) belong to Candida genus of the yeastlike fungi. In the TPN patients the several infectious complications can develop: venous catheter infection, catheter candidemia (fungemia), fungal endocarditis or fungal ophtalmitis. The capability of hydrolytic (proteolytic, lipolytic) enzymes secretion as well as biofilm formation on artificial surfaces are the most important factors of fungal strains pathogenity. In the study from clinical materials of 37 patients receiving total parenteral nutrition 31 strains of Candida glabrata (56,4%), 13 strains of Candida albicans (23,6%), 3 Candida tropicalis strains, 2 Candida krusei strains, 2 Candida lusitaniae strains and 1 strain of Candida inconspicua were identified. The phenotypic analysis of isolated strains were performed using API ZYM (biomerieux) tests for the enzymatic activity determination. Simultaneously the proteolytic and lipolytic activity analysis were performed. Candida albicans isolates secreted 10 out of 19 enzymes and Candida glabrata 7. The secretion of proteases was demonstrated in 12 C. albicans strains. All Candida glabrata isolates from examined and from control group secreted proteolitic enzymes. Candida glabrata is the dominant species in clinical materials of patients receiving total parenteral nutrition. The numerous isolation of C. glabrata from clinical materials of patients receiving total parenteral nutrition might be connected with the selection of azole resistant strains and also to ability of creatin biofilm on the biomaterial surfaces. PIŚMIENNICTWO 1. Almirante B, Rodrigues D, Cuenca-Estrella M, Almela M i inni. Epidemiology, Risk Factors, and Prognosis of Candida parapsilosis Bloodstream Infections: Case Control Population Based Surveillance Study of Patients in Barcelona, Spain, from 2002 to J Clin Microbiol 2006; 5: Barberino MG, Silva N, Reboucas C, Alcantara AP i inni. Evaluation of Blood Stream Infections by Candida in Three Tertiary Hospitals in Salvador, Brazil: A Case Control Study BJID 2006; 10: Batura-Gabryel H, Młynarczyk W. Aktywność proteolityczna i lipolityczna grzybów z rodzaju Candida wyizolowanych od chorych na przewlekłe choroby układu oddechowego. Mikol Lek 2000; 7: Batura Gabryel H, Młynarczyk W. Aktywność hydrolityczna grzybów z rodzaju Candida i występowanie grzybicy jamy ustnej u chorych na raka płuca i przewlekłą obturacyjną chorobę płuc. Mikol Lek 2000; 7: Ghannoum MA. Potential Role of Phospholipases in Virulence and Fungal Pathogenesis.Clin Microbiol Rev 2000; 13: Li L, Redding and Dongari-Bagtzohlou A. Candida glabrata, an Emerging Oral Opportunistic Pathogen. J Dent Res 2007; 86: Marra AR, Opilla M, Edmond MB, Kirby DF. Epidemiology of Bloodstream Infections in Patients Receiving Long Term Total Parenteral Nutrition. J Clin Gastoenterol 2007; 41: Mnichowska-Polanowska M, Kaczała M, Giedrys-Kalemba S. Lekooporność oraz zwalczanie biofilmu Candida. Mikol Lek 2009; 16: 165-9

8 170 M. Dąbkowska i inni Nr 2 9. Mnichowska-Polanowska M, Kaczała M, Giedrys-Kalemba S. Charakterystyka biofilmu Candida. Mikol Lek 2009; 16: Nowakiewicz A. Ziółkowska G.:Fenotypowa charakterystyka szczepów Malassezia pachydermatis, Med. Wet 2007; 63(4): Pertkiewicz M, Kociszewska D, Majewska K, Omidi M. Czy żywienie pozajelitowe sprzyja fungemii VIII Zjazd Polskiego Towarzystwa Żywienia pozajelitowego i Dojelitowego, Jachranka VI 2006, Tom 1 Numer zjazdowy 12. Ramage G, Martinez JP, Lopez Ribot JL. Candida biofilms on implanted biomaterials: a clinically significant problem. FEMS Yeast Res 2006; 6: Słodkowski M, Cebulski W, Deptała A, Krasnodębski IW. Zakażenia grzybicze u chorych chirurgicznych żywionych poza i dojelitowo. Zakażenia 2004; 4: Shin JH, Kee SJ, Shin MG, Kim SH i inni. Biofilm Production by Isolates of Candida Species Recovered from Nonneutropenic Patients: Comparison of Bloodstream Isolates with Isolates from Other Sources. J Clin Microbiol 2002; 40: Tumbarello M, Posteraro B, Trecarich EM, Fiori B i inni. Biofilm Production by Candida Species and Inadequate Antifungal Therapy as Predictors of Mortality for Patients with Candidemia. J Clin Microbiol 2007; 45: Tyczkowska-Sieroń E., Kurnatowski P. Analiza zależności pomiędzy aktywnością enzymatyczną, a opornością na flukonazol szczepów grzybów z rodzaju Candida. Med Micol 2006; 13: Otrzymano: 15 III 2010 r. Adres Autora: Warszawa, ul. Chałubińskiego 5, Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej, WUM