Walidacja metod badawczych

laboratorium 9-10/2013 w l a b o r a t o r i u m Walidacja metod badawczych i certyfikacja wyrobów do diagnostyki in vitro Streszczenie Polskie ustawodawstwo jest systematycznie dostosowywane do wymagań określonych w Dyrektywach Nowego Podejścia. W branży medycznej aktem prawnym, który wdraża postanowienia Dyrektyw, jest Ustawa Ministra Zdrowia z dnia 20 maja 2010 r. o wyrobach medycznych wraz z rozporządzeniami. Ustawa określa m.in. zasadnicze wymagania stawiane wyrobom medycznym do diagnostyki in vitro, reguły klasyfikacji, a także nakłada obowiązek certyfikacji CE. Zgodnie z wymaganiami zawartymi w normie PN-EN ISO 17025 oraz w normie ISO 15189 metody badawcze wykorzystywane w diagnostyce medycznej muszą przejść proces walidacji, który potwierdza ich przydatność osiągnięcia zamierzonego celu diagnostycznego. Słowa kluczowe wyroby medyczne, klasyfikacja, certyfikacja, diagnostyka in vitro, walidacja, parametry walidacyjne, reakcje kontrolne Summary Polish legislation is systematically adapted to the requirements of the "New Approach Directives". In the medical act, which implements the provisions of the Directives, The Act is the Minister of Health of May 20, 2010 on medical devices with the regulations. The Act defines including essential requirements qualities to medical diagnostics In vitro, classification rules, and CE certification requires. In accordance with the requirements of PN-EN ISO 17025 and in the ISO 15189 test method used in medical diagnosis must undergo a validation process that confirms their suitability for achieving intended purpose tool. Key words medical devices, classification, certification, In vitro diagnostics, validation, performance validation, control reactions dr n. biol. Marcin Hołysz Katedra i Zakład Biochemii i Biologii Molekularnej Uniwersytet Medyczny im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu Dynamiczny rozwój diagnostyki in vitro działającej w oparciu o metody biologii molekularnej, zarezerwowane do niedawna dla badań naukowych, doprowadził do sytuacji, w której potrzeby ze strony laboratoriów diagnostycznych znacznie przekraczają możliwości firm zaopatrujących laboratoria diagnostyczne w aparaturę i zestawy odczynników. Oferta gotowych certyfikowanych zestawów diagnostycznych jest mocno ograniczona do najbardziej popularnych i najczęściej wykonywanych badań. W przypadku rzadziej wykonywanych oznaczeń bardzo często spotykamy się z brakiem możliwości zakupu gotowego testu, żadna firma nie posiada w swojej ofercie odpowiedniego zestawu diagnostycznego. W takim przypadku laboratorium diagnostyczne może opracować i stosować własną metodę badawczą pod warunkiem przeprowadzenia pełnej procedury walidacyjnej, a także certyfikacji (CE), jeżeli laboratorium używa jej do świadczenia usług z zakresu diagnostyki medycznej, zamierza udostępniać opracowaną przez siebie metodę innym laboratoriom lub ją skomercjalizować (np. w formie ogólnodostępnego na rynku testu diagnostycznego). Dostępne komercyjnie lub opracowane w ramach laboratorium zestawy do diagnostyki in vitro są traktowane jako wyroby medyczne, w związku z czym podlegają regulacjom zawartym w Ustawie o wyrobach medycznych. Od 18 września 2010 roku obowiązuje nowa Ustawa z dnia 20 maja 2010 r. o wyrobach medycznych [Dz.U. z 2010 r. Nr 107, poz. 679], zwana dalej Ustawą, która zastąpiła ustawę z dnia 30 kwietnia 2004 roku. Ustawa ta wprowadza i uszczegóławia zmiany w regulacjach prawnych w zakresie wyrobów medycznych w związku z wejściem w życie dyrektywy 2007/47/ WE Parlamentu Europejskiego i Rady z dnia 5 września 2007 r. Ustawa określa m.in. zasady wprowadzania do obrotu i używania wyrobów medycznych przeznaczonych do diagnostyki in vitro, a także zasady przekazywania tych wyrobów do oceny ich działania. Zasady te dotyczą także dodatkowego wyposażenia, które mimo iż samo nie jest wyrobem medycznym, jest przeznaczone przez wytwórcę do stosowania łącznie z wyrobem medycznym do diagnostyki in vitro w celu umożliwienia jego używania zgodnie z przewidzianym zastosowaniem. Wyrobami medycznymi do diagnostyki in vitro są: odczynniki, produkty odczynnikowe, kalibratory, materiały kontrolne, zestawy, przyrządy, aparaty, sprzęt lub systemy, stosowane samodzielnie lub w połączeniu, przeznaczone przez wytwórcę do stosowania in vitro do badania próbek pobranych z organizmu ludzkiego, w tym krwi i tkanek. Wyroby te stosuje się wyłącznie lub głównie w celu dostarczenia informacji: o stanie fizjologicznym lub patologicznym, o wadach wrodzonych, do ustalenia bezpieczeństwa dla potencjalnego biorcy i zgodności z potencjalnym biorcą, do monitorowania działań terapeutycznych. Do wyrobów medycznych do diagnostyki in vitro zalicza się również: pojemnik na próbki specjalnie przeznaczony przez wytwórcę do bezpośredniego przechowywania oraz zabezpieczenia próbek pobranych z organizmu ludzkiego do badania diagnostycznego in vitro oraz sprzęt laboratoryjny ogólnego zastosowania, jeżeli ze względu na jego właściwości jest specjalnie przeznaczony przez wytwórcę do użycia w badaniach diagnostycznych in vitro. Według Ustawy o wyrobie nowym mówimy, gdy wyrób medyczny do diagnostyki danego analitu lub innego parametru nie był stale dostępny w okresie 3 ostatnich lat na terytorium państwa członkowskiego lub gdy zastosowana procedura opiera się na technice analitycznej, która nie była stale używana w okresie 3 ostatnich lat na terytorium państwa członkowskiego. Ustawie o wyrobach medycznych nie podlegają wyroby wykonane przez użytkownika, a więc te, które są wytworzone i używane jedynie przez użytkownika we własnym zakresie i nie zostały przekazane do używania innej osobie lub pod- 2

w l a b o r a t o r i u m laboratorium 9-10/2013 miotowi. Nie zalicza się do nich wyrobów wykonanych na zamówienie oraz tych, które już zostały zakwalifikowane jako wyroby medyczne do diagnostyki in vitro (lub jego wyposażenie). Niemniej jednak jeżeli laboratorium wprowadza swój wyrób do użytku w celu świadczenia publicznie dostępnych usług z zakresu diagnostyki medycznej, wyrób taki podlega Ustawie, co więcej, musi być oznakowany znakiem CE, co potwierdza, iż przeszedł odpowiednią procedurę oceny zgodności i spełnia stawiane mu wymagania zarówno pod względem diagnostycznym, jak i bezpieczeństwa użytkowania [art. 4 ust. 7]. Z wymogu oznakowania znakiem CE zwolnione są wyroby wykonane na zamówienie, wyroby przeznaczone do badań klinicznych, wyroby do oceny działania oraz wykonane przez użytkownika. Minister zdrowia w drodze rozporządzenia określa zasadnicze wymagania w zakresie bezpieczeństwa wyrobów medycznych. Każdy wyrób medyczny wprowadzany do obrotu lub do użytku musi spełniać wymagane kryteria. Ustawa o wyrobach medycznych określa cztery klasy wyrobów medycznych (I, IIa, IIb i III), uwzględniając ryzyko związane z ich stosowaniem [art. 20 ust. 1]. Zgodnie z Rozporządzeniem z dnia 5 listopada 2010 r. w sprawie sposobu klasyfikowania wyrobów medycznych [Dz.U. 2010 Nr 215, poz. 1416] klasyfikację przeprowadza się w oparciu o osiemnaście reguł, przy czym do każdego wyrobu można przyporządkować tylko jedną regułę. Wyroby medyczne do diagnostyki in vitro, których błędne zastosowanie mogłoby mieć poważne konsekwencje medyczne, zostały zakwalifikowane do odrębnych wykazów: A lub B [art. 21 Ustawy]. Wobec wyrobów zawartych w tych wykazach stosuje się szczególne procedury oceny zgodności (oznaczenie i certyfikat IVD). Klasyfikację wyrobów medycznych przeprowadza wytwórca lub jego autoryzowany przedstawiciel, samodzielnie lub przy współudziale jednostki notyfikowanej. Dyrektywa 2007/47/EC wprowadza systemy oceny zgodności określające wymagania, które musi spełniać wyrób medyczny wprowadzany do obrotu. Szczegółowe zapisy wprowadza rozporządzenie ministra zdrowia z dnia 12 stycznia 2011 r. [Dz.U. 2011 Nr 16, poz. 75]. Rozporządzenie określa wymagania zasadnicze dla wyrobów medycznych do diagnostyki in vitro (załącznik nr 1), procedury oceny zgodności (załącznik nr 3) oraz wykazy A i B, o których mowa w art. 21 Ustawy o wyrobach medycznych (załącznik nr 2). Rozporządzenie to wprowadza do krajowego ustawodawstwa zapisy Dyrektywy 98/79/ WE Parlamentu Europejskiego i Rady z dnia 27 października 1998 r. w sprawie wyrobów medycznych używanych do diagnozy in vitro. Procedury oceny zgodności W przypadku wyrobów medycznych do diagnostyki in vitro (nieobjętych wykazami A i B oraz niebędących wyrobami do samokontroli lub do oceny działania) wytwórca przed oznakowaniem ich znakiem CE i wprowadzeniem do obrotu przeprowadza ocenę zgodności z zastosowaniem procedury deklaracji zgodności WE, określonej w ust. 1-5 załącznika nr 3. [art. 4]. Wytwórca wyrobów medycznych do diagnostyki in vitro z wykazu A (innych niż wyroby do oceny działania) przez oznakowaniem ich znakiem CE i wprowadzeniem do obrotu przeprowadza ocenę zgodności wyrobu z zastosowaniem jednej z dwóch możliwych procedur [art. 5]: deklaracji zgodności WE pełny system zapewnienia jakości (załącznik nr 4) lub badania typu WE (załącznik nr 5) w połączeniu z procedurą deklaracji zgodności WE zapewnienie jakości produkcji (załącznik nr 7). Ocenę zgodności wyrobów medycznych do diagnostyki in vitro z wykazu B (innych niż wyroby do oceny działania) przeprowadza się z zastosowaniem procedury [art. 6]: deklaracji zgodności WE pełny system zapewnienia jakości (załącznik nr 4) lub badania typu WE (załącznik nr 5) w połączeniu z procedurą: weryfikacji WE (załącznik nr 6) lub deklaracji zgodności WE zapewnienie jakości produkcji (załącznik nr 7). Dla wyrobów medycznych do diagnostyki in vitro do samokontroli (innych niż wyroby z wykazów A i B oraz innych niż wyroby do oceny działania) przed sporządzeniem deklaracji zgodności WE wytwórca przeprowadza ocenę zgodności z zastosowaniem procedury [art. 7]: deklaracji zgodności WE (załącznik nr 3) lub deklaracji zgodności WE pełny system zapewnienia jakości (załącznik nr 4) lub badania typu WE (załącznik nr 5) w połączeniu z procedurą: weryfikacji WE (załącznik nr 6) lub deklaracji zgodności WE zapewnienie jakości produkcji (załącznik nr 7). Wytwórca wyrobów medycznych do diagnostyki in vitro do oceny działania przeprowadza ocenę zgodności i sporządza stosowne oświadczenie zgodnie z wymaganiami określonymi w załączniku nr 8. Uznaje się, iż wyroby do diagnostyki in vitro są zgodne z wymaganiami zasadniczymi, jeżeli spełniają normy krajowe przyjęte na podstawie norm zharmonizowanych ogłoszonych w dyrektywie 98/79/ WE, Farmakopei lub gdy zostały zaprojektowane i wytworzone zgodnie ze wspólnymi specyfikacjami technicznymi określonymi w decyzji Komisji Europejskiej. Wytwórca może samodzielnie, tzn. bez nadzoru jednostki notyfikowanej, przeprowadzić ocenę zgodności, a następnie wystawić deklarację zgodności i oznakować swój wyrób znakiem CE w przypadku wyrobów medycznych I klasy, niesterylnych i bez funkcji pomiarowej. Dla wyrobów klasy I, sterylnych lub z funkcją pomiarową, wyższych klas, wyrobów do diagnostyki in vitro (w szczególności wymienionych w wykazach A i B) oraz wyrobów do samokontroli w ocenie zgodności niezbędny jest udział jednostki notyfikowanej, autoryzowanej przez ministra zdrowia. Wykaz akredytowanych jednostek certyfikujących system zarządzania jakością w sektorze medycznym jest dostępny na stronie Polskiego Centrum Akredytacji jednostki upoważnionej do akredytacji jednostek certyfikujących, kontrolujących, laboratoriów badawczych i wzorcujących oraz innych podmiotów prowadzących oceny zgodności i ich weryfikacje [www. pca.gov.pl]. Certyfikaty zgodności wydawane przez jednostki notyfikowane są ważne maksymalnie przez 5 lat z możliwością ich przedłużania o kolejne okresy nie dłuższe niż 5 lat [art. 10]. Po wykazaniu, iż wyrób spełnia zasadnicze wymagania, wystawieniu deklaracji zgodności WE i oznakowaniu znakiem CE dokonuje się zgłoszenia i rejestracji wyrobu oraz podmiotu odpowiedzialnego za jego wprowadzenie do obrotu i do używania w Urzędzie Rejestracji Produktów 3

laboratorium 9-10/2013 w l a b o r a t o r i u m Leczniczych, Wyrobów Medycznych i Produktów Biobójczych. Rozporządzenie z dnia 12 stycznia 2011 r. wymaga, aby wprowadzany do obrotu lub użycia wyrób medyczny był tak zaprojektowany i wytworzony, by nie stanowił zagrożenia dla zdrowia i bezpieczeństwa zarówno pacjenta, jak i użytkownika, w oparciu o aktualny stan wiedzy na temat możliwych źródeł zagrożeń [część I, ust. 2, załącznik nr 1]. Należy zatem, o ile to możliwe, całkowicie wykluczyć użycie substancji potencjalnie niebezpiecznych w projektowanym przez nas zestawie diagnostycznym lub przynajmniej ograniczyć zagrożenie związane z ich stosowaniem do minimum bądź zastosować odpowiednie środki ochronne. Przykład: Projektujemy własny zestaw diagnostyczny do oznaczania wirusów RNA (np. wirusa grypy AH1N1) za pomocą reakcji Real-Time PCR (qpcr). Zanim wykonamy amplifikację specyficznego fragmentu genomu wirusa, musimy wyizolować z badanej próbki materiał genetyczny wirusa. Do wyboru mamy metody oparte na absorpcji kwasów nukleinowych na złożu krzemionkowym (tzw. metoda kolumienkowa) lub cząstkach magnetycznych bądź metody rozpuszczalnikowej ekstrakcji w układzie wielofazowym mieszaniny fenol/ chloroform. Którą metodę wybrać? Zgodnie z rozporządzeniem bardziej wskazany byłby wybór metody kolumienkowej lub magnetycznej, w których nie wykorzystuje się substancji silnie toksycznych czy niebezpiecznych, zamiast metody rozpuszczalnikowej, w której używane są substancje silnie toksyczne i żrące (jak tiocyjanian guanidyny czy fenol), stanowiące poważne zagrożenie np. w przypadku ich rozlania i kontaktu ze skórą osoby wykonującej badanie. Aczkolwiek zastosowanie metody rozpuszczalnikowej byłoby w pełni uzasadnione, jeżeli wiązałoby się to np. z wyższą czułością wykonywanego oznaczenia, a więc odnoszone korzyści przeważałyby nad potencjalnym zagrożeniem. Zgodnie z treścią załącznika nr 1 do rozporządzenia z dnia 12 stycznia 2011 r. [część I, ust. 3] wyroby medyczne do diagnostyki in vitro muszą osiągać przewidziane przez wytwórcę parametry działania, w szczególności w zakresie: czułości analitycznej, czułości diagnostycznej, swoistości analitycznej, swoistości diagnostycznej, dokładności, powtarzalności, odtwarzalności, uwzględniając kontrolę wpływu znanych zakłóceń i granice wykrywalności. Spójność pomiarową wzorców odniesienia lub materiałów kontrolnych zapewnia się przez dostępność referencyjnych procedur pomiarowych lub materiałów odniesienia wyższego rzędu [część I, ust. 3, załącznik nr 1]. Walidacja Norma PN-EN ISO 17025 Ogólne wymagania dotyczące kompetencji laboratoriów badawczych i wzorcujących określa wymagania dotyczące opracowania i wdrażania systemu jakości oraz warunki, jakie musi spełniać laboratorium, aby mogło być uznane za kompetentne. Stanowi podstawę do akredytacji laboratorium przez Polskie Centrum Akredytacji. Walidacja jest potwierdzeniem poprzez zbadanie i przedstawienie obiektywnego dowodu, że zostały spełnione wymagania dotyczące konkretnie zamierzonego zastosowania (pkt 5.4.5.1 Normy). Dzięki walidacji możemy nie tylko określić parametry (właściwości) metody, scharakteryzować jej możliwości analityczne oraz poznać jej ograniczenia, ale także zidentyfikować czynniki, które mogą wpływać na jakość uzyskiwanych wyników badania. Ogólnie ujmując: sprawdzamy, czy za pomocą walidowanej metody można zrealizować zamierzony cel, tj. rozwiązać określony problem analityczny. Kiedy i w jakim zakresie należy walidować metody badawcze stosowane w laboratorium diagnostycznym? W myśl zapisów normy PN-EN ISO 17025 walidację należy przeprowadzić dla metod: nieznormalizowanych, zaprojektowanych lub rozwijanych w laboratorium, znormalizowanych wykorzystywanych poza przewidzianym dla nich zakresem oraz znormalizowanych, które zostały rozszerzone lub zmodyfikowane (pkt 5.4.5.2). W polskim prawodawstwie szczegółową odpowiedź na to pytanie znajdziemy w Rozporządzeniu Ministra Zdrowia z dnia 21 stycznia 2009 r. zmieniającym rozporządzenie w sprawie standardów jakości dla medycznych laboratoriów diagnostycznych i mikrobiologicznych [Dz.U. 2009 Nr 22, poz. 128]. Rozporządzenie zawiera pięć załączników, wśród których załącznik nr 2 dotyczy standardów jakości w zakresie badań mikrobiologicznych, w tym badań wykonywanych za pomocą technik biologii molekularnej, natomiast załącznik nr 3 zawiera standardy jakości w zakresie genetyki medycznej. Według zapisów zawartych w pkt 6 (wszystkich pięciu załączników) laboratorium stosuje metody badawcze odpowiadające przyjętym standardom i spełniające stawiane im wymagania, zgodnie z aktualnym stanem wiedzy medycznej. Wśród nich są metody: opublikowane w piśmiennictwie międzynarodowym lub krajowym, rekomendowane przez ośrodki referencyjne lub konsultanta krajowego w danej dziedzinie, zgodne z zaleceniami wytwórców wyrobów medycznych do diagnostyki in vitro oraz opracowane i opisane na potrzeby danego laboratorium (z uwzględnieniem udokumentowanego procesu walidacji). Walidacja dotyczy wszystkich metod stosowanych w laboratorium, przy czym różny może być jej zakres. Jeżeli laboratorium stosuje metodę komercyjną, opracowaną i opisaną przez producenta, walidacja ogranicza się do oceny precyzji i poprawności. Co zrobić, gdy np. testy diagnostyczne dostępne na rynku nie spełniają całkowicie oczekiwań laboratorium? Nie mając możliwości zastosowania gotowych sprawdzonych rozwiązań, laboratorium zmuszone jest do stosowania testu poza zakresem określonym przez producenta,oznaczanie poziomu patogenu w szerszym zakresie, badanie próbek pochodzących z innego źródła, adaptacja metody do możliwości technicznych aparatury będącej na wyposażeniu laboratorium. Rozporządzenie z dnia 21 stycznia 2009 r. przewiduje taką możliwość, aczkolwiek rozszerza się wtedy zakres walidacji. Należy wówczas wykonać ocenę powtarzalności, odtwarzalności, poprawności, a także należy sprawdzić wiarygodność wyników, porównując wyniki uzyskane metodą zalecaną przez producenta z wynikami uzyskanymi za pomocą metody zmodyfikowanej. Rozporządzenie umożliwia również stosowanie metod opracowanych przez laboratorium w tym wypadku należy przeprowadzić pełną procedurę walidacyjną metody. Po zwalidowaniu metody badawczej laboratorium może ubiegać się o jej akredytację i włączyć ją do oferty wykonywanych badań diagnostycznych. Zgodnie z normą ISO EN/PN 17025 walidację metod badawczych można przeprowadzić poprzez: wzorcowanie z wykorzystaniem wzorców lub materiałów odniesienia, porównanie wyników otrzymanych za pomocą metody podlegającej walidacji z wynikami uzyskanymi innymi metodami (referencyjnymi), 4

w l a b o r a t o r i u m laboratorium 9-10/2013 porównanie własnych wyników z uzyskanymi przez inne laboratoria (badania międzylaboratoryjne), badanie czynników, które mają wpływ na wynik pomiaru (powtarzane w określonych odstępach czasu), ocenę niepewności wyników w oparciu o podstawy teoretyczne walidowanej metody oraz doświadczenie praktyczne. Parametry walidacyjne Zakres parametrów walidacyjnych zależy od charakteru badań: czy jest to analiza jakościowa czy ilościowa, szczególnych wymagań stawianych danej metodzie, czasochłonności i kosztów walidacji metody. Zgodnie z rekomendacją Międzynarodowej Konferencji ds. Harmonizacji (The International Conference on Harmonization, ICH) oraz wytycznymi zawartymi w Farmakopei (European Pharmacopoeia) zaleca się włączenie do procesu walidacji następujących parametrów [P. Konieczka, J. Namieśnik, 2007]: precyzja charakteryzuje rozrzut wyników wokół wartości średniej, określana na podstawie wartości odchylenia standardowego (standard deviation, SD) dla próbek o określonym stężeniu (serii pomiarowej), powtarzalność wyznacza się na podstawie wartości SD serii pomiarów wykonanych w danym laboratorium przez danego analityka na danym aparacie w krótkim czasie, precyzja pośrednia określa długoterminowe odchylenie procesu pomiarowego w danym laboratorium, odtwarzalność wyznacza się na podstawie wartości SD wyników uzyskanych przez różne laboratoria (badania międzylaboratoryjne), dokładność stopień zgodności między wynikiem pojedynczego pomiaru a wartością rzeczywistą (oczekiwaną); w przypadku oceny zgodności wyniku będącego wartością średnią serii pomiarów z wartością oczekiwaną mówimy o poprawności (prawdziwości) oznaczenia, liniowość przedział, dla którego sygnał jest proporcjonalny do zawartości analitu; wyznaczana jest na podstawie współczynnika regresji (R, R 2 ), zakres pomiarowy przedział między najniższym a najwyższym stężeniem, jakie mogą być oznaczone za pomocą metody z założoną precyzją, dokładnością i liniowością, czułość metody najmniejsza różnica zawartości analitu, jaką można oznaczyć, granica wykrywalności (limit of detection, LOD) najmniejsza ilość substancji, jaką można oznaczyć z określonym prawdopodobieństwem, granica oznaczalności (limit of quantification, LOQ) najmniejsza ilość substancji, jaką można oznaczyć z założoną dokładnością i precyzją, odporność określa wpływ niewielkich wahań warunków (np. temperatury, ph) na wynik oznaczenia, elastyczność określa przydatność metody w przypadku różnych warunków (na podst. odtwarzalności). Przed przystąpieniem do procesu walidacji metody badawczej należy określić jej charakterystyczne cechy, m.in.: co będzie badane, stężenie oznaczanej substancji w próbce oraz zakres stężenia, jaki będzie można oznaczać za pomocą walidowanej metody, co będzie stanowić materiał badany, rodzaj matrycy, rodzaj badania (np. analiza jakościowa czy ilościowa), wymagania względem poszczególnych parametrów walidacyjnych, obecność substancji interferujących i ich wpływ na wynik badania, aparatura niezbędna do wykonania badania, wymagania techniczne, jakie musi spełniać aparatura, czy metoda będzie udostępniona innym laboratoriom, czy istnieją regulacje (normy, wytyczne) stawiające określone wymagania metodzie badawczej. Ważnym parametrem, który nie wchodzi w skład podstawowych parametrów walidacyjnych, jest niepewność, czyli przedział, w jakim mieści się wartość pomiaru z określonym prawdopodobieństwem (rozrzut wartości pomiaru, +/ ). Na podstawie wartości niepewności można określić przydatność metody do wykonania danego oznaczenia (jakość wyników uzyskiwanych za pomocą walidowanej metody). Niepewność metody zależy od wielu czynników wywierających większy lub mniejszy wpływ na jej wartość, np. niedoskonałość samej metody, niepełna znajomość wszystkich czynników, które mogą zakłócać pomiar, jakość i możliwości techniczne aparatury i wyposażenia laboratorium, cechy biologiczne samego materiału badanego, a także stopień wyszkolenia i doświadczenie personelu. Metody badawcze technika realtime PCR (qpcr) W projektowaniu i późniejszym walidowaniu metod badawczych opartych na specyficznej amplifikacji kwasów nukleinowych należy stosować się do wytycznych ICH [ICH guidelines (topic Q2B) Validation of Analytical Method: Methodology] oraz rekomendacji zawartych w Farmakopei [2.6.21. Nucleic Acid Amplification Techniques, European Pharmacopoeia 5.0]. Kolejne etapy projektowania testów qpcr [M. Raymaekers, 2009]: Wybór odpowiedniej sekwencji. Dla oznaczania wirusów i bakterii do amplifikacji wybiera się sekwencje konserwatywne, specyficzne dla danego gatunku lub szczepu. W badaniach: mutacji somatycznych, abberacji chromosomowych itp., sekwencja amplifikowana powinna obejmować miejsce ulegające rearanżacji. Natomiast w testach, w których jednym z etapów badania jest odwrotna transkrypcja RNA, startery i sondy projektuje się w kolejnych eksonach na ich styku, dzięki czemu amplifikacji ulega jedynie cdna, a nie genomowe DNA. Wybór metody detekcji. W reakcjach Real-time PCR stosuje się niespecyficzne barwniki fluorescencyjne lub sondy znakowane różnymi fluorochromami. Z jednej strony barwniki niespecyficzne są uniwersalne, umożliwiają wykonanie krzywej topnienia produktów amplifikacji oraz wykrycie obecności produktów niespecyficznych, z drugiej strony istnieje ryzyko uzyskania wyników fałszywie pozytywnych w przypadku niepełnej specyficzności starterów. Sondy znakowane fluorescencyjnie hybrydyzują do ściśle określonej sekwencji komplementarnej, przez co zapewniają znacznie większą specyficzność i czułość reakcji. Dostępnych jest wiele formatów sond różniących się sposobem działania i możliwościami aplikacyjnymi. Wybór oligonukleotydów (starterów i sond). Wybór właściwej sekwencji starterów i sond wykorzystywanych do amplifikacji wybranego fragmentu DNA lub RNA (cdna) ma krytyczne znaczenie dla prawidłowego działania testu diagnostycznego. Decyduje o powodzeniu badania. Ustalając sekwencje oligonukleotydy, należy kierować się kilkoma zasadami projektowania, można 5

laboratorium 9-10/2013 w l a b o r a t o r i u m posłużyć się programami komercyjnymi lub dostępnymi bezpłatnie on-line. Wybór rodzaju materiału badanego i sposobu jego obróbki. Wyniki badań próbek pochodzących z różnych źródeł (np. różnych tkanek) mogą się znacznie różnić między sobą nawet w obrębie jednej populacji, stąd rodzaj materiału badanego należy dokładnie określić i scharakteryzować. Materiał badany może zawierać inhibitory reakcji mogące fałszować wyniki badania. Właściwa obróbka materiału powinna umożliwić pozbycie się substancji interferujących oraz zapewnić homogenność próbki. Wybór sposobu kwantyfikacji. Oznaczenia ilościowe DNA lub RNA przeprowadza się w oparciu o krzywą standardową lub metodą porównawczą (ΔΔCt). Do wykreślenia krzywej standardowej niezbędne są standardy, czyli próbki o określonej ilości materiału genetycznego (np. kopii genomu wirusa lub bakterii, μg DNA). Przygotowanie i kwantyfikacja, a następnie właściwe przechowywanie oraz wykorzystywanie standardów ilościowych stwarzają poważne problemy techniczne. Metodę porównawczą stosuje się np. w badaniu zmian poziomu ekspresji genów lub do detekcji delecji i duplikacji fragmentów chromosomów. W metodzie ΔΔCt porównuje się względną zawartość badanej sekwencji w próbie badanej i próbie kontrolnej. Metoda ta wymaga normalizacji, najczęściej wykorzystuje się w tym celu tzw. sekwencję (gen) referencyjną, stanowiącą punkt odniesienia. Problemem jest wybór uniwersalnej i stabilnej sekwencji referencyjnej. Kolejnym etapem procesu jest optymalizacja warunków reakcji. Walidacji podlegają metody zoptymalizowane. Optymalizacja polega na eksperymentalnym ustaleniu najlepszych parametrów reakcji oraz zidentyfikowaniu czynników krytycznych mających istotny wpływ na jakość uzyskiwanych wyników. Wśród czynników mogących decydować o powodzeniu reakcji wymienić można: rodzaj i możliwości techniczne termocyklera, aktywność polimerazy DNA i jej wrażliwość na zmienne warunki reakcji, skład i stężenie poszczególnych składników mieszaniny reakcyjnej (np. jonów Mg2+), ph buforu reakcyjnego, czystość matrycy, obecność inhibitorów i substancji zanieczyszczających, właściwy wybór starterów i sond oraz dobór właściwych warunków amplifikacji. Dysponując w pełni zoptymalizowaną metodą badawczą, można przystąpić do wyznaczania wartości poszczególnych parametrów walidacyjnych. Proces walidacji metody może być przeprowadzony w dowolnej kolejności, niemniej jednak logiczne wydaje się przeprowadzenie go według następującego schematu: Określenie specyficzności (selektywności) reakcji próby z wykorzystaniem prób wzorcowych, DNA innych organizmów, pokrewnych gatunków, szczepów itp. Amplifikacji powinny ulegać jedynie wybrane sekwencje DNA, przy czym test może mieć charakter uniwersalny (wykrywanie grupy pokrewnych patogenów) wtedy oznacza się specyficzność włączną (przeprowadza się reakcję ze wszelkimi dostępnymi szczepami laboratoryjnymi oznaczanego patogenu, wszystkie powinny zostać wykryte). Jeżeli test ma specyficznie wykrywać tylko jeden konkretny patogen, oznacza się wyłączną specyficzność testu. Polega to na analizie potencjalnych reakcji krzyżowych z wybranymi patogenami, do badań powinno się dobierać patogeny blisko spokrewnione z wykrywanym lub te, które mogą występować w pobieranym materiale. Wyznaczanie liniowości, wartości granic wykrywalności i oznaczalności oraz zakresu pomiarowego. Liniowość wyznacza się na podstawie krzywej standardowej pomiaru serii rozcieńczeń próbek (przeważnie stosuje się 5 różnych stężeń, z trzykrotnym powtórzeniem każdego stężenia). W zakresie stężeń powinno znajdować się rzeczywiste stężenie badanego materiału. Jeżeli wartość współczynnika regresji R (lub współczynnika determinacji R 2 ) wynosi 1, mówimy o całkowitej liniowości metody w badanym zakresie stężeń. Chcąc określić granicę wykrywalności (LOD) metody, przeprowadza się reakcje z serią rozcieńczeń materiału badanego w kilku powtórzeniach każdego stężenia. Granica wykrywalności to najmniejsza ilość materiału, jaką możemy wykryć, uwzględniając dodatkowo określone prawdopodobieństwo uzyskania wyniku pozytywnego, otrzymujemy limit detekcji metody. Stężenie materiału, dla którego wszystkie powtórzenia dają wynik pozytywny, stanowi granicę oznaczalności (LOQ). Czułość metody to najmniejsza różnica między badanymi próbkami, którą jesteśmy w stanie oznaczyć. W praktyce parametr ten określa, o ile próbki muszą się różnić między sobą (np. liczbą kopii DNA genomowego) aby można je było od siebie odróżnić. Określenie powtarzalności metody na podstawie wartości odchylenia standardowego z serii wyników pomiaru kilku-kilkunastu powtórzeń próbki dla różnych stężeń (może to być materiał wzorcowy), wykonanych przez tę samą osobę na tym samym aparacie w krótkim czasie. Precyzję metody wyznacza się na podstawie wartości odchylenia standardowego dla próbek o tym samym stężeniu. W celu określenia precyzji pośredniej pomiary powtarza się po dłuższym czasie (np. po kilku tygodniach). Na wartość precyzji pośredniej wpływają takie czynniki, jak: wykonywanie badania przez różne osoby, zastosowanie innego aparatu, odczynników pochodzących z różnych serii lub od różnych producentów. Jeżeli mamy możliwość porównania własnych wyników z wynikami innych laboratoriów, możemy określić odtwarzalność metody. Aby wyznaczyć dokładność i poprawność metody, musimy posłużyć się materiałem kontrolnym (wzorcowym). Należy ocenić zgodność wyników uzyskanych z zastosowaniem danej metody z wynikami rzeczywistymi (oczekiwanymi). Sposoby wyznaczania dokładności metody: użycie certyfikowanego materiału odniesienia (CRM), zastosowanie materiału odniesienia (RM), wykonanie równoległego oznaczenia tej samej próbki metodą badaną (walidowaną) oraz metodą powszechnie uznaną za wzorcową, wyznaczenie dokładności poprzez dodatek znanej ilości materiału badanego do wcześniej zbadanej próbki (badanie odzysku). Warto również określić odporność i elastyczność metody, w szczególności gdy planujemy udostępniać ją do użytku innym laboratoriom lub skomercjalizować (wprowadzić do obrotu jako gotowy zestaw diagnostyczny). Sprawdza się wpływ czynników takich jak: wahania temperatury, zmiana stosowanych odczynników (np. polimerazy DNA innego producenta), wahanie ph, inny sposób izolacji materiału genetycznego itp. Przydatne będą tutaj wyniki badań międzylaboratoryjnych. 6

w l a b o r a t o r i u m laboratorium 9-10/2013 L p. Nazwa kontroli Charakterystyka kontroli Rola kontroli 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. Pozytywna kontrola procedury (kontrola pozytywna ekstrakcji) Negatywna kontrola procedury Negatywna kontrola ekstrakcji (kontrola ślepa ekstrakcji) Wewnętrzna kontrola amplifikacji Zewnętrzna kontrola amplifikacji Kontrola pozytywna PCR Kontrola negatywna PCR Kontrola odczynnikowa ( ślepa ) Kontrola środowiska reakcji Krzywa standardowa (standardy stężenia) Tab. 1. Kontrole reakcji amplifikacji kwasów nukleinowych Próbka z dodatkiem DNA organizmu badanego, która jest traktowana w ten sam sposób jak próbki testowane. Próbka materiału (żywności) wolna od DNA patogenu, podlegająca kolejnym etapom procesu analitycznego wraz z próbkami testowanymi Kontrola prowadzona przez wszystkie etapy ekstrakcji DNA, niezawierająca materiału badanego. Kontrolne DNA dodawane do każdej reakcji w określonej ilości lub liczbie kopii, które pełni funkcję wewnętrznej kontroli amplifikacji. Kontrolne DNA dodawane w określonej ilości lub liczbie kopii do próbki wyizolowanego kwasu nukleinowego, które pełni funkcję kontroli amplifikacji (wykonywanej w osobnej reakcji). Reakcja przeprowadzona z DNA organizmu badanego (w określonej ilości lub liczbie kopii). Reakcja przeprowadzona z wodą (wolną od DNA organizmu badanego oraz inhibitorów PCR). Reakcja zawiera wszystkie składniki amplifikacji z wyjątkiem wyizolowanego DNA (w zamian podawana jest taka sama objętość wody wolnej od DNA). Próbka zawierająca mieszaninę reakcyjną w otwartej probówce, pozostawiona w pomieszczeniu, w którym wykonywana jest analiza, w celu wykrycia możliwości kontaminacji DNA pochodzącym z otoczenia. Reakcja przeprowadzona z 3 lub 4 kolejnymi 10-krotnymi rozcieńczeniami DNA (o znanej liczbie kopii) mieszczącymi się w zakresie powyżej limitu detekcji reakcji. Procedura ekstrakcji kwasów nukleinowych została przeprowadzona w sposób, który umożliwia izolację badanego DNA z materiału testowanej próbki. Wykazanie braku kontaminacji kwasem nukleinowym (patogenu) testowanych próbek podczas kolejnych etapów procesu analitycznego. Wykazanie braku kontaminacji kwasem nukleinowym (żadnym) testowanych próbek podczas kolejnych etapów procesu analitycznego. Nie jest wymagana, jeżeli przeprowadza się negatywną kontrolę procedury (2.). Wykazanie braku fałszywie negatywnych wyników (inhibicji reakcji). Wykazanie braku fałszywie negatywnych wyników (inhibicji reakcji). Wykazanie, że reakcja PCR przebiega prawidłowo (właściwe odczynniki i warunki reakcji). Potwierdzenie, że reakcja PCR, która nie zawiera badanych sekwencji DNA, daje negatywny wynik amplifikacji. Wykazanie braku kontaminacji kwasem nukleinowym odczynników stosowanych w reakcji PCR. Kontrola używana do identyfikacji źródeł kontaminacji oraz kontaminacji pomieszczeń (przestrzeni roboczych). Wykonywana w określonych odstępach czasu jako element systemu kontroli jakości w laboratorium. Kontrola w ilościowych reakcjach PCR (qpcr). Jak już wcześniej wspomniano, zakres parametrów walidacyjnych zależy od charakterystyki metody badawczej. Normy ISO/IEC 17025 oraz ISO/IEC 15189 wymagają przeprowadzenia walidacji metody, jednak nie określają szczegółowo, jak ma być ona przeprowadzona. Wynika to z ogromnego zróżnicowania metod badawczych, które można wykorzystać w diagnostyce in vitro. W zasadzie to laboratorium ustala niezbędny zakres walidacji, biorąc pod uwagę charakterystykę metody, ryzyko związane z ograniczeniem zakresu parametrów walidacyjnych, własne możliwości techniczne, doświadczenie własne i ograniczenia finansowe. Po zakończeniu procedury walidacyjnej, sporządzeniu raportu i pozytywnym przejściu audytu laboratorium może ubiegać się o akredytację nowej metody badawczej przez uprawnioną jednostkę akredytującą, co umożliwi włączenie jej do oferty badań wykonywanych w tym laboratorium. Jeżeli laboratorium chciałoby wprowadzić opracowaną przez siebie metodę badawczą do obrotu w formie zestawu odczynników, należy pamiętać o konieczności certyfikacji CE, gdyż jako wyrób medyczny do diagnostyki in vitro podlega wymaganiom określonym w Ustawie o wyrobach medycznych. Kontrole reakcji amplifikacji kwasów nukleinowych Począwszy od fazy projektowania metody badawczej, poprzez jej optymalizację i walidację oraz wykorzystywanie w codziennej praktyce laboratoryjnej, a także okresowym sprawdzaniu jakości uzyskiwanych wyników, należy pamiętać o konieczności stosowania różnego rodzaju reakcji kontrolnych. Wykaz różnych reakcji kontrolnych, które można zastosować w badaniach wykorzystujących reakcję PCR i real-time PCR, znajdziemy w normach PN-EN ISO 22174:2005 i 24276:2006, (tab. 1). Co prawda obie normy dotyczą kontroli artykułów żywnościowych, jednakże metody badawcze stosowane w medycznej diagnostyce molekularnej i kontroli jakości artykułów spożywczych praktycznie się nie różnią. Farmakopea [rozdział 2.6.21 NAT] zaleca stosowanie zewnętrznej kontroli pozytywnej, zawierającej zdefiniowaną ilość materiału badanego (sekwencji amplifikowanej), zewnętrznej kontroli negatywnej próby niezawierającej materiału badanego, DNA lub RNA (no template control, NTC) oraz kontroli wewnętrznej (internal control, IC), może nią być np. obce DNA, dodawane do próbki, które przechodzi całą procedurę obróbki i w końcu daje pozytywny wynik amplifikacji z zastosowaniem specyficznych starterów. Reakcje kontrolne umożliwiają wykrycie ewentualnych błędów wynikających np. z kontaminacji odczynników i ich niewłaściwego przechowywania, pogarszania się właściwości odczynników lub niewystarczających kompetencji personelu. Dzięki nim można wyeliminować albo przynajmniej zredukować liczbę wyników fałszywie pozytywnych lub fałszywie negatywnych, co świadczy o jakości usług świadczonych przez dane laboratorium diagnostyczne oraz zmniejsza ryzyko związane z ewentualnymi konsekwencjami nieprawidłowo wykonanych badań (np. roszczeń ze strony pacjentów). q Piśmiennictwo dostępne na stronie www.laboratorium.elamed.pl 7