Strategia diagnostyki cytogenetycznej Prawidłowe chromosomy człowieka. Typy aberracji chromosomowych i ich kliniczne skutki. Aberracje liczby i struktury chromosomów. Techniki cytogenetyczne wprowadzenie do metodyki, przegląd technik i strategii cytogenetycznej. Katedra i Zakład Genetyki Medycznej dr Anna Skorczyk-Werner Cytogenetyka dział genetyki zajmujący się badaniem chromosomów Cytogenetyka kliniczna - zajmuje się badaniem chromosomów w komórkach organizmu ludzkiego, ich nieprawidłowości i związku z obrazem klinicznym Historia cytogenetyki 1875 Eduard Strasburger - najwcześniejsze obserwacje chromosomów w materiale roślinnym 1879 1889 Walther Flemming - najwcześniejsze obserwacje chromosomów w materiale zwierzęcym - pojęcia mitoza, chromatyna, profaza, metafaza, anafaza, telofaza 1888 - Heinrich Wilhelm Waldeyer - wprowadzenie pojęcia chromosom: chromos (gr.) kolor soma (gr.) - ciało 1914 Theodor Boveri - teoria o wpływie zmian chromosomowych na powstawanie nowotworów 1923 Theophilus Painter - twierdzenie, iż liczba chromosomów człowieka wynosi 48 (liczba uznawana za prawdziwą przez 3 dekady!) 1937 zastosowanie kolchicyny w celu zatrzymania podziałów komórkowych w stadium metafazy 1952 zastosowanie roztworu hipotonicznego w celu rozproszenia chromosomów w jądrze komórkowym 1953 Watson i Crick opisanie struktury DNA
1956 - Joe Hin Tjio - początek rozwoju cytogenetyki medycznej - Prawidłowa liczba chromosomów człowieka wynosi 46 1959 - Jerome Lejeune - Odkrycie dodatkowego chromosomu pary 21 w zespole Downa 1959 Charles Edmund Ford - Opisanie zespołu Turnera 45,X 1959 Jacobs i Strong - Opisanie zespołu Klinefeltera XXY 1960 Klaus Patau - Opisanie zespołu Patau 1960 J Edwards - Opisanie zespołu Edwardsa 1960 - Book i Santeson opisanie triploidii u człowieka - Nowell i Hungerford opisanie chromosomu Philadelphia - J. Lejeune opisanie zespołu Cri-du-Chat 1969 Herbert Lubs opisanie łamliwego chromosomu X 1969 Gall i Pardue opisanie hybrydyzacji in situ z sondami znakowanymi radioaktywnie 1969-1970 zastosowanie amniocentezy w prenatalnej diagnostyce cytogenetycznej 1970 Caspersson - opisanie techniki prążkowania Q 1971 Dutrillaux i Leujene opisanie techniki prążkowania R 1975 Goodpasture i Bloom opisanie techniki srebrzenia chromosomów NOR 1979 Yunis opisanie techniki uzyskiwania chromosomów o wysokiej rozdzielczości HRBT 1981 Langer - opisanie hybrydyzacji in situ z sondami znakowanymi biotyną 1982-83 Kazy, Ward, Brambati i in. zastosowanie biopsji kosmówki w prenatalnej diagnostyce cytogenetycznej Cytogenetyka: cytogenetyka klasyczna: o badanie kariotypu za pomocą technik prążkowania chromosomów cytogenetyka molekularna: o technika FISH o inne techniki z wykorzystaniem sond molekularnych Budowa morfologiczna chromosomu w stadium metafazy:
Typy chromosomów człowieka (na podstawie położenia centromeru): - Metacentryczne - Submetacentryczne - Akrocentryczne U człowieka nie występują chromosomy telocentryczne! Grupy chromosomów - pary A 1-3 duże chromosomy metacentryczne B 4-5 duże chromosomy submetacentryczne C 6-12 i X średnie chromosomy submetacentryczne D 13-15 duże chromosomy akrocentryczne E 16-18 małe chromosomy submetacentryczne F 19-20 małe chromosomy metacentryczne G 21-22 i Y małe chromosomy akrocentryczne Aberracje chromosomów: - aberracje liczby chromosomów - aberracje struktury chromosomów Aberracje mogą dotyczyć zarówno chromosomów płci, jak i autosomów Aberracje liczby chromosomów - ogólna liczba chromosomów jest różna od prawidłowej liczby 46 chromosomów. - zmiany liczbowe mogą dotyczyć zarówno całego zestawu chromosomów (poliploidie), jak i pojedynczego chromosomu (aneuploidie). Poliploidia - Triploidia (69,XXX,XXY lub XYY) -3% wszystkich poczęć, w większości przypadków poronienia samoistne Aneuploidia (autosomy) - Nullisomia (utrata pary chromosomów homologicznych) - letalne przed implantacją - Monosomia (utrata jednego chromosomu) - letalne w stadium embrionalnym - Trisomia (jeden chromosom dodatkowy) - zwykle letalne, z wyjątkiem trisomii chromosomów 13, 18, 21 Aneuploidia (chromosomy płci) - Dodatkowy chromosom płci - normalna długość życia - Utrata chromosomu płci (45,X) - 99% przypadków-poronienia samoistne, normalna inteligencja, bezpłodność Poliploidie Triploidia - obecność dodatkowego haploidalnego zestawu chromosomów w wyniku czego w jądrze komórkowym zamiast 46 mamy 69 chromosomów.
Triploidia powstaje w wyniku: - Zapłodnienia komórki jajowej przez dwa plemniki, czyli tak zwanej dispermii. - Połączenia się nieprawidłowej diploidalnej gamety żeńskiej z prawidłowym plemnikiem, czyli tak zwanej dygynii. - Połączenia się nieprawidłowego diploidalnego plemnika z prawidłową gametą żeńską, czyli tzw. diandrii (najrzadsze). Triploidia obraz kliniczny - Jeśli dodatkowy zestaw chromosomów pochodzi od matki charakterystyczne cechy fenotypowe płodu to: wewnątrzmaciczne ograniczenie wzrostu, bardzo małe łożysko (niski poziom βhcg) i hipoplazja nadnerczy. - Jeśli dodatkowy zestaw chromosomów pochodzi od ojca mamy do czynienia z bardzo dużym łożyskiem i zaśniadem groniastym, przy często normalnych rozmiarach płodu. - Cechy fenotypowe to także: syndaktylia 3. i 4. palca, wady układu płciowego i moczowego, wady rozwojowe mózgu, wady serca. - Triploidia jest aberracją letalną, czyli prowadzi do obumarcia płodu (najczęściej) lub śmierci noworodka. Tetraploidia - obecność dwóch dodatkowych haploidalnych zestawów chromosomów w wyniku czego w jądrze komórkowym zamiast 46 mamy 92 chromosomów. Tetraploidia powstaje w wyniku: - Nieprawidłowego pierwszego podziału zygoty. - Tetraploidia jest aberracja letalną, prowadzącą do obumarcia zarodka/płodu. Aneuploidie Trisomia - występowanie dodatkowego chromosomu homologicznego danej pary. - Trisomia jest wynikiem zjawiska nondysjunkcji, czyli nierozdzielenia się chromosomów homologicznych lub chromatyd w trakcie podziału mejotycznego lub mitotycznego. - Wynikiem nondysjunkcji jest powstanie z jednej strony gamet disomicznych (z dwoma chromosomami) lub z drugiej strony nullisomicznych (bez chromosomu). - Połączenie gamety disomicznej z prawidłową prowadzi do powstania trisomii określonej pary chromosomów. - Połączenie gamety nullisomicznej z gametą prawidłową prowadzi do powstania monosomii określonej pary chromosomów. Monosomia - brak jednego chromosomu homologicznego w danej parze. - Monosomia powstaje w wyniku nondysjunkcji. - Efektem nondysjunkcji jest powstanie gamety nullisomicznej pozbawionej chromosomu danej pary. - Po połączeniu nullisomicznej gamety z gametą prawidłową powstaje monosomia określonej pary chromosomów. - W przypadku zespołu Turnera (45,X) monosomia może być wynikiem opóźnionego ruchu chromosomu Y w stadium anafazy.
Aneuploidie skutki: - Większość trisomii i monosomii jest letalna prowadzi do obumarcia zarodka/płodu we wczesnym okresie ciąży, najczęściej w pierwszym trymestrze ciąży. Wyjątek stanowią trisomie chromosomów pary: 13, 18 i 21 oraz monosomia chromosomu X, które spotyka się u żywo urodzonych noworodków. - Także aberracje liczbowe chromosomów płci, takie jak: 47,XXY; 47,XXX; 47,XYY związane są z łagodniejszymi skutkami klinicznymi. - Monosomie są letalne w bardzo wczesnym stadium rozwojowym (embrionu), prowadząc do bardzo wczesnej utraty ciąży, która nie jest klinicznie rozpoznawalna w tym czasie (najczęściej kobieta jeszcze nie wie, że jest w ciąży). - Do nondysjunkcji najczęściej dochodzi w gamecie matczynej, podczas oogenezy (90% przypadków), rzadko nondysjunkcja występuje w trakcie spermatogenezy. - Zjawisko nondysjunkcji jest związane z wiekiem matki (efekt wieku). - U kobiet między 20-29 rokiem życia ryzyko jest stałe, natomiast po ukończeniu 30 roku życia ryzyko nondysjunkcji sukcesywnie rośnie wraz z wiekiem matki. - Ryzyko związane z wiekiem jest takie same dla kobiet, które wcześniej urodziły dziecko, jak i dla kobiet, dla których jest to pierwsza ciąża. Aberracje liczbowe: - powstają najczęściej de novo, a nie w wyniku odziedziczenia od rodziców. - Aberracje liczbowe, poza kilkoma wyjątkami prowadzą do obumarcia zarodka/płodu, martwego porodu lub zgonu okołoporodowego - Aberracje liczbowe chromosomów stanowią około 50% przyczyn poronień samoistnych w pierwszym trymestrze ciąży. Mozaikowość - występowanie w jednym organizmie dwóch lub więcej linii komórkowych o różnym kariotypie, pochodzących z tej samej zygoty. Pochodzenie mozaikowości: - Aberracja chromosomowa powstała po zapłodnieniu, podczas pierwszych podziałów zygoty, w wyniku nieprawidłowego podziału mitotycznego. - Aberracja jest wynikiem ratowania embrionu z aberracją chromosomową, kiedy z tylko z części komórek nadmierny materiał zostaje usunięty. Aberracje struktury chromosomów Zrównoważone Translokacje zrównoważone Inwersje Niezrównoważone Duplikacje Delecje Chromosomy pierścieniowe Izochromosomy Fragmenty centryczne
Aberracje zrównoważone Translokacje Przemieszczenie się materiału genetycznego pomiędzy chromosomami Typy translokacji: - Wzajemne - Robertsonowskie - Insercyjne Translokacja wazjemna zrownoważona - Fragmenty chromosomów oderwały się i zamieniły się miejscami. - Nie doszło do utraty materiału genetycznego Translokacja robertsonowska (fuzja centryczna) - Dotyczy chromosomów akrocentrycznych - Dwa chromosomy akrocentryczne tracą ramiona krótkie i łączą się ze sobą powstaje jeden chromosom dwuramienny Translokacja robertsonowska jest translokacją zrównoważoną, ponieważ utrata ramion krótkich chromosomów akrocentrycznych nie powoduje utraty genów Inwersja - Chromosom ulega złamaniu w 2 miejscach, a fragment pomiędzy złamaniami ulega odwróceniu o 180 stopni - Inwersja jest aberracją zrównoważoną Inwersja paracentryczna oba złamania są w obrębie jednego ramienia i odwrócony fragment nie zawiera centromeru Inwersja pericentryczna złamania nastąpiły w obydwu ramionach chromosomu i odwrócony fragment zawiera centromer Aberracje niezrównoważone: Delecja - utrata części chromosomu Duplikacja - podwojenie części chromosomu Delecje i duplikacje są aberracjami niezrównoważonymi łączą się z utratą lub nadmiarem materiału genetycznego Chromosom pierścieniowy - Chromosom pęka w obu ramionach, dystalne części chromosomów ulegają utracie, a pozostała część chromosomu tworzy pierścień - Aberracja chromosomowa niezrównoważona Izochromosom - Nieprawidłowy chromosom, który ma delecję jednego, a duplikację drugiego ramienia - Może powstać wskutek poprzecznego podziału centromeru - Aberracja niezrównoważona
Chromosomy markerowe - Małe dodatkowe chromosomy niejasnego pochodzenia, stwierdzane w 1/2500 ciąż - W 90% przypadków pochodzą z krótkich ramion chromosomów akrocentrycznych (około połowa pochodzi z chromosomu 15) - Chromosomy markerowe wymagają identyfikacji metodami cytogenetyki molekularnej (FISH malowanie chromosomów) Kliniczne skutki aberracji chromosomowych: Niezrównoważonych: U zarodka - obumarcie U dzieci żywo urodzonych: - Zespoły wad wrodzonych z upośledzeniem umysłowym - Upośledzenie umysłowe z cechami dysmorfii - Zaburzenia cielesno-płciowe Zrównoważonych nosiciel aberracji jest zdrowy, ale może mieć niepowodzenia rozrodu (brak ciąży, poronienia samoistne, porody martwe, dzieci z zespołem wad i upośledzeniem umysłowym) Fenotyp osoby z niezrównoważoną aberracją chromosomową w zakresie autosomów - Często dystrofia wewnątrzmaciczna - Często nieprawidłowy przebieg ciąży (krwawienie z dróg rodnych, nieprawidłowa ilość płynu owodniowego, wady płodu w badaniu USG) - Wady wrodzone, w tym wady narządów wewnętrznych, często wada serca - Dysmorfia twarzy, dysplastyczne małżowiny uszne - Upośledzenie umysłowe zawsze, nawet przy słabo wyrażonych pozostałych w/w objawach Zespoły mikrodelecji - Delecje chromosomów są bardzo małe, na granicy rozdzielczości metod klasycznej cytogenetyki, a nawet submikroskopowe - Diagnostyka: analiza chromosomów prometafazowych (HRBT) i FISH - Fenotyp: dysmorfia, wady rozwojowe i upośledzenie umysłowe Przykłady zespołów mikrodelecji: Z. Pradera-Williego 15q11-12 Z. Angelmana 15q11-12 Z. Wolf-Hirschhorna 4p16.3 Z. Miller-Dieker 17q13 Wskazania do określenia kariotypu: - Zespół wad wrodzonych współistniejący z opóźnieniem rozwoju/upośledzeniem umysłowym - Upośledzenie umysłowe - Podejrzenie zespolu mikrodelecji - Zaburzenia różnicowania płci - Niepowodzenia rozrodu (brak ciąży, poronienia samoistne, obumarcie ciąży, zgon dziecka w okresie perinatalnym)
Badanie kariotypu: - można użyć każdej rosnącej tkanki, najczęściej wykorzystuje się limfocyty krwi obwodowej, czasem także na komórki szpiku kostnego lub fibroblasty skóry - w diagnostyce prenatalnej - komórki płynu owodniowego lub kosmówki Badanie kariotypu z limfocytów krwi obwodowej: - pobrać jałowo do probówki z heparyną ok. 2-5 ml krwi żylnej (od noworodka 1 ml) i dostarczyć do laboratorium cytogenetycznego - jeśli transport krwi jest następnego dnia, probówkę z krwią przechowywać w lodówce (+4ºC). Można też probówkę z krwią przesyłać szybką pocztą - nie wolno mrozić probówki z krwią przeznaczoną do badania kariotypu Uwaga: u noworodka z wadami wrodzonymi, który zmarł zanim zdążono pobrać krew na badanie kariotypu, można jeszcze jak najwcześniej (ew. nawet do 1 godz. po zgonie) pobrać krew bezpośrednio z serca Hodowla limfocytów krwi obwodowej przygotowanie pożywki do hodowli i dodanie do niej krwi hodowla w cieplarce przez 72 h zatrzymanie podziałów komórkowych kolcemid rozproszenie chromosomów - roztwór hipotoniczny utrwalanie zawiesiny metanol+kwas octowy nałożenie na szkiełka mikroskopowe Podstawową metodą badania cytogenetycznego jest standardowa ocena kariotypu (najczęściej metoda prążkowa GTG). Jednak w przypadku bardziej złożonych problemów diagnostycznych lub małych zmian w obrębie struktury chromosomów niezbędna jest analiza z zastosowaniem innych technik np. cytogenetyki molekularnej. Techniki prążkowe: - prążki G (barwienie GTG) - prążki Q (barwienie OFQ) - prążki C (barwienie CTG) - barwienie AgNOR (barwienie srebrowe) - prążki R (barwienie RBA) (prążkowania odwrotnego, ang. reverse) Kiedy wykonuje się standardową analizę kariotypu? Aberracje liczby: poliploidie, aneuploidie (trisomia, monosomia) Aberracje struktury: delecje, insercje, translokacje, chromosomy pierścieniowe, izochromosomy Postępowanie w przypadku trudności w wykazaniu aberracji chromosomowej przy zastosowaniu standardowego badania kariotypu Analiza większej liczby płytek metafazowych (poszukiwanie mozaikowości) Analiza chromosomów prometafazowych (HRBT high resolution banding technique) Badanie kariotypu na podstawie fibroblastów skóry Metody cytogenetyki molekularnej (FISH)
Wskazania do badania kariotypu na podstawie fibroblastów skóry: Kariotyp mozaikowy w badaniu limfocytów Brak aberracji chromosomowej w badaniu standardowym (limfocyty) przy fenotypie wskazującym na aberrację Fenotyp zespołu Pallister-Killian Zasady zapisu kariotypu: 1) Liczba określająca całkowitą ilość chromosomów w komórce 2 )Po przecinku wymienione chromosomy płciowe 3) Po przecinku ewentualny opis aberracji np. 46,XY 47,XX,+21 45,X 47,XXY 46,XX,t(2;6)(p12;q21) FISH fluorescencyjna hybrydyzacja in situ Sondy stosowane w FISH: malujące (wcp. ang. whole chromosome paint)- pokrywające cały chromosom lub poszczególne ramiona alfa-satelitarne (centromerowe, telomerowe) specyficzne (unikalne) dla poszczególnych sekwencji lub określonego locus Materiał do badania FISH: fibroblasty limfocyty komórki szpiku kostnego komórki płynu owodniowego komórki trofoblastu komórki nabłonka jamy ustnej skrawki parafinowe niektórych tkanek Genetyka kliniczna FISH diagnostyka submikroskopowych aberracji chromosomowych identyfikacja złożonych aberracji struktury chromosomów identyfikacja dodatkowego materiału chromosomowego identyfikacja chromosomów markerowych szybka diagnostyka aneuploidii chromosomowych FISH w diagnostyce nowotworów detekcja amplifikacji genu badanie materiału genetycznego w jądrach interfazowych identyfikacja komórek szpiku kostnego dawcy po przeszczepie detekcja wczesnego nawrotu choroby monitorowanie efektu terapii
Cytogenetyka molekularna inne techniki M-FISH (ang. multicolour FISH) SKY (SKY-FISH) (ang. spectral karyotyping) CGH (ang. comparative genomic hybridization) - porównawcza hybrydyzacja genomowa