(^Nviczenie 4 Cel cwiczenia: badanie kinetyki procesu wzrostu szczepu i biosyntezy makrolidu takrolimus w hodowli wgl^bnej szczepu S. tsukubaensis na podlozu testowym, obliczenie specyficznej szybkosci wzrostu szczepu, optymalizacja procesu biotechnologicznego poprzez okreslenie wplywu zmiany skali prowadzenia procesu. Czynnosci wykonywane przez podgrupg cwiczeniowg: - oznaczenie wydajnosci wzrostu hodowli dla 2 (lub 3) z 6 probek pobranych w czasie pracy fermentora (uwaga: doldadnie opisywac probki, identyflkuj^c czas ich pobrania z fermentora) - oznaczenie metod^rp HPLC zawartosci tacrolimusu w tych samych probkach, dla ktorych wyznaczana byla wydajnosc wzrostu szczepu - oznaczenie stezenia glukozy (zrodlo w^gla) w tych samych probkach, dla ktorych wyznaczana byla wydajnosc wzrostu szczepu Uwaga: eksperymenty prowadzimy oddzielnie dla kazdej probki pobieranej podczas pracy fermentora! Zawartosci kazdej z kolb dokladnie wymieszac (uwaga na opis kolbek!). Odmierzyc cylindrem do kolb Erlenmayera o pojemnosci loocm^ probki o obj^tosci rownej 40cm^, przeznaczone do izolacji makrolidu tacrolimus, Nast^pnie dokladnie oznaczyc obj^tosci pozostatych probek, wykorzystywanych do wyznaczenia wydajnosci przyrostu biomasy. Metodyka oznaczen: Wyznaczanie wydajnosci przyrostu biomasy Po oznaczeniu obj^tosci pozostatych probek przes^czyc je przez s^czki bibulowe na lejku Buchnera lub odwirowac. Oznaczyc masy s^czone oraz procenty suchych mas na wagosuszarce dla badanych probek. Wyliczyc wydajnosc wzrostu hodowli wyrazon^ w gramach s.m./l. Uwaga!: procedure powtorzyd dla kazdej z badanych probek. Izolacia makrolidu tacrolimus Kolbki Erlenmajera z probkami o obj^tosci rownej 40 cm"^ umiescic na 10 minut w lazni ultradzwiekowej. Nast^pnie dodac po 40 cm'^ acetonu i umiescic je na mieszadle magnetycznym na 30 minut. Zawartosci kolbek przesq^czyc pod zmniejszonym cisnieniem przez warstw^ ziemi okrzemkowej (o grubosci okolo 1 cm) umieszczonej na filtrze Shotta.
Warstw^ ziemi okrzemkowej na filtrze przemyc nast^pnie 40 cm acetonu. Pot^czone przes^cze (ekstrakt i aceton z przemywania ziemi okrzemkowej) zag^scic na wyparce do sucha. Suche pozostalosci rozpuscic w 20 cm^ metanolu, mieszaj^c zawartosci kolb na mieszadle magnetycznym. Po 10 minutach mieszania zawartosci kolby w otrzymanym roztworze oznaczyc st^zenie makrolidu takrolimus metod^hplc. Uwaga!: procedure powtorzyc dla kazdej badanej probki. Oznaczenie wykonuje si^ metod^ standardu zewn^trznego w warunkach: kolumna ODS, detekcja UV przy dlugosci fall 214 nm, przepiyw 1 cm^/min, faza ruchoma acetonitryl/woda 75/25, obj^tosc iniekcji 20 \A. Uzyskany z odczytu z krzywej kalibracyjnej wynik (st^zenie makrolidu w 20 cm^ metanolu) przeliczyc na st^zenie w brzeczce (metoda podana w opisie cwiczenia 3). Czynnosci wykonywane przez grupe cwiczeniowa: - likwidacja hodowli w fermentorze pol^czona z pobraniem ostatniej (6-tej) probki - wyznaczanie wydajnosci wzrostu szczepu, obliczenie specyficznej szybkosci wzrostu szczepu oraz wydajnosci biosyntezy makrolidu tacrolimus i oznaczenie stezenia glukozy dla badanych probek na podstawie probek pobranych w czasie prowadzonej hodowli, z wykorzystaniem wynikow uzyskanych dla probek 015. - zestawienie danych uzyskanych przez wszystkie podgrupy w jeden wspolny wykres, obrazuj^cy wzrost szczepu, zuzycie zrodla w^gla z podtoza i biosyntezy idiolitu w funkcji czasu. Wyci^niycie wnioskow dotycz^cych kinetyki wzrostu szczepu i biosyntezy tacrolimusu (elementy optymalizacji procesu biosyntezy). Przygotowanie sprawozdania z przebiegu czwartego cwiczenia (wykonuje kazda podgrupa): Wyznaczanie wydajnosci wzrostu szczepu: Numer probki 0 1 2 3 4 5 Objytosc probki [cm"*] Masa s^czona [g] % Zawartosci suchej masy Sucha masa [g] Wydajnosc hodowli [ g s.m./l]
Obliczenie specyficznej szybkosci wzrostu szczepu; Dane probek No = N5 = Specyficzna szybkosc wzrostu K= ln(n5/no/(t5-to)) to = t5 = Wyznaczanie wydajnosci biosyntezy makrolidu tacrolimus : Numer probki pobranej z fermentora 0 1 2 3 4 5 Powierzchnia piku odczytana z widma Styzenie tacrolimusu z rownania Y= [^ig/ml] Zawartosci tacrolimusu w probkach (mx=cx-20 [i^g/ml]) Styzenie tacrolimusu w brzeczce pohodowlanej [mg/l] Oznaczenie stezenia glukozy dla badanych probek: Zasada oznaczenia: Zuzycie 0,ln Na2S203 do proby kontrolnej Numer probki 0 1 2 3 4 5 Roznica w ilosci 0,ln Na2S203 zuzytego na zmiareczkowanie proby kontrolnej i badanej Styzenie glukozy odczytane z krzywej wzorcowej [%]
Wykres: Uzyskane wyniki oznaczen i obliczen wykonanych przez podgrupy cwiczeniowe (dotycz^ce wszystkich probek pobranych z fermentora) nalezy wykorzystac do sporz^dzenia wykresu obrazuj^cego kinetyky rozwoju szczepu i biosyntezy tacrolimusu. Na wykresie powinna bye zobrazowana zmiana stezenia zrodla wygla, stezenia tacrolimusu i biomasy w funkcji czasu. Wnioski: Przedstawienie wnioskow dotycz^cych kinetyki wzrostu szczepu i biosyntezy tacrolimusu. Ocena optymalizacji hodowli Streptomyces tsubaensis: Okreslenie wplywu zmiany skali prowadzenia procesu na podstawie porownania uzyskanych biomas i stezenia takrolimusu w hodowlach wstrz^sanej i wglybnej.
PROCEDIJRA DOIYCZY KAZDEJ / \ KOIB Kolba zdjc^ia /, trz(;sawki (ok. 200 (ui) Dokladnie zaniieszac 40 ml (dokladnie odmierzone) Reszta zawartosci kolby 10 minut na tazni ultradzwiekowej Dokladne oznaczenie obj^tosci brzeczki (ml) Dodac 40 ml acetonu 30 minut na mieszadle magnetycznym / S^czenie biomasy lub wirowanie S^czenie przez ziemi^ okrzemkow^ Oznaczenie masy s^czonej (g) Zagyszczenie do sucha na wyparce Oznaczenie % suchej masy Dodac 20 ml metanolu 10 minut mieszania na mieszadle magnetycznym Obliczenie suchej masy (g) Oznaczenie HPLC Obliczenie wydajnosci wzrostu (g s.m./l litr) Obliczenie stezenia tacrolimu w brzeczce
growth rate (in biotechnology) The measure (h"', d~') of the rate of growth or multiphcation of an organism or a culture, usually expressed as specific growth rate (the increase of mass or cell number per time unit referred to the unit of mass, dlnz/do- 1992, 64, 156 lupac Compendium of Chemical Terminology 2nd Edition (1997) 10000.. - 4 1" 1000 i 5 ;6 100 10 1 is <i Time Two points, N1 and N2. at the extremes of this linear phase (see fig below) are taken and substituted into the equation Growth rate; IC = Ln (N2/Nl)/(t2 - tl) Where Nl and N2 = biomass at time1 (t1) and time2 (t2) respectively; Levasseur et al (1993).
OZNACZANME ZAWARTOSCI ClIKLRC METODA SCHOORLA W melodzie Schoorla zawartosc cukrowjest okreslona w oparciu o ich wlasciavosci redukijj^ce. Cu^' zostaje zredukowana do Cu' a nadmiar soli miedziowej oznacza si? posredhio z reakcji wydzdelania z jodku potasowego wolnego jonu, ktory odmiareczkowuje si? tiosiarczanem sodowym. W probie wlasciwej zawieraj^cej cukier cz?sc miedzi zostaje zredukowana. W probie odniesienia miareczkuje si^jod wydzielony pnzez catkowitq ilosc soli miedziowej dodanej jako odczynnik Fehlinga. Z roznicy ilosci zxizytego tiosiarczanu sodowego w probie odmesienia i probie wtasciwej oblicza si? zawartosc cukrow. 2 CUSO4 + 4KJ CU2J2 + 2 KzSO^ + J2 Jz+^azSaOs 2NaJ + Na2S406 Odczynniki r-r Fehlinga 1 (69,3g CUSO4 x 5 H2O w looocm^ H2O dest.) T-r Fehlinga 11 (346g winianu sodowo-potasowego, 1 OOg NaOH w looocm^ H2O dest.) 25% r-r H2SO4 (150cm^ st?z. H2SO4 rozc 750CBI^ H2O dest) \% r-r KJ (1 OOg KJ rozp. W POOcm'' H2O dest.) 0,]n r-r Na2S203 0 fiksanala rozp. W 1 dm^h20 deast.) l%r-rsktobi WykoBaaFMC ozaaczenia Do prob6wki z 10 cm^ przes^czu (powyzej 20h fenn.) lub proby nie s^czonej (powyzej 20h) dodajemy 0,75cm^ st?z.hcl w celu przeprowadzenia cukrow z^ozonych w proste. Przykrywamy lejkiem i wstawiamy do wrz^cej laini wodnej na ok. l-l,5h. Icm^ hydrolizatu odmierzamy do kolby stozkowej i dodajemy po 1 Ocm^ r-ru Fehlinga 1 i Fehlinga U i 29cm^ H2O. Ogrzewamy do wrzenia (na siatce azbestowej) i utrzymujemy w tym stanie przez 2 min. Po ozi^bieniu dodajemy 10 cm^ 25% H2SO4 i 30cm^ 10% roztw. KJ. Wydzielony jod odmiareczkowujemy 0,ln roztw. Ma2S203 w obecnosci skrobi, ktor^ nalezy dodac pod koniec miareczkowania. Prob? kontroln^ stanowi analogicznie wykonana proba nie zawieraj^ca (oprocz odczynnikow) proby badanej tylko 1 cm' H?0 Maj^c roznic? ilosci cm^ NasS^Oa jak^ zozyto przy probie kontrolnej i probie badanej, w wykresu odczytujemy zawartosc procentow^ glukozy