Małe RNA.

Małe RNA Monika Zakrzewska-Płaczek monika.z@ibb.waw.pl

Małe RNA (small RNAs, srnas) srna 21-30 nt wyciszanie ekspresji genów: (gene silencing, RNA silencing) post-transkrypcyjne wyciszanie genów (post-transcriptional gene silencing, PTGS) degradacja mrna, inhibicja translacji AAAAA transkrypcyjne wyciszanie genów (transcriptional gene silencing, TGS) epigenetyczne modyfikacje chromatyny RNA Pol modyfikacja histonów, metylacja DNA 2

PTGS: post-transkrypcyjne wyciszanie genów Klasy małych RNA: mirna (microrna) rośliny, zwierzęta, wirusy, Protista 20 25nt Drosha (u zwierząt) + Dicer Transkrypcja przez Pol II/Pol III Regulacja stabilności mrna (cięcie mrna), inhibicja translacji mirtrony pochodzące z intronów prekursorów mrna genów kodujących białka; występują u zwierząt; niezależne od Drosha sirna (small interferring RNA) większość działa in cis, za wyjątkiem tasirna exo-sirna (pochodzenia egzogennego) rośliny, grzyby, zwierzęta, Protista 21-24nt Dicer Transgeniczny, wirusowy lub inny egzogenny RNA Post-transkrypcyjna regulacja ekspresji genów, obrona przeciwwirusowa endo-sirna (pochodzenia endogennego) rośliny, grzyby, zwierzęta, Protista ~21nt Dicer Transkrypcja dwukierunkowa lub zbieżna, wiązanie mrna z transkryptami pseudogenów o przeciwnej orientacji Post-transkrypcyjna i transkrypcyjna regulacja ekspresji genów, regulacja aktywności transpozonów tasirna (trans-acting sirna) rośliny 21nt DCL4 TAS RNA cięte przez mirna Regulacja posttranskrypcyjna natsirna (natural antisense transcripts-derived sirna) rośliny 24nt 21nt DCL2 DCL1 Transkrypcja dwukierunkowa indukowana stresem Regulacja genów odpowiedzi na stres 3

TGS: transkrypcyjne wyciszanie genów Klasy małych RNA: sirna (small interferring RNA) endo-sirna (pochodzenia endogennego) rośliny, grzyby, zwierzęta, Protista ~21nt Dicer Transkrypcja dwukierunkowa lub zbieżna, wiązanie mrna z transkryptami pseudogenów o przeciwnej orientacji Post-transkrypcyjna i transkrypcyjna regulacja ekspresji genów, regulacja aktywności transpozonów hc-sirna (heterochromatic sirna) rośliny, S. pombe 24-26nt DCL3 Transpozony, powtórzenia Modyfikacja chromatyny pirna (Piwi-interacting RNA) Drosophila, C. elegans, ssaki, Danio rerio 24 30nt niezależne od Dicer Długie pierwotne transkrypty (?) Regulacja aktywności transpozonów, inne nieznane funkcje 4

Białka Dicer i Argonaute (AGO): główne elementy szlaku wyciszania RNA Dwuniciowy RNA (double-stranded RNA, dsrna) jest cięty przez Dicer na krótkie dwuniciowe cząsteczki steczki RNA, które sąs wiązane przez jedno z białek rodziny ARGONAUTE. DICER AGO wyciszenie 5

Wyciszanie ekspresji genów sirna-posttranskrypcyjne lub transkrypcyjne wyciszanie ekspresji genów AGO AAAn DCL AGO AGO RNA Pol mirna - inhibicja translacji, cięcie mrna AGO AAAn DCL MIR gene RNA Pol AGO AAAn AGO AAAn mrna AAAn RNA Pol 6

Dicer i Dicer-like Podczas biogenezy sirna i mirna, białka Dicer lub Dicer-like (DCL) tną długie dsrna lub RNA o strukturze spinki (hairpin) na fragmenty ~ 21 25nt. RIII PAZ RIII Struktura białka Dicer umożliwia równomierne r rozcinanie RNA na fragmenty o takiej samej długod ugości. MacRae,, I.J., Zhou, K., Li, F., Repic,, A., Brooks, A.N., Cande,, W.., Adams, P.D., and Doudna,, J.A. (2006) Science 7

Dicer i Dicer-like RIII PAZ konserwowana owana domena wiążą ążąca dsrna (dsrbd- dsrna-binding domain) oddziałuje z końcem 3 3 dsrna PAZ RIII 2 domeny typu RNazy III aktywność endonukleolityczna 5 P P / 3 OH3 MacRae,, I.J., Zhou, K., Li, F., Repic,, A., Brooks, A.N., Cande,, W.., Adams, P.D., and Doudna,, J.A. (2006) Science 8

Argonaute Białka ARGONAUTE wiążą srna i mrna PAZ A. thaliana ago1 Argonauta argo N-term PIWI MID Nazwa ARGONAUTE pochodzi od mutanta argonaute1 A. thaliana; który swoim kształtem przypomina ośmiornicężeglarka (Argonauta). Bohmert,, K., Camus,, I., Bellini,, C., Bouchez,, D., Caboche,, M., and Benning,, C. (1998) EMBO J. Song, J.-J., J., Smith, S.K., Hannon, G.J., and Joshua-Tor Tor,, L. (2004) Science 9

Argonaute Białka ARGONAUTE wiążą srna i mrna N-term PAZ PIWI MID PAZ oddziałuje z końcem 3 3 srna MID (middle) MID oddziałuje z nukleotydem na końcu 5 5 srna PIWI struktura podobna do RNazyH w niektórych białkach Ago: cięcie cie RNA zwiazanego z srna (slicer activity) 10

Dicer i Argonaute u różnych r nych organizmów Species Argonaute-PIWI PIWI-like Argonaute PIWI Dicer-like RdRP Plantae Arabidopsis thaliana Oryza sativa 10 (AGO1-10) 18 - - 4 (DCL 1-4) 5 6 5 Saccharomyces cerevisiae - - - - Fungi Schizosaccharomyces pombe Neurospora crassa 1 1 - - 1 1 1 3 Aspergillus nidulans 1-1 2 Caenorhabditis elegans 5 3 2 (Dicer + Drosha) 4 Metazoa Drosophila melanogaster Danio rerio 2 4 3 4 3 (2 Dicers + Drosha) 2 (Dicer + Drosha) - - Homo sapiens 4 4 2 (Dicer + Drosha) - 11

U roślin w biogenezie mirna i sirna uczestniczą różne białka DCL AtDCL1 mirna DCL1 AtDCL2-4 sirna DCL4 Rośliny mają 4 (i więcej) białek DCL: większa niż u innych organizmów w liczba białek DCL umożliwia roślinom bardziej precyzyjną i skuteczną obronę przed patogenami. Margis,, R., Fusaro,, A.F., Smith, N.A., Curtin, S.J., Watson, J.M., Finnegan, E.J., and Waterhouse, P.M. (2006) FEBS Lett. 12

U roślin w biogenezie mirna i sirna uczestniczą różne białka DCL AtDCL1 mirna DCL1 Arabidopsis thaliana: DCL1 21nt mirna AGO1/7/10 DCL2 22nt sirna DCL3 24nt sirna AGO4/6 DCL4 21nt sirna (tasirna) AGO1 AtDCL2-4 sirna DCL4 13 Bologna N.G., Voinnet O. (2014 14) Annu. Rev.. Plant Biol.

sirna strażnicy genomu ochrona genomu przed obcym materiałem em genetycznym (exo( exo-sirna): transgenicznym wirusowym (VIGS viral induced gene silencing) endo-sirna sirna: wyciszanie transpozonów i sekwencji powtórzonych utrzymywanie niektórych genów w stanie epigenetycznie nieaktywnym 14 Lam, E., Kato, N., and Lawton, M. (2001). Nature

Exo-siRNA: wyciszanie transgenów Transgeny wprowadzane sztucznie sąs często wyciszane przez sirna Wyciszenie może e być wywołane: bardzo wysokim poziomem ekspresji transgenu dwuniciowym RNA pochodzącym cym z ekspresji transgenu nieprawidłowymi RNA pochodzącymi cymi z ekspresji transgenu Transgeny są wyciszane post-trans transkrypcyjnie i transkrypcyjnie sirna-posttranskrypcyjne lub transkrypcyjne wyciszanie ekspresji genów AGO AAAn DCL RISC (RNA-induced silencing complex) AGO AGO RNA Pol 15

Post-transkrypcyjne transkrypcyjne wyciszanie genów w u roślin transgene-induced post-transcriptional transcriptional silencing Eksperymenty modyfikacji koloru kwiatów petunii (Petunia hybrida) - odkrycie mechanizmu wyciszania genów jądro komórkowe komórka roślinna DNA Agrobacterium tumefaciens na powierzchni komórki roślinnej Martha Hawes, University of Arizona 16

Manipulacja ekspresją genu syntazy chalkonowej: zmiana pigmentacji kwiatów w petunii CHS Dzikie kwiaty petunii zawierają antocyjaniny nadające purpurową barwę syntaza chalkonowa (CHS) enzym szlaku biosyntezy antocyjanin antocyjaniny 17 Aksamit-Stachurska et al. BMC Biotechnology 2008 Foto: Richard Jorgensen

Oczekiwanie synteza RNA o prawidłowej orientacji pogłę łębi barwę kwiatów... gen PRO ORF mrna translacja mrna transgen konstrukt o orientacji sens mrna dodatkowa translacja mrna mrna 18

a a synteza RNA o odwróconej orientacji zablokuje syntezę barwnika gen PRO ORF mrna translacja mrna transgen konstrukt o orientacji sens mrna dodatkowa translacja mrna mrna transgen konstrukt o orientacji antysens RNA antysensowny tworzenie dupleksów w RNA sens-antysens inhibicja translacji 19

Nieoczekiwanie, wprowadzenie zarówno konstruktów sens jak i antysens prowadzi do inhibicji syntezy barwnika rośliny zawierające transgen CHS CaMV 35S pro : CHS lub CaMV 35S pro : sens antysens CHS 20 Foto: Richard Jorgensen

W modyfikowanych roślinach nie dochodzi do syntezy ani endogennej ani transgenicznej CHS purpurowe kwiaty białe kwiaty Zjawisko wyciszania zarówno sztucznie wprowadzonego genu, jak i jego endogennego odpowiednika nazywamy kosupresją transgeniczny RNA endogenny RNA RNase protection 21 Napoli,, C., Lemieux,, C., and Jorgensen, R. R (1990) Plant Cell

Kosupresja jest wynikiem produkcji sirna typ dziki PRO gen ORF mrna translacja mrna roślina transgeniczna kosupresja mrna AGO AGO AAAA konstrukt sens PRO gen ORF mrna produkcja sirna AGO AAAA De Paoli, E., Dorantes-Acosta, A., Zhai, J., Accerbi,, M., Jeong,, D.-H., Park, S., Meyers, B.C., Jorgensen, R.A., and Green, P.J. (2009). 09). RNA 22

VIGS - viral induced gene silencing wirusowa polimeraza RNA zależna od RNA wirusowy ssrna wirusowy dsrna DCL4 Większość roślinnych wirusów to wirusy RNA, których replikacja odbywa się poprzez dsrna dsrna jest cięty przez DCL4 powstają sirna które wiążą się z AGO1 wyciszenie replikacji wirusa AGO1 AGO1 23

VIGS - viral induced gene silencing Obrona przeciwwirusowa u roślin: głównie na poziomie wyciszania RNA TRV: 21-nt (DCL4), 24-nt sirna (DCL3) TCV (Turnip Crinkle Virus): 22-nt sirna (DCL2) degradacja wirusowego RNA: 21-nt i 24-nt sirna WT Arabidopsis inokulowany TRV Podwójny mutant dcl2-dcl4 dcl4 inokulowany TRV Waterhouse, P.M. and Fusaro,, A.F. (2006) Science. Wyciszanie wirusa TRV Tobacco Rattle Virus (wirus nekrotycznej kędzierzawki tytoniu) w roślinach A. thaliana dzikiego typu zapobiega objawom choroby. Mutanty dcl są niezdolne do zahamowania infekcji. Mutanty biogenezy sirna są mniej odporne na choroby wirusowe Deleris,, A., Gallego-Bartolome Bartolome,, J., Bao,, J., Kasschau,, K., Carrington, J.C., and Voinnet,, O. (2006) Science 24

Infekcja wirusowa powoduje akumulację sirna Małe e RNA komplementarne do wirusowego RNA są obecne zarówno w liściach inokulowanych, jak i w młodszych m dystalnych liściach (ale nie w liściach kontrolnych) liść inokulowany liść dystalny dni po inokulacji liść inokulowany Northern blot Hamilton, A.J., and Baulcombe,, D.C. (1999) Science 25

Infekcja wirusowa powoduje akumulację sirna AGO DCL liść inokulowany 26

Sygnał wyciszający cy może e rozprzestrzeniać się w całej roślinie poprzez floem wyciszenie inokulowany liść Voinnet,, O., and Baulcombe,, D. (1997) Nature egzogenne sirna 21 i 24nt (PTGS) wyciszanie transgenu GFP endogenne 24nt sirna (TGS poprzez remodelowanie chromatyny, pochodzą z transpozonów i innych zmetylowanych rejonów genomu) mirna (PTGS) Sarkies P., Miska E.A. (2014) Nat. Rev.. MCB 27

Mutanty biogenezy sirna są mniej odporne na choroby wirusowe i patogeny bakteryjne Wyciszanie wirusa TRV Tobacco Rattle Virus (wirus nekrotycznej kędzierzawki tytoniu) w roślinach A. thaliana dzikiego typu zapobiega objawom choroby. Mutanty dcl są niezdolne do zahamowania infekcji. WT Arabidopsis inokulowany TRV Podwójny mutant dcl2-dcl4 dcl4 inokulowany TRV Deleris,, A., Gallego-Bartolome Bartolome,, J., Bao,, J., Kasschau,, K., Carrington, J.C., and Voinnet,, O. (2006) Science Navarro, L., Jay, F., Nomura, K., He, S.Y., and Voinnet,, O. (2008) Science A. thaliana dzikiego typu (La-er) i mutanty biogenezy srna (dcl1-9 i hen1-1) inokulowane bakteriami Pseudomonas. 28

VIGS - podsumowanie Wyciszanie ekspresji genów za pośrednictwem sirna jest ważnym mechanizmem obrony roślin przed patogenami wirusami i bakteriami sirna hamują replikację wirusową u roślin (również u zwierząt - Drosophila melanogaster) sirna działają ogólnoustrojowo u roślin mogą się przemieszczać poprzez wiązki przewodzące Większość wirusów wytwarza białka supresorowe,, hamujące szlak wyciszania 29

Exo-siRNA u zwierząt: dsrna najsilniejszy inicjator wyciszania modyfikacje genetyczne nicienia C. elegans: Wprowadzanie do organizmów nicieni Caenorhabditis elegans RNA o prawidłowej lub odwróconej orientacji, oraz dwuniciowych RNA, odpowiadających sekwencji genu unc-22, kodującego miofilamentowe białko komórek mięśniowych. Wyciszenie unc-22 powoduje fenotyp kurczenia ciała (twitching) RNA sens bez zmian fenotypowych RNA antysens bez zmian fenotypowych dsrna fenotyp twitching 30 Fire, A. et al., (1998) Nature

Exo-siRNA u zwierząt: U ssaków w i C. elegans tylko jedno białko Dicer,, odpowiada za biogenezę zarówno sirna,, jak i mirna Drosophila melanogaster: Dcr1 mirna Dcr2 sirna, wiązane przez AGO2 obrona przeciwwirusowa egzogenny dsrna wirusowy dsrna cięcie cie mrna obrona przeciwwirusowa 31 Okamura K. & Lai E.C. (2008) Mol Cell Biol

Efekt wyciszenia jest wzmacniany przez amplifikację sirna RdRP polimeraza RNA zależna od RNA (RNA-dependent RNA Polymerase) DCL RdRP 1-rzędowy sirna Wyciszenie może się rozprzestrzeniać poza miejsce infekcji wirusowej dzięki aktywności RdRP (RNA-dependent RNA polymerase) i biogenezie 2-rzędowych sirna. DCL 2-rzędowy sirna 32

Efekt wyciszenia jest wzmacniany przez amplifikację sirna 1 sirna 1 sirna primary Argonaute 2 sirna 2 sirna 33 Ghildiyal & Zamore (2009) Nat Rev Genet

Endo-siRNA sirna: 34 Ghildiyal & Zamore (2009) Nat Rev Genet

Większość endogennych sirna powstaje z transpozonów i powtórzeń sekwencji DNA Chromosom Centromer małe RNA transpozony retrotranspozony Wysoko-przepustowe sekwencjonowanie małych RNA Większość sirna w komórce pochodzi z sekwencji transpozonowych i powtórzonych. U Arabidopsis thaliana duże zagęszczenie tego typu sekwencji występuje w rejonach centromerowych chromosomów. Kasschau,, K.D., Fahlgren,, N., Chapman, E.J., Sullivan, C.M., Cumbie,, J.S., Givan,, S.A., and Carrington, J.C. (2007) PLoS Biol 35

Endo-siRNA u roślin: cis-acting sirna (casirna, hc-sirna sirna) trans-acting acting sirna (tasirna) natural antisense sirna (natsirna) 36 Ghildiyal & Zamore (2009) Nat Rev Genet

tasirna: : roślinne endogenne sirna gen TAS tasirna trans-acting acting sirna specyficzne dla roślin kodowane przez geny TAS obróbka bka pierwotnego transkryptu jest inicjowana przez mirna transkrypcja locus TAS przez polimerazę RNA II RNA Pol II AGO wiązanie przez mirna i cięcie rekrutacja RDR6 RDR6 synteza drugiej nici RNA przez RDR6 (RNA-dependent RNA polymerase) 37

biogeneza tasirna c.d. dsrna jest cięty przez DCL4 na serię krótszych dsrna, uwalniając wiele cząsteczek tasirna z jednego genu TAS. 38

Z jednego genu TAS powstaje wiele cząsteczek tasirna miejsce cięcia pierwotnego transkryptu przy udziale mirna kluczowe dla zapewnienia specyficzności tasirna; DCL4 zaczyna ciąć prekursor dokładnie w tym miejscu i tnie w odstępach 21nt tasirna mogą powstawać z obu nici RNA DCL4 przesuwa się wzdłuż dsrna, odmierzając i tnąc 39 Allen, E., Xie,, Z., Gustafson, A M., and Carrington, J.C. (2005) Cell

Zaburzenia biogenezy tasirna zaburzenia rozwoju mutacja rdr6-15: brak tasirna Arabidopsis 4 rodziny genów TAS TAS1 i TAS2 tasirna PPR TAS3 tasirna czynniki transkrypcyjne ARF zip-1 (AGO7): brak TAS3 tasirna TAS4 tasirnas czynniki transkrypcyjne MYB Northern Mutacje rdr6 i zip, podobnie jak dcl4 i tas3, przyspieszają zmiany rozwojowe przyspieszone przejście z fazy juwenilnej do dorosłej: wydłużone liście, wywinięte pod spód d brzegi blaszek liściowych Fahlgren,, N., Montgomery, T.A., Howell, M.D., Allen, E., Dvorak, S.K., Alexander, A A.L., and Carrington, J.C. (2006) Curr.. Biol. 40

natsirna: : roślinne endogenne sirna natsirna natural antisense-transcript transcript derived sirna cis-acting pochodzą z zachodzących cych na siebie transkryptów genów w związanych zanych ze stresem zachodzące ce na siebie sekwencje sąsiadujących genów wyciszenie komplementarne względem siebie transkrypty NAT (natural antisense) tworzą dsrna AGO AGO Wg Katiyar-Agarwal Agarwal,, S., Morgan, R., Dahlbeck,, D., Borsani,, O., Villegas Jr.. A., Zhu, J.-K., Staskawicz,, B.J., and Jin, H. (2006) Proc. Natl.. Acad. Sci.. USA 41

natsirna: : roślinne endogenne sirna syntetyzowane w odpowiedzi na stres np. wysokie zasolenie gleby biogeneza: DCL2 i/lub DCL1, RDR6 (polimeraza( SGS3 (bia( białko wiążą i polimeraza RNA IV polimeraza RNA zależna od RNA), ążące RNA) ), 24 nt natsirna cięcie cie jednej z cząsteczek mrna,, druga służy s y jako matryca do syntezy 2-rz2 rzędowych 21nt natsirna przez RDR6 i DCL1 A. thaliana: lsirna (long sirna) 30-40nt również powstają z transkryptów NAT inne białka uczestniczą w biogenezie 42 Ghildiyal & Zamore (2009) Nat Rev Genet

Roślinne polimerazy RNA RNA DNA polimeraza RNA enzym występowanie funkcja Polimeraza RNA I wszystkie Eucaryota synteza rrna Polimeraza RNA II wszystkie Eucaryota synteza mrna, microrna Polimeraza RNA III wszystkie Eucaryota synteza trna, 5S rrna Polimeraza RNA IV rośliny biogeneza sirna Polimeraza RNA V rośliny rekrutacja białek AGO do DNA 43

Transkrypcyjne wyciszanie genów (TGS): hc-sirna małe RNA mogą hamować transkrypcję określonych genów w poprzez kowalencyjne modyfikacje DNA lub białek histonowych białka histonowe transkrypcja DNA wyciszenie Ten rodzaj wyciszenia jest często związany ze stale nieaktywnym transkrypcyjnie DNA, włączając rejony centromerowe i transpozony, ale również zachodzi w genach. 44

Transkrypcyjne wyciszanie genów (TGS) CaMV 35S pro : KAN ekspresja genu oporności na kanamycynę TGS u roślin odkryto podczas doświadczeń mających na celu wprowadzenie więcej niż jednej modyfikacji genetycznej poprzez krzyżowanie roślin CaMV 35S pro : HYG ekspresja genu oporności na higromycynę Based on Matzke, M., Primig, M., Trnovsky, J., Matzke, A. (1989) EMBO J. 45

Transkrypcyjne wyciszanie genów (TGS) x CaMV 35S pro : KAN CaMV 35S pro : HYG oczekiwane wyniki: selekcja na kanamycynie: 50% Kan R selekcja na higromycynie: 50% Hyg R selekcja na Kan + Hyg: 25% Kan R and Hyg R Based on Matzke, M., Primig, M., Trnovsky, J., Matzke, A. (1989) EMBO J. 46

Transkrypcyjne wyciszanie genów (TGS) CaMV 35S pro : KAN W niektórych przypadkach jeden z wprowadzonych genów był wyciszany w roślinach potomnych mających obie modyfikacje CaMV 35S pro : HYG obserwowane wyniki: selekcja na kanamycynie: 50% Kan R selekcja na higromycynie: 0% Hyg R selekcja na Kan + Hyg: 0% Kan R and Hyg R Based on Matzke, M., Primig, M., Trnovsky, J., Matzke, A. (1989) EMBO J. 47

Transkrypcyjne wyciszanie genów (TGS) CaMV 35S pro : KAN W niektórych przypadkach jeden z wprowadzonych genów był wyciszany w roślinach potomnych mających obie modyfikacje CaMV CaMV35S pro :: HYG metylacja DNA CaMV 35S pro : HYG DNA w rejonie promotora wyciszonego genu jest metylowane Based on Matzke, M., Primig, M., Trnovsky, J., Matzke, A. (1989) EMBO J. 48

sirna mogą wyciszać DNA za pośrednictwem enzymów metylujących cytozyny lub modyfikujących białka histonowe O N NH2 N ~ cytozyna O N metylotransferaza NH2 N ~ CH3 5-metylocytozyna DNA może być kowalencyjnie modyfikowany w reakcji metylacji cytozyny W mechanizm transkrypcyjnego wyciszania DNA przez sirna zaangażowane sąs dwie specyficzne dla roślin polimerazy RNA: Pol IV i Pol V AGO metylotransferaza DNA modyfikacja histonów metylacja DNA 49

Polimerazy RNA IV i V uczestniczą w transkrypcyjnym wyciszaniu genów RNA Pol IV Polimeraza RNA IV uczestniczy w biogenezie sirna. modyfikacja histonów metylacja DNA RNA Pol V Niekodujące transkrypty polimerazy RNA V nakierowują maszynerię wyciszającą do odpowiednich sekwencji DNA. 50

Polimerazy RNA IV i V uczestniczą w transkrypcyjnym wyciszaniu genów Polimeraza RNA IV uczestniczy w biogenezie sirna. Haag J.R., Pikaard C.S., (2011 11) Nat Rev Mol Cell Biol Niekodujące transkrypty polimerazy RNA V nakierowują maszynerię wyciszającą do odpowiednich sekwencji DNA. 51

sirna - podsumowanie Szlak sirna wycisza egzogenny, obcy DNA, transpozony oraz sekwencje powtórzone sirna powstają dzięki aktywności białek typu Dicer,, które tną dsrna sirna są wiązane przez białka z rodziny AGO i tworzą kompleksy wyciszające (RISC) Kompleksy wyciszające mogą działać potranskrypcyjnie,, poprzez cięcie mrna lub inhibicję translacji Kompleksy wyciszające mogą zmieniać strukturę chromatyny poprzez metylację DNA lub modyfikację białek histonowych 52

microrna - mirna uważa się, że mirna wyewoluowały z sirna powstają i dojrzewają w podobny (do pewnego stopnia) sposób mirna są kodowane przez specyficzne geny MIR,, ale wpływają na ekspresję innych genów są cząsteczkami regulatorowymi działającymi in trans mirna u roślin (również u zwierząt) regulują procesy rozwojowe i fizjologiczne 53

microrna - mirna microrna działaja poprzez cięcie mrna lub inhibicję translacji gen MIR Inhibicja translacji AGO AAAn DCL RNA Pol II cięcie cie mrna AGO AAAn AGO AAAn mrna AAAn RNA Pol II 54

microrna - mirna aktywna translacja inhibicja inicjacji translacji degradacja mrna inhibicja translacji 55 Stefani G., Slack F. J., (2008) Mol Cell Biol

microrna - mirna aktywna translacja degradacja mrna 56 Stefani G., Slack F. J., (2008) Mol Cell Biol

Destabilization of target mrna is the predominant reason for reduced protein output. Step 1. Initial effect of mirnas: : inhibition of translation at the initiation step without mrna decay. Step 2. mrna deadenylation by PAN2 PAN3 PAN3 and CCR4 NOT complexes recruited by mirisc as a consequence of translation inhibition that makes poly(a) ) tail more accessible. Step3. Stimulated deadenylation potentiates the effect on translational inhibition and leads to decay of target mrnas through the recruitment of the decapping machinery. 57

Geny MIR: : transkrypcja długich d cząsteczek pri-mi mirna z których powstają mirna mirna są kodowane przez geny MIR pierwotne transkrypty mirna (pri-mirna) tworzą drugorzędowe, dwuniciowe struktury, które są rozpoznawane i cięte przez białka Dicer (u roślin DCL1) nić mirna* jest degradowana MIR gene 5' pri-mirna 3' DCL1 5' mirna 3' mirna* mirna mrna target 58

Biogeneza mirna u roślin transkrypcja DNA pri-mirna HYL1: oddziaływanie z DCL1 cięcie cie mirna mirna* HEN1: metylotransferaza, metylacja mirna/mirna mirna* HST (HASTY( HASTY): eksport mirna/mirna mirna* do cytoplazmy, homolog eksportyny 5 metylacja eksport tworzenie kompleksu RISC jądro komórkowe cytoplazma mrna Mallory A., Vaucheret H. (2006) Nature Genet. cięcie cie mrna 59

Biogeneza mirna u zwierząt DNA transkrypcja pri-mirna Drosha+DGCR8 (Pasha cięcie cie pri-mirna pre-mirna Pasha): jądro komórkowe cięcie cie pre-mirna EXP5 (eksportyna 5): eksport pre-mirna do cytoplazmy cytoplazma eksport pre-mirna Dicer: cięcie cie pre-mirna mirna/mirna mirna* cięcie cie mirna/mirna mirna* tworzenie kompleksu RISC Wg: Ding X.C., Weiler J., Grosshans H. (2009) Trends in Biotechnology 60

Biogeneza mirna u roślin i zwierząt eksport z jądra j komórkowego do cytoplazmy pri-mirna pri-mirna MIRTRONY 61 Carthew R. W., Sontheimer E. J., (2009) Cell

Mirtrony występuj pują u D. melanogaster, C. elegans,, ssaków lariat powstaja z intronów wyciętych z pre-mrna podczas składania mrna (splicing) niezależne ne od Drosha rozcięcie cie struktury lariatu (debranching) prowadzi do powstania pre-mirna pre-mirna mirna biogeneza mirna 62 Kim V. N., Han J., Siomi M.C. (2009) Mol Cell Biol

Niektóre mirna są konserwowanymi ewolucyjnie regulatorami ekspresji genów Factors Factors Blisko połowa spośród genów regulowanych przez mirna to czynniki transkrypcyjne Fahlgren,, N., Howell, M.D., Kasschau,, K.D., Chapman, E.J., Sullivan, C.M., Cumbie,, J.S., Givan,, S.A., Law, T.F., Grant, S.R., Dangl,, J.L., and Carrington, J.C. (2007) PLoS ONE. 63

Przykłady genów regulowanych przez mirna u roślin rodzina mirna rodzina genów regulowanych przez mirna funkcja 156 czynniki transkrypcyjne SPL Synchronizacja procesów rozwojowych 160 czynniki transkrypcyjne ARF Odpowiedź na auksyny, procesy rozwojowe 165 czynniki transkrypcyjne HD-ZIPIII Rozwój, polaryzacja 172 czynniki transkrypcyjne AP2 Synchronizacja procesów rozwojowych, floral organ identity 390 TAS3 (tasirna regulują ekspresję czynników transkrypcyjnych ARF) Odpowiedź na auksyny, procesy rozwojowe 395 Transport siarczanów Asymilacja siarki 399 Ubikwitynacja białek Asymilacja fosforu 64 Wg Willmann,, M.R., and Poethig,, R.S. (2007) Curr. Opin.. Plant Biol.

mirna - podsumowanie Uważa się, że mirna regulują większość procesów biologicznych zarówno u roślin jak i zwierząt, kontrolując ekspresję specyficznych genów działając in trans mirna regulują procesy rozwojowe: np. u A. thaliana mir156 i mir172 regulują procesy kwitnienia; u C. elegans wyciszenie lin-14 przez lin-4 jest potrzebne do prawidłowego rozwoju mirna działają głównie poprzez obniżenie poziomu mrna, ale również poprzez inhibicję translacji 65

Małe RNA niezależne od Dicer: pirna ~25-30 nt,, 2 -O-metylowane 2 końce 3 3 występuj pują u zwierząt, zidentyfikowane w liniach komórek rozrodczych D. melanogaster wiążą się z białkami PIWI: Piwi, Aubergine,, Ago3 D. melanogaster MILI, MIWI, MIWI2 mysie HILI, HIWI1, HIWI2 ludzkie C. elegans 21U RNA 21 nt wiąż ąże e PRG-1 (Piwi Piwi-related gene 1) metylacja końca 3 3 wyciszanie transpozonów i powtórze rzeń DNA, u ssaków metylacja DNA sekwencji transpozonowych 66 Ghildiyal & Zamore (2009) Nat Rev Genet

67 Ghildiyal & Zamore (2009) Nat Rev Genet

Małe RNA niezależne od Dicer prirna primal small RNAs zidentyfikowane u S.pombe tworzenie/utrzymywanie heterochromatyny w rejonach centromerowych Triman: : 3-5 egzorybonukleaza obróbka prekursorów prirna i sirna 68

Podsumowanie Wyciszanie genów w za pośrednictwem małych RNA odgrywa istotną rolę zarówno w regulacji ekspresji, jak i w zachowaniu integralności genomów organizmów żywych. Specyficzność wyciszenia określonych genów zapewniona jest dzięki komplementarności zasad między małym wyciszającym cym RNA, a RNA ulegającym wyciszeniu. Za pośrednictwem sirna wyciszane sąs m.in. regiony bogatej w powtórzenia DNA heterochromatyny, sekwencje transpozonowe,, wirusy i inne patogeny. mirna i tasirna regulują m.in. ekspresję genów związanych zanych z zegarem biologicznym, rozwojem, reakcją na stres. 69