BACTEC MGIT 960 SIRE Kits

BACTEC MGIT 960 SIRE Kits do badania wra liwoœci Mycobacterium tuberculosis na dzia³anie czynników przeciwbakteryjnych Polski PRZEZNACZENIE Zestaw BACTEC MGIT 960 SIRE jest to szybka jakoœciowa procedura s³u ¹ca do badania wra liwoœci Mycobacterium tuberculosis z hodowli na dzia³anie czynników bakteriobójczych, takich jak streptomycyna (STR), izoniazyd (INH), rifampycyna (RIF) oraz etambutol (EMB). Zestaw BACTEC MGIT 960 STR 4,0 oraz zestaw BACTEC MGIT 960 INH 0,4 przeznaczone s¹ do badania leków w wy szych stê eniach. Zestawy BACTEC MGIT 960 do badania wra liwoœci stosowane s¹ z systemem BACTEC MGIT 960. STRESZCZENIE I OBJAŒNIENIE Badanie wra liwoœci na dzia³anie czynników przeciwbakteryjnych jest cenne w celu odpowiedniego leczenia pacjentów choruj¹cych na gruÿlicê. W leczeniu gruÿlicy stosuje siê jednoczeœnie wiele leków, miêdzy innymi antybiotyków, takich jak streptomycyna, izoniazyd, rifampycyna oraz etambutol. Istotne jest, aby przepisany antybiotyk wykazywa³ odpowiedni¹ aktywnoœæ przeciwko Mycobacterium tuberculosis, tzn. aby izolowana bakteria by³a wra liwa na dany lek. Mycobacterium tuberculosis wykazuj¹cy opornoœæ wielolekow¹ (MDR-TB, Multi-drug resistant) sta³ siê ostatnio powa nym problemem publicznej s³u by zdrowia 1. Opornoœæ na którykolwiek g³ówny lek, takie jak streptomycyna (STR), izoniazyd (INH), rifampycyna (RIF) oraz etambutol (EMB), sprawia, i choroba staje siê trudniejsza i dro sza w leczeniu. Szybkie wykrycie takich opornych szczepów ma krytyczne znaczenie dla skutecznego leczenia pacjenta. Do badania wra liwoœci na dzia³anie leków przeciwbakteryjnych stosowano powszechnie dwie metody. W pierwszej metodzie, znanej jako metoda proporcji 2, wykorzystuje siê pod³o e Middlebrook and Cohn 7H10 Agar. Porównuje siê liczbê kolonii drobnoustroju na pod³o u zawieraj¹cym lek i pod³o u bez leku. Opornoœæ na dany lek jest wykrywana, je eli co najmniej 1% populacji bakterii wykazuje opornoœæ na stê enia leku stosowane w badaniu. Wyniki dostêpne s¹ z regu³y po 21 dniach inkubacji. Druga metoda, znana jako metoda BACTEC 460TB radiometrycznego okreœlania wra liwoœci 3, zajmuje zazwyczaj od 4 do 12 dni. Wykorzystuje siê w niej wytwarzanie znakowanego metod¹ 14 C radioaktywnego dwutlenku wêgla przez wzrastaj¹ce pr¹tki, co manifestuje siê zwiêkszeniem wskaÿnika wzrostu (GI, Growth Index) w systemie. Historycznie metoda proporcji (MOP, Method of Proportion) obejmowa³a badanie wra liwoœci M. tuberculosis przy u yciu œrodków przeciwbakteryjnych w dwóch stê eniach. Amerykañska komisja ds. Instytut Standardów Klinicznych i Laboratoryjnych (CLSI, Clinical and Laboratory Standards Institute, dawniej NCCLS, National Committee for Clinical Laboratory Standards) w dalszym ci¹gu zaleca, aby badanie za pomoc¹ MOP obejmowa³o dwa stê enia g³ównych leków z wyj¹tkiem rifampicyny. Zalecane niskie stê enia stosowane w procedurze MOP s¹ krytycznymi stê eniami tych leków. Krytyczne stê enie jest definowane jako stê enie leku, które pozwala na interpretacjê wyniku jako opornoœæ lub wra liwoœæ. Izolowany szczep okreœlany jest jako oporny, je eli co najmniej 1% badanej populacji wzrasta w obecnoœci krytycznego stê enia leku. Wysokie stê enie leku stosowane jest w celu okreœlenia stopnia opornoœci w obrêbie populacji. Ten wynik dostarcza lekarzowi informacji pomagaj¹cych ustaliæ, czy jest konieczna modyfikacja terapii. Test BACTEC MGIT 960 SIRE pozwala na okreœlenie wra liwoœci mniej wiêcej w takim samym czasie jak system BACTEC 460TB. Ponadto metoda ta nie jest metod¹ radiometryczn¹ i umo liwia w wiêkszoœci przypadków uzyskanie wyników wra liwoœci wczeœniej ni za pomoc¹ procedury MOP. Test BACTEC MGIT 960 SIRE powsta³ przy wykorzystaniu krytycznych stê eñ dla streptomycyny, izoniazydu, rifampycyny i etambutolu, nieco ni szych ni stê enia krytyczne stosowane w metodzie MOP, co pozwala na unikniêcie wyników fa³szywie wskazuj¹cych na wra liwoœæ. Najlepiej widoczne jest to w przypadku streptomycyny, poniewa wiele izolowanych szczepów wykazuje wra liwoœæ przy stê eniach bliskich do stosowanych w metodzie MOP. Z tego powodu dla streptomycyny oraz izoniazydu oznaczono drugie, wy sze stê enia leku. Wynik dotycz¹cy wra liwoœci przy stê eniu krytycznym jest wystarczaj¹cy i nie jest potrzebne adne dodatkowe badanie. Szczepy oporne na streptomycynê, izoniazyd i (lub) etambutol w ich stê eniach krytycznych, powinny zostaæ przebadane przy wy szych stê eniach leku za pomoc¹ BACTEC MGIT 960 lub innej metody. W tym przypadku koñcowy wynik mo na podaæ jako opornoœæ przy stê eniu krytycznym, z zaznaczeniem, e wykonywany jest dodatkowy test przy wy szym stê eniu leku. Badanie szczepów opornych przy wy szych stê eniach leku jest wa ne w celu zidentyfikowania tych szczepów, które wykazuj¹ niski poziom opornoœci, tzn. s¹ oporne przy stê eniu krytycznym i wra liwe przy wysokim stê eniu. Wysokie stê enia stosowane w BACTEC MGIT 960 zosta³y zaprojektowane jako ni sze ni stosowane w metodzie MOP. System BACTEC MGIT 960 zaprojektowano tak, e wynik dotycz¹cy opornoœci, zw³aszcza na streptomycynê, mo e nie zawsze korelowaæ z wynikiem opornoœci przy wysokim stê eniu w metodzie MOP. W sytuacji, gdy uzyskany wynik wskazuje, i dany szczep jest oporny na streptomycynê przy wysokim stê eniu leku, do oceny opornoœci przy tym stê eniu nale y zastosowaæ inn¹ metodê. ZASADY PROCEDURY Probówka wskaÿnikowa wzrostu pr¹tków BBL MGIT 7 ml jest to probówka zawieraj¹ca zmodyfikowany bulion Middlebrook 7H9, który wspomaga wzrost i wykrywanie pr¹tków 8008200 2007/03

(zobacz wk³adkê do opakowania BBL MGIT 7 ml). Na dnie pó³okr¹g³o zakoñczonej probówki MGIT (16 x 100 mm) znajduje siê osadzony w silikonie, fluorescencyjny komponent. Jest on wra liwy na dzia³anie rozpuszczonego w po ywce bulionowej tlenu. Pocz¹tkowo pojawia siê tylko niewielka fluorescencja, poniewa wstêpna du a iloœæ rozpuszczonego tlenu absorbuje emisje pochodz¹ce z komponentu. PóŸniej aktywnie rosn¹ce i oddychaj¹ce drobnoustroje wykorzystuj¹ tlen, co prowadzi do zwiêkszenia fluorescencji komponentu. Zestaw BACTEC MGIT 960 SIRE jest to 4 13-dniowy test jakoœciowy. Test polega na ocenie wzrostu szczepu M. tuberculosis w probówce zawieraj¹cej lek oraz w probówce bez leku (kontrola wzrostu). Urz¹dzenie BACTEC MGIT 960 w sposób ci¹g³y monitoruje nasilenie fluorescencji w probówkach. Analiza fluorescencji w probówce zawieraj¹cej lek w porównaniu do fluorescencji w probówce z kontrol¹ wzrostu wykorzystywana jest przez urz¹dzenie do okreœlenia wra liwoœci Urz¹dzenie BACTEC MGIT 960 automatycznie interpretuje te dane oraz podaje w wyniku, czy dany szczep jest oporny czy wra liwy. ODCZYNNIKI Zestaw BACTEC MGIT 960 SIRE zawiera po jednej fiolce z liofilizatem ka dego z leków streptomycyny, izoniazydu, rifampycyny oraz etambutolu i osiem fiolek zawieraj¹cych dodatek SIRE. Przybli ona formu³a* na fiolkê liofilizowanego leku: Streptomycyna... 332 µg Przybli ona formu³a* na fiolkê liofilizowanego leku: Izoniazyd... 33,2 µg Przybli ona formu³a* na fiolkê liofilizowanego leku: Rifampycyna... 332 µg Przybli ona formu³a* na fiolkê liofilizowanego leku: Etambutol... 1660 µg Zestaw BACTEC MGIT 960 IR zawiera po jednej fiolce z liofilizatem ka dego z leków izoniazydu oraz rifampycyny i 4 fiolek zawieraj¹cych dodatek SIRE. Przybli ona formu³a* na fiolkê liofilizowanego leku: Izoniazyd... 33,2 µg Przybli ona formu³a* na fiolkê liofilizowanego leku: Rifampycyna... 332 µg Zestaw BACTEC MGIT STR 4,0 zawiera jedn¹ fiolkê z liofilizowan¹ streptomycyn¹ i dwie fiolki zawieraj¹ce dodatek SIRE. Przybli ona formu³a* na fiolkê liofilizowanego leku: Streptomycyna... 664 µg Zestaw BACTEC MGIT INH 0,4 zawiera jedn¹ fiolkê z liofilizowanym izoniazydem i dwie fiolki zawieraj¹ce dodatek SIRE. Przybli ona formu³a* na fiolkê liofilizowanego leku: Izoniazyd... 66,4 µg Dodatek SIRE BACTEC MGIT 960 zawiera 20 ml dodatku wzbogacaj¹cego Middlebrook OADC Przybli ona formu³a* na litr wody oczyszczonej Albumina bydlêca...50,0 g Katalaza...0,03 g Dekstroza...20,0 g Kwas oleinowy...0,6 g *Skorygowany i (lub) uzupe³niony zgodnie z wymaganiami maj¹cymi na celu spe³nienie kryteriów wydajnoœci. Przechowywanie i przygotowanie odczynników: Fiolki z lekiem BACTEC MGIT 960 SIRE po otrzymaniu przechowywaæ fiolki z liofilizowanym lekiem w temperaturze 2 8 C. Po rozpuszczeniu roztwór antybiotyku mo na zamroziæ i przechowywaæ w temperaturze -20 C lub ni szej przez okres do szeœciu miesiêcy, o ile nie zostanie przekroczony termin przydatnoœci do u ytku. Po rozmro eniu natychmiast zu yæ. Wyrzuciæ niezu yte porcje. Dodatek SIRE BACTEC MGIT po otrzymaniu przechowywaæ w ciemnym pomieszczeniu, w temperaturze 2 8 C. Unikaæ zamra ania lub przegrzania. Otworzyæ i zu yæ przed up³ywem terminu przydatnoœci. Nale y chroniæ przed œwiat³em. Instrukcje u ytkowania: Rozpuœciæ ka d¹ fiolkê zestawu BACTEC MGIT 960 SIRE Streptomycyna zawieraj¹c¹ liofilizowany lek w 4 ml sterylnej destylowanej (dejonizowanej wody, aby przygotowaæ roztwór wyjœciowy o stê eniu 83 µg/ml. Rozpuœciæ ka d¹ fiolkê zestawu BACTEC MGIT 960 SIRE Izoniazyd zawieraj¹c¹ liofilizowany lek w 4 ml sterylnej destylowanej (dejonizowanej) wody, aby przygotowaæ roztwór wyjœciowy o stê eniu 8,3 µg/ml. Rozpuœciæ ka d¹ fiolkê zestawu BACTEC MGIT 960 SIRE Rifampycyna zawieraj¹c¹ liofilizowany lek w 4 ml sterylnej destylowanej (dejonizowanej) wody, aby przygotowaæ roztwór wyjœciowy o stê eniu 83 µg/ml. Rozpuœciæ ka d¹ fiolkê zestawu BACTEC MGIT 960 SIRE Etambutol zawieraj¹c¹ liofilizowany lek w 4 ml sterylnej destylowanej (dejonizowanej) wody, aby przygotowaæ roztwór wyjœciowy o stê eniu 415 µg/ml. UWAGA: Ni ej podane sk³adniki rozpuszcza siê w innej objêtoœci. Zastosowanie nieodpowiedniej iloœci sterylnej destylowanej wody do rozpuszczenia leku o wy szym stê eniu spowoduje uniewa nienie tych wyników testu. Rozpuœciæ ka d¹ fiolkê zestawu BACTEC MGIT 960 STR 4,0 zawieraj¹c¹ liofilizowan¹ streptomycynê w 2 ml sterylnej destylowanej (dejonizowanej) wody, aby uzyskaæ roztwór o stê eniu 332 µg/ml. 2

Rozpuœciæ ka d¹ fiolkê zestawu BACTEC MGIT 960 INH 0,4 zawieraj¹c¹ liofilizowany izoniazyd w 2 ml sterylnej destylowanej (dejonizowanej) wody, aby uzyskaæ roztwór o stê eniu 33,2 µg/ml. Ostrze enia i œrodki ostro noœci: Do stosowania w diagnostyce in vitro. POTENCJALNIE ZAKAŸNA PRÓBKA BADANA: W próbkach klinicznych mog¹ byæ obecne patogenne drobnoustroje jak wirus zapalenia w¹troby typu B i wirus HIV. Przy kontakcie z ka dym materia³em zanieczyszczonym krwi¹ lub innymi p³ynami ustrojowymi nale y przestrzegaæ Uniwersalnych œrodków ostro noœci 4-7 oraz instrukcji stosowanych w danej placówce. Praca z namna aj¹cymi siê hodowlami Mycobacterium tuberculosis wymaga stosowania metod dzia³ania oraz u ywania zabezpieczaj¹cego sprzêtu laboratoryjnego, zgodnych z wytycznymi praktyk bezpieczeñstwa biologicznego (BSL, Biosafety Level) poziomu 3. Nale y przeczytaæ wytyczne zawarte we wszystkich odpowiednich wk³adkach do produktów, w tym równie do probówki wskaÿnikowej wzrostu pr¹tków BBL MGIT 7 ml, i postêpowaæ zgodnie z nimi. Przed u yciem u ytkownik powinien sprawdziæ, czy probówki i fiolki nie s¹ zanieczyszczone lub uszkodzone. Wyrzuciæ wszelkie probówki lub fiolki, które wydaj¹ siê nieodpowiednie. Nale y dok³adnie sprawdziæ probówki, które zosta³y upuszczone. Jeœli widoczne s¹ jakiekolwiek uszkodzenia, probówkê nale y wyrzuciæ. W przypadku st³uczenia probówki: 1) Zamkn¹æ szuflady urz¹dzenia; 2) Wy³¹czyæ urz¹dzenie; 3) Niezw³ocznie opuœciæ miejsce; 4) Sprawdziæ wytyczne instytucji (CDC). Probówka, w której zachodzi wzrost bakterii, a przecieka lub zosta³a st³uczona, mo e doprowadziæ do powstawania aerozolu pr¹tków; nale y z ni¹ odpowiednio postêpowaæ. Przed wyrzuceniem nale y wysterylizowaæ w autoklawie wszystkie probówki MGIT, które poddano inokulacji. PRZYGOTOWANIE INOKULUM Wszystkie wymienione poni ej preparaty nale y wykonaæ z czystych kolonii M. tuberculosis. Laboratorium powinno potwierdziæ za pomoc¹ odpowiednich technik identyfikacyjnych, e wyizolowany szczep, który ma byæ badany, jest czyst¹ koloni¹ M. tuberculosis. Inokulum mo na przygotowaæ z pod³o a sta³ego lub probówki BACTEC MGIT 7 ml, w której uzyskano wynik dodatni. Ponadto do przygotowania probówki MGIT mo na wykorzystywaæ hodowle tworzone na p³ynie lub na pod³o u sta³ym, przetwarzane nastêpnie na inokulum. Poni ej opisano ka d¹ z tych opcji. Przygotowanie inokulum z pod³o a sta³ego: UWAGA: Wa ne jest, aby przygotowywaæ inokulum zgodnie z poni szymi instrukcjami, w celu uzyskania odpowiedniego stê enia drobnoustroju do wykonania testu wra liwoœci. 1. Dodaæ 4 ml bulionu BBL Middlebrook 7H9 (lub bulionu BBL MGIT) do sterylnej probówki 16,5 x 128 mm z zatyczk¹, zawieraj¹cej 8 10 szklanych kulek. 2. Zeskrobaæ za pomoc¹ sterylnej ezy tyle kolonii, wzrastaj¹cych nie wiêcej ni 14 dni, ile siê uda, próbuj¹c nie naruszyæ pod³o a sta³ego. Wykonaæ zawiesinê kolonii w bulionie Middlebrook 7H9. 3. Mieszaæ zawiesinê przez 2 3 min, aby rozbiæ wiêksze skupiska bakterii. Zawiesina powinna przekraczaæ standard 1,0 McFarland pod wzglêdem stopnia zmêtnienia. 4. Odstawiæ zawiesinê na 20 min. 5. Przenieœæ nads¹cz do innej sterylnej probówki 16,5 x 128 mm z zatyczk¹ (unikaæ przenoszenia osadu) i odstawiæ na kolejne 15 min. 6. Przenieœæ nads¹cz (powinien byæ jednorodny, pozbawiony skupisk bakterii) do trzeciej sterylnej probówki 16,5 x 128 mm. UWAGA: Zawiesina powinna byæ na tym etapie bardziej mêtna ni standard 0,5 McFarland. 7. Doprowadziæ zawiesinê pod wzglêdem stopnia zmêtnienia do standardu 0,5 McFarland, porównuj¹c j¹ wzrokowo ze standardem 0,5 McFarland. Nie obni aæ stopnia zmêtnienia poni ej standardu 0,5 McFarland. 8. Rozcieñczyæ 1 ml dostosowanej zawiesiny w 4 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej (rozcieñczenie 1:5). Przejœæ do czêœci Procedura inokulacji do przeprowadzenia testu wra liwoœci. Przygotowanie inokulum z probówki BACTEC MGIT 7 ml, w której uzyskano dodatni wynik hodowli: UWAGA: Istotne jest, aby przygotowywaæ inokulum, przestrzegaj¹c poni szych ram czasowych w celu uzyskania odpowiedniego stê enia drobnoustroju do przeprowadzenia testu wra liwoœci. 1. Pierwszy dzieñ, kiedy wynik hodowli w probówce MGIT urz¹dzenia zostanie uznany za dodatni, traktuje siê jako Dzieñ 0. 2. Do przygotowania inokulum testowego nale y wykorzystaæ probówkê 7 ml MGIT z wynikiem dodatnim; nale y to zrobiæ od jednego dnia po stwierdzeniu za pomoc¹ urz¹dzenia BACTEC MGIT 960, i jest ona dodatnia (Dzieñ 1), do pi¹tego dnia w³¹cznie (Dzieñ 5). Z probówki, w której wynik by³ dodatni przez okres d³u szy ni piêæ dni, nale y wykonaæ posiew do œwie ej probówki 7 ml MGIT zawieraj¹cej dodatek wzrostowy BACTEC MGIT 960 i badaæ na urz¹dzeniu BACTEC MGIT 960 do czasu stwierdzenia wyniku dodatniego oraz wykorzystaæ w okresie od 3

jednego do piêciu dni po stwierdzeniu wyniku dodatniego. Zob. Przygotowanie probówki Seed MGIT z pod³o a p³ynnego. 3. Je eli probówka wykazuje wynik dodatni w dniu 1 lub 2, do procedur inokulacyjnych nale y zastosowaæ zawiesinê w bulionie MGIT. Dobrze wymieszaæ. Przejœæ do Procedury inokulacji do wykonania testu wra liwoœci. 4. Je eli jest to Dzieñ 3, Dzieñ 4 lub Dzieñ 5 od chwili stwierdzenia wyniku dodatniego probówki, nale y dobrze wymieszaæ, a nastêpnie rozcieñczyæ 1 ml bulionu wykazuj¹cego wynik dodatni w 4 ml sterylnej soli fizjologicznej (rozcieñczenie 1:5). Dok³adnie wymieszaæ zawartoœæ probówki. Do procedury inokulacji stosowaæ rozcieñczon¹ zawiesinê. Przejœæ do Procedury inokulacji do wykonania testu wra liwoœci. Przygotowanie probówki Seed MGIT z pod³o a p³ynnego 1. Wymieszaæ probówkê, odwracaj¹c j¹ lub odwirowuj¹c. 2. Wykonaæ rozcieñczenie 1:100, dodaj¹c 0,1 ml hodowli do 10 ml po ywki BBL Middlebrook 7H9 Broth lub BBL MGIT Broth. Dok³adnie wymieszaæ. 3. Dodaæ 0,5 ml tej zawiesiny do 7 ml probówki MGIT wzbogaconej 0,8 ml dodatku wzrostowego BACTEC MGIT 960. 4. Szczelnie zamkn¹æ probówkê i delikatnie zamieszaæ, odwracaj¹c j¹ 2 3 razy. 5. Wprowadziæ probówkê do urz¹dzenia BACTEC MGIT 960 i sprawdzaæ, a do uzyskania dodatniego wyniku. UWAGA: Czas potrzebny do uzyskania dodatniego wyniku musi wynosiæ co najmniej 4 dni u ywania zawartoœci probówki jako inokulum AST. Je eli zawartoœæ probówki uzyska wynik dodatni przed up³ywem 4 dni, nale y przygotowaæ now¹ probówkê do posiewów, rozpoczynaj¹c procedurê od kroku 1. 6. Ta probówka mo e teraz byæ stosowana przez 1 5 dni od uzyskania dodatniego wyniku badania. Przejœæ do czêœci Przygotowanie inokulum z probówki BACTEC MGIT 7 ml, w której uzyskano dodatni wynik hodowli wy ej: Przygotowanie probówki Seed MGIT z pod³o a sta³ego 1. Stosuj¹c steryln¹ ezê, zebraæ wzrost posiewu z pod³o a skoœnego i dodaæ do 7 ml probówki MGIT wzbogaconej 0,8 ml dodatku wzrostowego BACTEC MGIT 960. 2. Szczelnie zamkn¹æ probówkê i delikatnie zamieszaæ, odwracaj¹c j¹ 2 3 razy. 3. Wprowadziæ probówkê do urz¹dzenia BACTEC MGIT 960 i kontrolowaæ, a do uzyskania wyniku dodatniego. UWAGA: Czas uzyskania wyniku dodatniego musi wynosiæ co najmniej 4 dni u ywania zawartoœci probówki jako inokulum AST. Je eli zawartoœæ probówki uzyska wynik dodatni przed up³ywem 4 dni, nale y przygotowaæ now¹ probówkê do posiewów, rozpoczynaj¹c procedurê od kroku 1. 4. Ta probówka mo e teraz byæ stosowana przez 1 5 dni od uzyskania dodatniego wyniku badania. Przejœæ do czêœci Przygotowanie inokulum z probówki BACTEC MGIT 7 ml, w której uzyskano dodatni wynik hodowli wy ej: PROCEDURA Dostarczane materia³y: Zestaw BACTEC MGIT 960 SIRE zawieraj¹cy po jednej fiolce ka dego liofilizowanego leku oraz osiem fiolek dodatku SIRE (oko³o 40 testów na lek w zestawie). Zestaw BACTEC MGIT 960 STR 4,0 zawieraj¹cy po jednej fiolce ka dego liofilizowanego leku oraz dwie fiolki dodatku SIRE (oko³o 20 testów na zestaw) i zestaw BACTEC MGIT 960 INH 0,4 zawieraj¹cy po jednej fiolce ka dego liofilizowanego leku i dwie fiolki dodatku SIRE (oko³o 20 testów na zestaw). Materia³y niezbêdne, ale niedostarczane: Probówki wskaÿnikowe wzrostu Mycobacterium BBL MGIT 7 ml, pomocnicze pod³o a hodowlane, odczynniki, szczepy do kontroli jakoœci oraz sprzêt laboratoryjny wymagany w procedurze. Procedura inokulacji do przeprowadzenia testu wra liwoœci dla zestawu BACTEC MGIT 960 SIRE: 1. Oznakowaæ po piêæ 7 ml probówek MGIT dla ka dego badanego wyizolowanego szczepu. Oznakowaæ jedn¹ jako kontrolê wzrostu (GC, Growth Control), jedn¹ jako STR, jedn¹ jako INH, jedn¹ jako RIF i jedn¹ jako EMB. Umieœciæ probówki w odpowiedniej kolejnoœci w odpowiedniej wielkoœci uchwycie zestawu AST (zobacz Podrêcznik U ytkownika BACTEC MGIT 960, Instrukcje AST). 2. Aseptycznie dodaæ do ka dej probówki 0,8 ml dodatku BACTEC MGIT SIRE. UWAGA: Istotne jest, aby stosowaæ dodatek dostarczony w zestawie. 3. Za pomoc¹ mikropipety aseptycznie dodaæ 100 µl roztworu MGIT STR o stê eniu 83 µg/ml do odpowiednio oznakowanej probówki MGIT. W sposób ja³owy dodaæ 100 µl roztworu MGIT INH o stê eniu 8,3 µg/ml do odpowiednio oznakowanej probówki MGIT. Aseptycznie dodaæ 100 µl roztworu MGIT RIF o stê eniu 83 µg/ml do odpowiednio oznakowanej probówki MGIT. Aseptycznie dodaæ 100 µl roztworu MGIT EMB o stê eniu 415 µg/ml do odpowiednio oznakowanej probówki MGIT. Nale y zwracaæ uwagê, aby dodaæ lek do odpowiadaj¹cej mu probówki. Nie nale y dodawaæ adnych antybiotyków do probówki MGIT GC. 4

Stê enie Objêtoœæ dodana Koñcowe stê enie Lek leku po do probówek MGIT w probówkach MGIT rozpuszczeniu* MGIT STR 83 µg/ml 100 µl 1,0 µg/ml MGIT INH 8,3 µg/ml 100 µl 0,1 µg/ml MGIT RIF 83 µg/ml 100 µl 1,0 µg/ml MGIT EMB 415 µg/ml 100 µl 5,0 µg/ml * Aby osi¹gn¹æ wskazane stê enia, leki nale y rozpuszczaæ w 4 ml sterylnej (dejonizowanej) wody. 4. Przygotowanie i inokulacja probówki z kontrol¹ wzrostu: Aseptycznie nanieœæ 0,1 ml zawiesiny drobnoustrojów (zobacz czêœæ Przygotowanie inokulum ) do 10 ml sterylnej soli fizjologicznej w celu przygotowania zawiesiny kontroli wzrostu 1:100. Wymieszaæ dok³adnie zawiesinê z kontrol¹ wzrostu. Nanieœæ 0,5 ml zawiesiny z roztworem kontroli wzrostu 1:100 do probówki MGIT oznakowanej GC. 5. Inokulacja probówek zawieraj¹cych lek: Aseptycznie przenieœæ 0,5 ml zawiesiny drobnoustrojów (patrz Przygotowanie inokulum ) do ka dej z CZTERECH pozosta³ych probówek z lekiem (STR, INH, RIF, EMB). 6. Dok³adnie zamkn¹æ probówki. Wymieszaæ dok³adnie zawartoœæ probówek, delikatnie odwracaj¹c trzy do czterech razy. 7. Wprowadziæ zestaw AST do aparatu BACTEC MGIT 960, u ywaj¹c wejœcia zestawu AST (patrz Podrêcznik U ytkowanika BACTEC MGIT 960, Instrukcje dotycz¹ce AST). Sprawdziæ, czy kolejnoœæ probówek w stojaku zestawu AST zgadza siê z oznakowaniami stojaka zestawu wybranymi podczas wykonywania ustawieñ wejœciowych zestawu AST. 8. Nanieœæ 0,1 ml zawiesiny drobnoustrojów na p³ytkê zawieraj¹c¹ pod³o e Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood (TSA II). Zamkn¹æ w plastikowym woreczku. Inkubowaæ w temperaturze 35 37 C. 9. Sprawdziæ p³ytki z agarem z krwi¹ po 48 h pod k¹tem zanieczyszczenia bakteryjnego. Je eli na p³ytce z agarem z krwi¹ nie stwierdza siê wzrostu, kontynuowaæ testowanie AST. Je eli na p³ytce z agarem z krwi¹ stwierdza siê wzrost, wyrzuciæ zestaw AST (patrz Podrêcznik u ytkownika BACTEC MGIT 960, Instrukcje dotycz¹ce AST) i powtórzyæ badanie przy u yciu czystej hodowli. Procedura inokulacji do testu wra liwoœci przy pomocy zestawów BACTEC MGIT STR 4,0 i INH 0,4: Je eli przy stê eniu krytycznym stwierdza siê opornoœæ, zaleca siê wykonanie testu profilu wra liwoœci, który przynajmniej wyka e wysokie stê enie leku, wobec którego dany szczep by³ pocz¹tkowo oporny. Ÿród³o pochodzenia izolowanego szczepu: Izolowany szczep stosowany do testowania musi zostaæ przygotowany tak jak opisano w rozdziale Przygotowanie inokulum. Probówkê do posiewów mo na przygotowaæ z probówki z kontrol¹ wzrostu niezawieraj¹cej leku, z uprzednio przebadanego za pomoc¹ zestawu AST szczepu, oprzez inokulacjê 0,5 ml do œwie ej probówki MGIT 7 ml zawieraj¹cej dodatek wzrostowy BACTEC MGIT 960. Jeœli probówka do posiewów wykazuje w urz¹dzeniu wynik dodatni, postêpowaæ tak, jak opisano w rozdziale Przygotowanie inokulum : Przygotowanie próbki z dodatniej probówki MGIT. 1. Oznakowaæ wystarczaj¹c¹ liczbê probówek MGIT 7 ml dla testowanego szczepu, aby mieæ probówkê MGIT GC (kontrola wzrostu) oraz probówkê MGIT dla ka dego badanego leku przeciwbakteryjnego. Umieœciæ probówki w odpowiedniej kolejnoœci w odpowiedniej wielkoœci stojaku zestawu AST (patrz Podrêcznik U ytkownika BACTEC MGIT 960, Instrukcje dotycz¹ce AST). 2. Zgodnie z zasadami aseptyki dodaæ 0,8 ml dodatku BACTEC MGIT SIRE do ka dej probówki. UWAGA: Nale y u ywaæ dodatku dostarczonego z zestawem. 3. Za pomoc¹ mikropipety aseptycznie dodaæ 100 µl roztworu leku do odpowiednio oznakowanej probówki MGIT. Nale y zwracaæ uwagê, aby dodaæ lek do odpowiadaj¹cej mu probówki. Nie nale y dodawaæ adnych antybiotyków do probówki MGIT GC. Stê enie Objêtoœæ dodana Koñcowe stê enie Lek leku po do probówek MGIT w celu w probówkach rozpuszczeniu* przeprowadzenia testu MGIT MGIT STR 4.0 332 µg/ml 100 µl 4,0 µg/ml MGIT INH 0.4 33,2 µg/ml 100 µl 0,4 µg/ml * Aby osi¹gn¹æ wskazane stê enia, leki nale y rozpuszczaæ w 2 ml sterylnej (dejonizowanej) wody. 4. Przygotowanie i inokulacja probówki z kontrol¹ wzrostu: Aseptycznie nanieœæ 0,1 ml zawiesiny drobnoustrojów (zobacz czêœæ Przygotowanie inokulum ) do 10 ml sterylnej soli fizjologicznej w celu przygotowania zawiesiny kontroli wzrostu 1:100. Wymieszaæ dok³adnie zawiesinê z kontrol¹ wzrostu. Nanieœæ 0,5 ml zawiesiny z roztworem kontroli wzrostu 1:100 do probówki MGIT oznakowanej GC. 5. Inokulacja probówek zawieraj¹cych lek: Aseptycznie przenieœæ 0,5 ml zawiesiny drobnoustrojów (patrz Przygotowanie inokulum ) do ka dej probówki z lekiem. 6. Dok³adnie zamkn¹æ probówki. Wymieszaæ dok³adnie zawartoœæ probówek, delikatnie odwracaj¹c trzy do czterech razy. 5

7. Wprowadziæ zestaw AST do urz¹dzenia BACTEC MGIT 960, u ywaj¹c wejœcia zestawu AST (zobacz Podrêcznik U ytkownika BACTEC MGIT 960, Instrukcje dotycz¹ce AST). Sprawdziæ, czy kolejnoœæ probówek w stojaku zestawu AST zgadza siê z oznakowaniami stojaka zestawu wybranymi podczas okreœlania wejœcia zestawu AST. 8. Nanieœæ 0,1 ml zawiesiny drobnoustrojów na p³ytkê zawieraj¹c¹ pod³o e Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood (TSA II). Zamkn¹æ w plastikowym woreczku. Inkubowaæ w temperaturze 35 37 C. 9. Sprawdziæ p³ytki z agarem z krwi¹ po 48 h pod k¹tem zanieczyszczenia bakteryjnego. Je eli na p³ytce z agarem z krwi¹ nie stwierdza siê wzrostu, kontynuowaæ testowanie AST. Je eli na p³ytce z agarem z krwi¹ stwierdza siê wzrost, wyrzuciæ zestaw AST (patrz Podrêcznik u ytkownika BACTEC MGIT 960, Instrukcje dotycz¹ce AST) i powtórzyæ badanie przy u yciu czystej hodowli. UWAGA: Testy wra liwoœci mog¹ byæ ró nie konfigurowane. Na przyk³ad w systemie mo na skonfigurowaæ zestaw ze stojakiem na piêæ probówek zawieraj¹cy wy³¹cznie krytyczne stê enia. Mo na skonfigurowaæ ró ne inne zestawy stojaków probówek, w zale noœci od opcjonalnego profilu przeprowadzanych testów (patrz Podrêcznik u ytkownika BACTEC MGIT 960, Instrukcje dotycz¹ce AST). Kontrola jakoœci przez u ytkownika: Po otrzymaniu nowej dostawy lub fiolek zestawu BACTEC MGIT 960 SIRE o nowym numerze serii, zaleca siê przebadanie kontrolnych drobnoustrojów przedstawionych poni ej. Kontrolny drobnoustrój powinien pochodziæ z czystej hodowli, a hodowla powinna byæ przygotowana zgodnie z instrukcjami zawartymi w rozdziale PRZYGOTOWANIE INOKULUM. Zestaw do kontroli jakoœci (QC) AST powinien zostaæ przygotowany zgodnie z instrukcjami zawartymi w rozdziale Procedura inokulacji w celu przeprowadzenia testu wra liwoœci dla badanych zestawów leków. Podczas przygotowywania zestawu QC AST wa ne jest odpowiednie rozpuszczenie liofilizowanych leków oraz odpowiednie rozcieñczenie drobnoustroju QC do probówek z kontrol¹ wzrostu oraz probówek z lekami. Nale y zwracaæ uwagê, aby dodaæ lek do odpowiadaj¹cej mu probówki oznaczonej etykiet¹. Stosowanie wra liwych na wszystkie leki drobnoustrojów QC nie pozwala na wykrycie nieodpowiedniego leku wprowadzonego do probówek zestawu AST. Jak pokazano poni ej, obserwacja odpowiednich wyników w ci¹gu 4 13 dni wskazuje, e zestawy BACTEC MGIT 960 SIRE s¹ gotowe do u ycia w badaniu szczepów izolowanych pobranych od pacjenta. Je eli nie stwierdza siê odpowiednich wyników, nale y powtórzyæ test. Je eli po powtórzeniu testu nadal nie stwierdza siê odpowiednich wyników, nie stosowaæ produktu do czasu skontaktowania siê z Dzia³em Technicznym. Szczep GC MGIT STR MGIT INH MGIT RIF MGIT EMB M. tuberculosis Wynik ATCC 27294 dodatni Wra liwe Wra liwe Wra liwe Wra liwe Szczep GC MGIT STR 4.0 MGIT INH 0.4 M. tuberculosis Wynik ATCC 27294 dodatni Wra liwe Wra liwe Ten sam drobnoustrój kontrolny powinien byæ stosowany jako seria QC raz w tygodniu, kiedy prowadzi siê oznaczanie wra liwoœci. Je eli seria QC daje nieodpowiednie wyniki, nie nale y podawaæ wyników oznaczeñ próbek pochodz¹cych od pacjenta wobec leku (leków), których wyniki w danym okresie testowania by³y nieprawid³owe. Powtórzyæ QC dla leku (leków) i szczepów izolowanych od pacjenta, na które mia³y wp³yw pocz¹tkowe nieprawid³owe wyniki QC. Je eli wynik powtórzenia QC nie jest zgodny z oczekiwaniami, nie nale y podawaæ wyników oznaczeñ próbek pochodz¹cych od pacjenta. Nie stosowaæ produktu do czasu skontaktowania siê z Dzia³em Technicznym. Podczas zewnêtrznej oceny zestawów BACTEC MGIT 960 SIRE najczêstszymi przyczynami z³ych wyników QC by³o zanieczyszczenie hodowli QC, zbyt du a (zbyt ma³a) inokulacja zestawów AST, dodanie leku do nieodpowiednich probówek oraz nieprawid³owe warunki w urz¹dzeniu. WYNIKI Urz¹dzenie BACTEC MGIT 960 monitoruje zestawy AST do czasu stwierdzenia, czy dany szczep jest oporny czy wra liwy. Po zakoñczeniu testowania zestawu wyniki podawane s¹ przez urz¹dzenie BACTEC MGIT 960 (zobacz Podrêcznik U ytkownika BACTEC MGIT 960, Instrukcje dotycz¹ce AST). Urz¹dzenie BACTEC MGIT 960 podaje wynik zestawu AST jako B³¹d(X) brak interpretacji wra liwoœci, kiedy zachodz¹ pewne warunki, które mog¹ wp³yn¹æ na wyniki testu. Warunki, które mog¹ dawaæ B³¹d(X), opisane s¹ w Instrukcji AST, Rozdzia³ 7 Rozwi¹zywanie problemów, w Podrêczniku U ytkownika BACTEC MGIT 960. Podczas podawania wyników nale y podaæ metodê badania, nazwê i stê enie leku oraz to, czy wynik uzyskano przy pomocy BACTEC MGIT 960 czy innej metody. W celu ustalenia odpowiedniego schematu leczenia oraz dawek leków nale y skonsultowaæ siê ze specjalist¹ chorób p³uc i (lub) specjalist¹ chorób zakaÿnych zajmuj¹cymi siê kontrol¹ TB. W razie uzyskania niespodziewanych wyników dotycz¹cych opornoœci sprawdziæ, czy badane szczepy identyfikowane s¹ jako M. tuberculosis. Upewniæ siê, e do badania wykorzystano wy³¹cznie czyst¹ 6

hodowlê (wykluczyæ obecnoœæ mieszanych pr¹tków, itd.). Izolowana opornoœæ na etambutol jest rzadko spotykana i nale y j¹ zweryfikowaæ 2,8. Podawanie wyników dla krytycznych stê eñ leku przy stosowaniu metody BACTEC MGIT 960 SIRE Lek MGIT 960 Zalecany raport Postêpowanie (stê enie) wynik STR (1,0 µg/ml) INH (0,1 µg/ml) RIF (1,0 µg/ml) Wra liwy (SIRE) Oporny (SIR) Szczep przebadany za pomoc¹ BACTEC MGIT 960 [lek/stê enie] i jest wra liwy. Szczep przebadany za pomoc¹ BACTEC MGIT 960 [lek/stê enie] i jest oporny. Podaæ wyniki testowania [leku] w wy szym stê eniu (je eli badano). Nie podejmowaæ adnego dzia³ania. Zaleca siê badanie przy wy szych stê eniach (STR i (lub) INH). EMB (5,0 µg/ml) Oporny (E) Je eli szczep oporny jest nie tylko na etambutol (EMB) Szczep przebadany za pomoc¹ BACTEC MGIT 960 [Etambutol 5,0 µg/ml] i jest oporny. Skonsultowaæ siê z laboratorium, aby przetestowaæ EMB w wy szym stê eniu. Je eli szczep oporny jest w³¹cznie na etambutol (EMB) Szczep przebadany za pomoc¹ BACTEC MGIT 960 [Etambutol 5,0 µg/ml] i jest oporny. Rzadko wystêpuje izolowana opornoœæ na etambutol. Skonsultowaæ siê z laboratorium w celu potwierdzenia Nie podawaæ wyniku. Zaleca siê badanie przy wy szych stê eniach EMB za pomoc¹ innej metody. Zaleciæ przebadanie EMB zarówno w stê eniu krytycznym, jak i w wy szym stê eniu za pomoc¹ innej metody. Powtórzyæ test. B³¹d (X) Podawanie wyników dla STR 4,0 i INH 0,4 BACTEC MGIT 960 Lek MGIT 960 Zalecany raport Postêpowanie (stê enie) wynik STR (4,0 µg/ml) INH (0,4 µg/ml) Wra liwy Oporny B³¹d (X) Wra liwy Oporny B³¹d (X) Szczep przebadany za pomoc¹ BACTEC MGIT 960 dla streptomycyny 4,0 i jest wra liwy. Ten szczep wykazuj¹cy opornoœæ przy stê eniu 1,0 µg/ml i wra liwoœæ przy stê eniu 4,0 µg/ml, wykazuje niski poziom opornoœci na streptomycynê. Szczep przebadany za pomoc¹ BACTEC MGIT 960 dla streptomycyny 4,0 i jest oporny. Skonsultowaæ siê z laboratorium w celu potwierdzenia. Nie podawaæ wyniku. Szczep przebadany za pomoc¹ BACTEC MGIT 960 dla izoniazydu 0,4 µg/ml i jest wra liwy. Ten szczep wykazuj¹cy opornoœæ przy stê eniu 0,1 µg/ml i wra li-woœæ przy stê eniu 4,0 µg/ml, wykazuje niski poziom opornoœci na izoniazyd. Szczep przebadany za pomoc¹ BACTEC MGIT 960 dla izoniazydu 0,4µg/mL i jest oporny. Nie podawaæ wyniku. Nie podejmowaæ adnego dzia³ania. Szczep nale y przebadaæ za pomoc¹ innej metody, aby sprawdziæ wynik. Powtórzyæ test. Nie podejmowaæ adnego dzia³ania. Nie podejmowaæ adnego dzia³ania. Powtórzyæ test. OGRANICZENIA PROCEDURY Test wra liwoœci BACTEC MGIT 960 nie pozwala na interpretacjê stopnia wra liwoœci badanego szczepu. Wyniki podawane s¹ jako wra liwy (S susceptible) lub oporny (R resistant) dla badanego leku i danego stê enia. Test BACTEC MGIT 960 SIRE powsta³ przy wykorzystaniu krytycznych stê eñ dla streptomycyny, izoniazydu, rifampycyny i etambutolu, nieco ni szych ni stê enia krytyczne stosowane w metodzie MOP, co pozwala na unikniêcie wyników fa³szywie wskazuj¹cych na wra liwoœæ. Zalecane badanie wy szych stê eñ zwiêksza zdolnoœæ wykrywania szczepów o niskim poziomie opornoœci. Testy wra liwoœci BACTEC MGIT 960 mog¹ byæ wykonywane wy³¹cznie za pomoc¹ urz¹dzenia BACTEC MGIT 960. Zestawy AST nie mog¹ byæ odczytywane rêcznie. 7

Stosowaæ wy³¹cznie czyste hodowle M. tuberculosis. Hodowle zanieczyszczone lub zawieraj¹ce wiele ró nych gatunków pr¹tków mog¹ dawaæ b³êdne wyniki i nie powinny byæ oceniane. Bezpoœrednie badanie próbek klinicznych nie jest zalecane. Nale y odczekaæ okreœlony czas przed standaryzacj¹ przy wykonywaniu zawiesin z pod³o a sta³ego. Inokulum przygotowywane z pod³o a sta³ego powinno byæ porównane wzrokowo ze standardem zmêtnienia 0,5 McFarland; niewykonanie takiego porównania mo e daæ niedok³adne wyniki i spowodowaæ b³¹d zestawu AST. Je eli w celu inokulacji probówek zawieraj¹cych lek nie zastosuje siê rozcieñczenia 1:5 zawiesiny drobnoustrojów, wyniki mog¹ byæ niedok³adne. Je eli do inokulacji probówki z kontrol¹ wzrostu nie jest stosowane rozcieñczenie 1:100 zawiesiny drobnoustrojów, wyniki mog¹ byæ niedok³adne lub mo e powstaæ b³¹d zestawu AST. Je eli leki nie zostan¹ rozcieñczone w odpowiedniej objêtoœci sterylnej destylowanej (dejonizowanej) wody, wyniki mog¹ byæ niedok³adne. Istotne jest dok³adne wymieszanie zawartoœci probówek po inokulacji. Je eli zawartoœæ probówek nie zostanie dok³adnie wymieszana, mo na uzyskaæ wyniki œwiadcz¹ce o fa³szywej opornoœci. Je eli probówki zestawu AST nie zostan¹ wprowadzone do stojaka zestawu AST w odpowiedniej kolejnoœci, uzyskane wyniki mog¹ byæ niedok³adne. Je eli nie zostanie wybrany odpowiedni opis stojaka zestawu, wyniki mog¹ byæ b³êdne lub niedok³adne. Je eli zestaw AST nie zostanie prawid³owo za³adowany do urz¹dzenia, spowoduje to powstanie warunków anonimowych, które nale y zmieniæ w ci¹gu 8 h. Je eli stan ten nie zostanie usuniêty w ci¹gu 8 h, zestaw AST nale y wyrzuciæ i ustawiæ nowy. Je eli do zestawu AST nie zostanie wprowadzony dodatek SIRE, uzyskane wyniki mog¹ byæ nieprawid³owe. NIE dodawaæ dodatku wzrostowego BACTEC MGIT 960 do zestawu AST. OCZEKIWANE WARTOŒCI Za pomoc¹ testu wra liwoœci BACTEC MGIT 960 SIRE przebadano 106 pochodz¹cych z próbek klinicznych szczepów M. tuberculosis w czterech ró nych geograficznie oœrodkach. Testowanie obejmowa³o zarówno œwie e szczepy pochodz¹ce z próbek klinicznych, jak i szczepy zapasowe, zarówno z hodowli p³ynnych, jak i z pod³o y sta³ych. Wykonano 200 testów wra liwoœci (z pod³o a p³ynnego i sta³ego) przy krytycznych stê eniach streptomycyny (STR), izoniazydu (INH) oraz rifampycyny (RIF) oraz 223 testy wra liwoœci (z pod³o a p³ynnego i sta³ego) przy krytycznych stê eniach etambutolu (EMB) w osobnych badaniach. Œredni ca³kowity czas do uzyskania wyniku w teœcie wra liwoœci BACTEC MGIT 960 SIRE wynosi³ od siedmiu do oœmiu dni przy zakresie od czterech do czternastu dni. Dane przedstawiono na rysunku 1 (zobacz strona 12). CHARAKTERYSTYKA BADANIA Badania analityczne Zakres inokulum AST dla pod³o y p³ynnych i sta³ych: Pod³o a p³ynne Zalecana procedura dla przygotowania zestawu AST z probówki MGIT 7 ml z wynikiem dodatnim wykorzystuje bezpoœrednie inokulum w Dniu 1 i Dniu 2 po uzyskaniu wyniku dodatniego oraz rozcieñczone (1:5) inokulum w Dniach od 3 do 5 po uzyskaniu wyniku dodatniego. Badanie wewnêtrzne wykazuj¹, e inokulum przygotowane w dniach od 1 do 5 z probówki MGIT 7 ml, w której uzyskano wynik dodatni, mieœci siê w zakresie 0,8 x 10 5 do 3,2 x 10 5 CFU/mL. Pod³o e sta³e Zalecana procedura do przygotowania zestawu AST ze wzrostu na pod³o u sta³ym (do 14 dni) wykorzystuje rozcieñczenie 1:5 zawiesiny drobnoustrojów, równowa ne standardowi 0,5 McFarland. Badanie wewnêtrzne wykazuj¹, e inokulum przygotowane z hodowli na pod³o u sta³ym mieœci siê w zakresie 1,4 x 10 5 do 2,4 x 10 6 CFU/mL. Powtarzalnoœæ serii: Powtarzalnoœæ serii oceniana by³a przy zastosowaniu dwudziestu piêciu szczepów M. tuberculosis (w tym piêæ szczepów ATCC). Ka dy test BACTEC MGIT 960 SIRE przy krytycznym stê eniu leku wykonywany by³ trzykrotnie, a wiêc uzyskano siedemdziesi¹t piêæ wyników dla ka dego leku. Ka de powtórzenie dotyczy³o odmiennych wyników testu i ró ni³o siê numerem serii stosowanego leku SIRE oraz dodatku SIRE (trzy ró ne serie dla ka dego). Szczepy, które by³y oporne na streptomycynê, izoniazyd i etambutol we wstêpnym teœcie, badane by³y nastêpnie przy u yciu wysokiego stê enia leku, za wyj¹tkiem szczepów ATCC. Oprócz badanych szczepów opornych do testu na profil wra liwoœci w³¹czono dwa szczepy wra liwe na STR (stê enie krytyczne), dwa szczepy wra liwe na INH (stê enie krytyczne) oraz dwa szczepy wra liwe na EMB (stê enie krytyczne). Obserwowane wyniki porównano z wynikami oczekiwanymi. Ca³kowita powtarzalnoœæ dla ka dego leku przy stê eniu krytycznym wynosi 96% dla STR, 100% dla INH, 100% dla RIF oraz 100% dla EMB. Ca³kowita powtarzalnoœæ dla ka dego leku przy wysokim stê eniu wynosi 96% dla STR 4,0 i 100% dla INH 0,4. 8

Testowanie zestawu CDC: Wykonanie testu wra liwoœci BACTEC MGIT 960 SIRE oceniono za pomoc¹ zestawu specjalnych szczepów uzyskanych z Oœrodków Zapobiegania i Zwalczania Chorób (CDC,Centers for Disease Control and Prevention), GA, USA. Zestaw sk³ada³ siê z trzydziestu szczepów M. tuberculosis o znanej wra liwoœci (ocenionej za pomoc¹ MOP). Zestaw testowany by³ dwukrotnie za pomoc¹ testu wra liwoœci BACTEC MGIT 960 SIRE i oba wyniki by³y zgodne. Wyniki uzyskane za pomoc¹ BACTEC MGIT 960 SIRE porównano z oczekiwanymi wynikami CDC. Ca³kowita zgodnoœæ z oczekiwanymi wynikami CDC dla ka dego leku przy stê eniu krytycznym wynosi 93% dla STR, 100% dla INH, 100% dla RIF oraz 100% dla EMB. Ca³kowita zgodnoœæ z oczekiwanymi wynikami CDC dla ka dego leku przy wysokim stê eniu 100% dla STR 4,0 oraz 100% dla INH 0,4. Ocena kliniczna Test wra liwoœci BACTEC MGIT 960 SIRE oceniono w czterech odmiennych geograficznie oœrodkach, oceniono w czterech oddalonych geograficznie oœrodkach, w sk³ad których wchodzi³y regionalne centra referencyjne oraz uniwersyteckie laboratoria przyszpitalne, w tym równie w jeden oœrodek poza USA. Test wra liwoœci BACTEC MGIT 960 SIRE porównano z metod¹ proporcji (MOP) 2 do oceny wra liwoœci. Wstêpna ocena obejmowa³a streptomycynê, izoniazyd i rifampycynê. Odrêbn¹ ocenê przeprowadzono dla etambutolu. Badanie powtarzalnoœci: Powtarzalnoœæ testu BACTEC MGIT 960 SIRE oceniono w oœrodkach klinicznych za pomoc¹ zestawu dziesiêciu kwalifikowanych szczepów, obejmuj¹cego kilka szczepów opornych na ka dy z leków. Wyniki uzyskane za pomoc¹ testu BACTEC MGIT 960 SIRE porównano z oczekiwanymi wynikami. Ca³kowita powtarzalnoœæ dla ka dego leku przy stê eniu krytycznym wynosi 98,9% dla STR, 99,7% dla INH, 99,2% dla RIF oraz 97,5% dla EMB. Powtarzalnoœæ w poszczególnych oœrodkach zawiera³a siê w przedziale od 89,9% do 100% dla po³¹czonych wyników przy krytycznych stê eniach leku. Ca³kowita powtarzalnoœæ dla ka dego leku przy wysokim stê eniu wynosi 99,7% dla STR 4,0 i 95,6% dla INH 0,4. Powtarzalnoœæ w poszczególnych oœrodkach zawiera³a siê w przedziale od 92,2% do 100% dla po³¹czonych wyników przy wysokich stê eniach leku. Testowanie zestawu CDC: Wykonanie testu wra liwoœci BACTEC MGIT 960 SIRE oceniono za pomoc¹ zestawu specjalnych szczepów uzyskanych z Oœrodków Zapobiegania i Zwalczania Chorób (CDC,Centers for Disease Control and Prevention), GA, USA. Zestaw sk³ada³ siê z trzydziestu szczepów M. tuberculosis o znanej wra liwoœci (ocenionej za pomoc¹ MOP), testowanych przez ka dy oœrodek kliniczny. Tabela 1 przedstawia zgodnoœæ testu wra liwoœci BACTEC MGIT 960 SIRE dla ka dego leku w porównaniu z oczekiwanymi wynikami CDC. Tabela 1: Badanie szczepów zestawu CDC za pomoc¹ testu BACTEC MGIT 960 w oœrodkach klinicznych MGIT 960 Liczba Liczba wyników % wyników testów poprawnych poprawnych STR 1,0 120 111 92,5 INH 0,1 120 119 99,2 RIF 1,0 120 120 100 EMB 5,0 119 111 93,3 STR 4,0 29* 29 100 INH 0,4 87* 82 94,3 * Testy STR 4,0 oraz INH 0,4 wykonano wy³¹cznie dla szczepów opornych przy stê eniach krytycznych. Badanie szczepów pochodz¹cych z próbek klinicznych: Za pomoc¹ testu wra liwoœci BACTEC MGIT 960 SIRE oraz testu wra liwoœci MOP przebadano 106 szczepów M. tuberculosis izolowanych z próbek klinicznych. Badanie obejmowa³o zarówno œwie e szczepy pochodz¹ce z próbek klinicznych, jak i szczepy zapasowe, zarówno z hodowli p³ynnych, jak i z pod³o y sta³ych. Da³o to razem 195 wyników wstêpnych testów wra liwoœci dla streptomycyny, izoniazydu i rifampycyny (stê enie krytyczne). Przeprowadzono odrêbn¹ ocenê dla etambutolu z zamro onych próbek oryginalnych szczepów pochodz¹cych z próbek klinicznych i zapasowych, jak równie z prospektywnych szczepów pochodz¹cych z próbek klinicznych z hodowli na pod³o ach p³ynnych i sta³ych. Da³o to razem 223 wyniki testów dla etambutolu w stê eniu krytycznym. Tabela 2 przedstawia wyniki badania szczepu pochodz¹cego z próbki klinicznej dla ka dego leku (stê enie krytyczne) z hodowli na pod³o u p³ynnym. Tabela 3 przedstawia wyniki badania szczepu pochodz¹cego z próbki klinicznej dla ka dego leku (stê enie krytyczne) z hodowli na pod³o u sta³ym. 9

Tabela 2: Wyniki dla szczepu pochodz¹cego z próbki klinicznej BACTEC MGIT 960 AST w porównaniu do metody proporcji z hodowli na pod³o u p³ynnym Metoda proporcji (MOP) MGIT 960 AST System LEK Stê enie Stê enie Wra liwoœæ Opornoœæ S R liczba wyników % zgodnoœci: liczba wyników % zgodnoœci: zgodnych: (95% CI) zgodnych: (95% CI) STR 2,0 µg/ml 69 27 1,0 µg/ml 62 90 26 96 (80 96) (81 100) INH 0,2 µg/ml 59 37 0,1 µg/ml 57 97 36 97 (88 100) (86 100) RIF 1,0 µg/ml 72 24 1,0 µg/ml 71 99 24 100 (93 100) (95 100) EMB 5,0 µg/ml 91 20 5,0 µg/ml 88 97 17 85 (91 99) (62 97) Wszystkie szczepy, które wykazywa³y wyniki niezgodne w MGIT zosta³y przetestowane metod¹ MOP w dwóch niezale nych oœrodkach. Spoœród siedmiu szczepów wykazuj¹cych niezgodnoœæ wobec opornoœci na STR (R-960, S-MOP), trzy uzyska³y wyniki œwiadcz¹ce o opornoœci w obu oœrodkach, a jeden uzyska³ w obu oœrodkach wynik œwiadcz¹cy o wra liwoœci. Pozosta³e trzy uzyska³y wyniki œwiadcz¹ce o opornoœci w jednym oœrodku oraz wynik œwiadcz¹cy o wra liwoœci w innym oœrodku. Szczep, który uzyska³ niezgodny wynik dotycz¹cy wra liwoœci na STR (S-960, R-MOP),uzyska³ wyniki œwiadcz¹ce o wra liwoœci w obu oœrodkach. Dwa szczepy, które uzyska³y niezgodne wyniki dotycz¹ce opornoœci na INH (R-960, S-MOP), uzyska³y wyniki œwiadcz¹ce o wra liwoœci w obu oœrodkach. Szczep, który uzyska³ niezgodny wynik dotycz¹cy wra liwoœci na INH (S-960, R-MOP) uzyska³ wyniki œwiadcz¹ce o wra liwoœci w obu oœrodkach. Szczep, który uzyska³ niezgodny wynik dotycz¹cy opornoœci na RIF (R-960, S-MOP) uzyska³ wynik œwiadcz¹cy o opornoœci w obu oœrodkach. Trzy szczepy, które uzyska³y niezgodne wyniki dotycz¹ce opornoœci na EMB (R-960, S-MOP) uzyska³y wyniki œwiadcz¹ce o wra liwoœci w obu oœrodkach. Spoœród trzech szczepów wykazuj¹cych niezgodnoœæ wobec wra liwoœci na EMB (S-960, R-MOP), dwa uzyska³y wyniki œwiadcz¹ce o wra liwoœci w obu oœrodkach, a jeden uzyska³ wynik œwiadcz¹cy o opornoœci w jednym oœrodku i wynik œwiadcz¹cy o wra liwoœci w innym oœrodku. Tabela 3: Wyniki dla szczepu pochodz¹cego z próbki klinicznej BACTEC MGIT 960 AST w porównaniu do metody proporcji z hodowli na pod³o u sta³ym Metoda proporcji (MOP) System MGIT 960 AST LEK Stê enie Stê enie Wra liwoœæ Opornoœæ S R liczba wyników % zgodnoœci: liczba wyników % zgodnoœci: zgodnych: (95% CI) zgodnych: (95% CI) STR 2,0 µg/ml 70 29 1,0 µg/ml 65 93 28 97 (84 98) (82 100) INH 0,2 µg/ml 63 36 0,1 µg/ml 62 98 35 97 (92 100) (86 100) RIF 1,0 µg/ml 70 29 1,0 µg/ml 70 100 26 90 (95 100) (73 98) EMB 5,0 µg/ml 87 25 5,0 µg/ml 86 99 20 80 (94 100) (59 93) Wszystkie szczepy, które wykazywa³y wyniki niezgodne w MGIT, zosta³y przetestowane metod¹ MOP w dwóch niezale nych oœrodkach. Spoœród piêciu szczepów wykazuj¹cych niezgodnoœæ wobec opornoœci na STR (R-960, S-MOP), dwa uzyska³y wyniki œwiadcz¹ce o opornoœci w obu oœrodkach, a jeden uzyska³ w obu oœrodkach wynik œwiadcz¹cy o wra liwoœci. Pozosta³e dwa uzyska³y wynik œwiadcz¹cy o opornoœci w jednym oœrodku oraz wynik œwiadcz¹cy o wra liwoœci w drugim oœrodku. Szczep, który uzyska³ niezgodny wynik dotycz¹cy wra liwoœci na STR (S-960, R-MOP), uzyska³ wyniki œwiadcz¹ce o opornoœci w obu oœrodkach. Szczep, który uzyska³ niezgodny wynik dotycz¹cy opornoœci na INH (R-960, S-MOP) uzyska³ wyniki œwiadcz¹ce o wra liwoœci w obu oœrodkach. Szczep, który uzyska³ niezgodny wynik dotycz¹cy wra liwoœci na INH (S-960, R-MOP), uzyska³ wyniki œwiadcz¹ce o opornoœci w obu oœrodkach. Trzy szczepy, które uzyska³y niezgodne wyniki dotycz¹ce wra liwoœci na RIF (S-960, R-MOP), uzyska³y wyniki œwiadcz¹ce o wra liwoœci w obu oœrodkach. Szczep, który uzyska³ niezgodny wynik dotycz¹cy opornoœci na EMB (R-960, S-MOP), uzyska³ wynik œwiadcz¹cy o opornoœci w obu oœrodkach. Spoœród piêciu szczepów, które uzyska³y niezgodne wyniki dotycz¹ce wra liwoœci na EMB (S-960, R-MOP), cztery uzyska³y wyniki œwiadcz¹ce o wra liwoœci w obu oœrodkach. Pozosta³y szczep uzyska³ wynik œwiadcz¹cy o opornoœci w jednym oœrodku oraz wynik œwiadcz¹cy o wra liwoœci w innym oœrodku. Tabela 4 przedstawia wyniki badania szczepu pochodz¹cego z próbki klinicznej dla streptomycyny i izoniazydu (wysokie stê enie) z hodowli na pod³o u p³ynnym. Tabela 5 przedstawia wyniki badania szczepu pochodz¹cego z próbki klinicznej dla streptomycyny i izoniazydu (wysokie stê enie) z hodowli na pod³o u sta³ym. 10

Tabela 4: Wyniki dla szczepu pochodz¹cego z próbki klinicznej BACTEC MGIT 960 AST w porównaniu do metody proporcji z hodowli na pod³o u p³ynnym Metoda proporcji (MOP) System MGIT 960 AST LEK Stê enie Stê enie Wra liwoœæ Opornoœæ S R liczba wyników % zgodnoœci: liczba wyników % zgodnoœci: zgodnych: (95% CI) zgodnych: (95% CI) STR 10,0 µg/ml 77 19 4,0 µg/ml 73 * 95 17 90 (87 99) (67 99) INH 1,0 µg/ml 65 31 0,4 µg/ml 65 * 100 29 94 (95 100) (79 99) * Przyjmuje w teœcie MGIT przy wysokim stê eniu leku wynik S dla wszystkich szczepów z wynikiem S w teœcie MGIT przy niskim stê eniu leku. Wszystkie szczepy, które wykazywa³y wyniki niezgodne w MGIT zosta³y przetestowane metod¹ MOP w dwóch niezale nych oœrodkach. Cztery szczepy, które uzyska³y niezgodne wyniki dotycz¹ce opornoœci na STR (R-960, S-MOP), uzyska³y wyniki œwiadcz¹ce o wra liwoœci w obu oœrodkach. Spoœród dwóch szczepów wykazuj¹cych niezgodnoœæ wobec wra liwoœci na STR (S-960, R-MOP), jeden uzyska³ wyniki œwiadcz¹ce o wra liwoœci w obu oœrodkach, a drugi uzyska³ w obu oœrodkach wyniki œwiadcz¹ce o opornoœci. Spoœród dwóch szczepów wykazuj¹cych niezgodnoœæ wobec wra liwoœci na INH (S-960, R-MOP), jeden uzyska³ wyniki œwiadcz¹ce o wra liwoœci w obu oœrodkach, a drugi uzyska³ w obu oœrodkach wyniki œwiadcz¹ce o opornoœci. Tabela 5: Wyniki dla szczepu pochodz¹cego z próbki klinicznej BACTEC MGIT 960 AST w porównaniu do metody proporcji z hodowli na pod³o u sta³ym Metoda proporcji (MOP) System MGIT 960 AST LEK Stê enie Stê enie Wra liwoœæ Opornoœæ S R liczba wyników % zgodnoœci: liczba wyników % zgodnoœci: zgodnych: (95% CI) zgodnych: (95% CI) STR 10,0 µg/ml 78 21 4,0 µg/ml 73 * 94 17 81 (86 98) (58 95) INH 1,0 µg/ml 68 31 0,4 µg/ml 68 * 100 30 97 (95 100) (83 100) * Przyjmuje w teœcie MGIT przy wysokim stê eniu leku wynik S dla wszystkich szczepów z wynikiem S w teœcie MGIT przy niskim stê eniu leku. Wszystkie szczepy, które wykazywa³y wyniki niezgodne w MGIT, zosta³y przetestowane metod¹ MOP w dwóch niezale nych oœrodkach. Piêæ szczepów, które uzyska³y niezgodny wynik dotycz¹cy opornoœci na STR (R-960, S-MOP), uzyska³o wyniki œwiadcz¹ce o wra liwoœci w obu oœrodkach. Spoœród czterech szczepów wykazuj¹cych niezgodnoœæ wobec wra liwoœci na STR (S-960, R-MOP), trzy uzyska³y wyniki œwiadcz¹ce o wra liwoœci w obu oœrodkach, a jeden uzyska³ w obu oœrodkach wynik œwiadcz¹cy o opornoœci. Szczep, który uzyska³ niezgodny wynik dotycz¹cy wra liwoœci na INH (S-960, R-MOP), uzyska³ wyniki œwiadcz¹ce o opornoœci w obu oœrodkach. DOSTÊPNOŒÆ Nr kat. Opis Nr kat. Opis 245123 Zestaw BACTEC MGIT 960 SIRE 245157 Zestaw BACTEC MGIT 960 IR, opakowanie zawiera 4 fiolki opakowanie zawiera 2 fiolki z liofilizowanym lekiem i 8 fiolek z liofilizowanym lekiem i 4 fiolki z dodatkiem SIRE. zawieraj¹ce dodatek SIRE. 245125 Zestaw BACTEC MGIT 960 245126 Zestaw BACTEC MGIT INH 0,4 STR 4,0, opakowanie zawiera opakowanie zawiera 1 fiolkê 1 fiolkê z liofilizowanym lekiem z liofilizowanym lekiem i 2 fiolki z dodatkiem SIRE. i 2 fiolek z dodatkiem SIRE. PIŒMIENNICTWO 1. Barenfanger, J. 1993. Making your lab safe against multi-drug resistant Mycobacterium tuberculosis. Clin. Microbiol. Newsl. 15: 76-80. 2. Clinical and Laboratory Standards Institute. 2003. Approved Standard M24-A. Susceptibility testing of mycobacteria, nocardiae, and other aerobic actinomycetes. CLSI, Wayne, Pa. 3. BD Diagnostics. BACTEC 460TB System Product and Procedure Manual. 4. Clinical and Laboratory Standards Institute. 2005. Approved Guideline M29-A3. Protection of laboratory workers from occupationally acquired infections, 3rd ed. CLSI, Wayne, Pa. 5. Garner, J.S. 1996. Hospital Infection Control Practices Advisory Committee, U.S. Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention. Guideline for isolation precautions in hospitals. Infect. Control Hospital Epidemiol. 17:53-80. 11

6. U.S. Department of Health and Human Services. 1999. Biosafety in microbiological and biomedical laboratories, HHS Publication (CDC) 4 th ed. U.S. Government Printing Office, Washington, D.C. 7. Directive 2000/54/EC of the European Parliament and of the Council of 18 September 2000 on the protection of workers from risks related to exposure to biological agents at work (seventh individual directive within the meaning of Article 16(1) of Directive 89/391/EEC). Official Journal L262, 17/10/2000, p. 0021-0045. 8. Ridderhof, J. 2001. Multicenter evaluation of 3.75 µg/ml ethambutol (EMB) in BACTEC vials for susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis. Abstract C-244, American Society for Microbiology Abstracts 2001. Rysunek 1: Rozk³ad czasu w protokole urz¹dzenia BACTEC MGIT 960 AST Czêstoœæ rozk³adu czasu w protokole (TIP, Time in Protocol) / Frequency Distribution of Time in Protocol (TIP) Liczba próbek zinterpretowanych wed³ug TIP / Number Interpreted by TIP ¹czny odsetek próbek zinterpretowanych wed³ug TIP / Cumulative % Interpreted by TIP Liczba zestawów SIR AST zinterpretowanych wed³ug TIP / Number of SIR AST Sets Interpreted by TIP Liczba zestawów EMB AST zinterpretowanych wed³ug TIP / Number of EMB AST Sets Interpreted by TIP ¹czny odsetek zinterpretowanych zestawów SIR / Cumulative SIR % Interpreted ¹czny odsetek zinterpretowanych zestawów EMB / Cumulative EMB % Interpreted 12