Rola procesu apoptozy w etiopatogenezie autoimmunologicznego zapalenia tarczycy

Rola procesu apoptozy w etiopatogenezie autoimmunologicznego zapalenia tarczycy 87 ARTYKUŁ REDAKCYJNY Rola procesu apoptozy w etiopatogenezie autoimmunologicznego zapalenia tarczycy KATARZYNA ŁĄCKA 1, ADAM MACIEJEWSKI 2 Uniwersytet Medyczny im. K. Marcinkowskiego w Poznaniu: 1 Katedra Endokrynologii, Przemiany Materii i Chorób Wewnętrznych, kierownik: dr hab. med. M. Ruchała; 2 Studenckie Towarzystwo Naukowe, opiekun Koła: prof. dr hab. med. K. Łącka Rola procesu apoptozy w etiopatogenezie autoimmunologicznego zapalenia tarczycy Łącka K. 1, Maciejewski A. 2 Uniwersytet Medyczny im. K. Marcinkowskiego w Poznaniu: 1 Katedra Endokrynologii, Przemiany Materii i Chorób Wewnętrznych, 2 Studenckie Towarzystwo Naukowe Autoimmunologiczne zapalenie tarczycy (choroba Hashimoto), to choroba wieloczynnikowa o złożonej etiopatogenezie. Jednym z proponowanych mechanizmów biorących w niej udział, jest apoptoza proces niezbędny dla zachowania homeostazy, której deregulacja stanowi przyczynę wielu chorób. Istnieją dwie drogi aktywacji apoptozy: wewnątrz- i zewnątrzpochodna. Zewnątrzpochodna może być inicjowana m.in. przez wiązanie FasL do receptora Fas. Szlak apoptozy indukowany przez FasL polega na kaskadowej aktywacji kolejnych kaspaz, aż do pobudzenia cząsteczek efektorowych. Istnieje również wiele inhibitorów apoptozy, na czele z białkiem Bcl-2. W przebiegu choroby Hashimoto dochodzi do: zwiększenia ekspresji Fas/FasL, zwiększenia stężenia kaspaz i białka Bid, zmniejszenia stężenia Bcl-2 w obrębie tyreocytów, a jednocześnie zwiększenia Bcl-2 w obrębie limfocytów wewnątrztarczycowych. Sprzyja to apoptozie tyreocytów i destrukcji gruczołu tarczowego. Za główny czynnik wywołujący takie zmiany, uważa się działające synergistycznie cytokiny prozapalne IFN- oraz TNF lub IL-. Możliwa jest też rola TSH, T 3 i T 4, przeciwciał TSAb i TSBAb oraz stężenia jodu w regulacji ekspresji czynników pro- i antyapoptotycznych. Znaczenie białka TRAIL w przebiegu choroby Hashimoto również wymaga wyjaśnienia. Słowa kluczowe: zapalenie autoimmunologiczne tarczycy, apoptoza, FasL Pol. Merk. Lek., 2012, XXXII, 188, 87 The role of apoptosis in the etiopathogenesis of autoimmune thyroiditis Łącka K. 1, Maciejewski A. 2 Medical University of Poznan, Poland: 1 Department of Endocrinology, Metabolism and Internal Medicine; 2 Student s Scientific Society Autoimmune thyroiditis (Hashimoto's disease) is a polygenic disorder with complex etiopathogenesis. Apoptosis is proposed as one of its mechanisms. Programmed cell death is essential for the maintenance of homeostasis, but when it is deregulated, it may contribute to the development of disorders. There are two apoptotic pathways: intrinsic and extrinsic. The extrinsic pathway may be activated among others through FasL binding to its receptor Fas. The FasL induced apoptotic pathway proceeds with cascade activation of following caspases, with final effector proteins recruitment. There is also a group of inhibitory proteins of apoptosis, where the Bcl-2 protein predominates. In the course of Hashimoto s disease the following aberrations are encountered: increased Fas/FasL expression, caspases and Bid protein concentrations, decreased Bcl-2 concentration and at the same time increase of Bcl-2 within intrathyroidal lymphocytes. They favor the thyrocytes apoptosis and thyroid gland destruction. Synergistically acting proapoptotic cytokines IFN- and TNF or IL-, are considered to be major factors of the abnormalities mentioned above. TSH, T 3 and T 4, TSAb and TSBAb antibodies and iodide concentration may also play a role in pro- and antiapoptotic factors expression regulation. The role of TRAIL protein in the course of Hashimoto s thyroiditis needs evaluation. The current data on the role of apoptosis in the etiopathogenesis of the autoimmune thyroiditis will be presented and discussed. Key words: autoimmune thyroiditis, apoptosis, FasL Pol. Merk. Lek., 2012, XXXII, 188, 87 Choroba Hashimoto, określana też jako przewlekłe limfocytowe (autoimmunologiczne) zapalenie tarczycy, to jednostka chorobowa, opisana po raz pierwszy już w 1912 roku, której istotą jest występowanie procesu autoimmunologicznego, skierowanego przeciw komórkom pęcherzykowym tarczycy. Prowadzi to do zmian w obrębie gruczołu: powstania intensywnych nacieków z limfocytów, układających się w grudki chłonne, a także zaniku pęcherzyków, rozplemu tkanki łącznej i metaplazji onkocytarnej komórek pęcherzykowych [18]. Klinicznie zmianom tym może towarzyszyć postępujące zaburzenie czynności tarczycy: subkliniczna lub jawna jej niedoczynność. Spora grupa pacjentów pozostaje jednak w eutyreozie, obserwuje się także powrót do prawidłowej czynności, u pacjentów z uprzednią niedoczynnością [12]. W ostatnich latach dokonał się znaczny postęp w zakresie znajomości przyczyn oraz patogenezy choroby Hashimoto. Choroba ta ma charakter wieloczynnikowy rozwija się w sytuacji współistnienia genetycznych predyspozycji oraz środowiskowych czynników spustowych. Do najważniejszych czynników genetycznych należą określone warianty genów układu HLA (ang. human leukocyte antigen), polimorfizmy w obrębie genów dla PTPN22 (ang. protein tyrosine phosphatase, non-receptor type 22), CTLA4 (ang. cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4) czy Tg, jak też zmienności w regionach kodujących pewne cytokiny prozapalne. Czynniki środowiskowe to, zgodnie z obecną wiedzą, przede wszystkim nadmiar jodu, interferon, infekcje bakteryjne i wirusowe [22]. Choć znajomość mechanizmów choroby pozostaje niekompletna, pojawiają się jednak interesujące hipotezy, które z pewnością zasługują na bliższą uwagę. W tej pracy zostanie przedstawiona jedna z nich, mówiąca o roli apoptozy,

88 K. Łącka, A. Maciejewski proliferacji oraz równowagi między tymi procesami w patogenezie chorób autoimmunologicznych, w tym chorób tarczycy. DEFINICJA APOPTOZY Termin apoptoza został po raz pierwszy użyty przez Kerrego i wsp. w 1972 roku [21] i oznacza on zaprogramowaną śmierć komórki. Apoptoza jest procesem fizjologicznym, niezbędnym w organizmie do utrzymania homeostazy. Coraz więcej badań wskazuje jednak, że jej nadmierna lub niedostateczna aktywność może być istotnym składnikiem wielu chorób. Zaburzenia tej swoistej równowagi mogą odgrywać też rolę w procesach autoimmunologicznych tarczycy. Apoptoza jest istotna w procesie eliminacji autoreaktywnych limfocytów, dlatego zmniejszenie jej aktywności może prowadzić do zwiększenia liczby autoreaktywnych komórek na obwodzie. Z drugiej strony intensywność apoptozy już w samym gruczole tarczowym, dotycząca zarówno tyreocytów, jak i limfocytów wewnątrztarczycowych, może decydować o fenotypie choroby autoimmunologicznej tarczycy, dając obraz jej niedoczynności lub prowadząc do nadmiernego wytwarzania hormonów tarczycy. Istnieją dwie drogi aktywacji apoptozy: droga zewnątrzpochodna, inicjowana w wyniku wiązania ligandów do białek z nadrodziny receptora czynnika martwicy guza TNFR (ang. tumor necrosis factor receptor) oraz wewnątrzpochodna (mitochondrialna), która może zostać zapoczątkowana uszkodzeniem istotnych struktur komórkowych, jak DNA, niewyrównaniem metabolicznym czy też zakłóceniem cyklu komórkowego [19]. Do przedstawicieli nadrodziny TNFR, mogących zapoczątkować programowaną śmierć komórki, należą: CD95/Fas, TRAILR1, TRAILR2, TNF-R1. Fas ZALEŻNA DROGA INDUKCJI APOPTOZY Szczególną rolę w patogenezie chorób autoimmunologicznych tarczycy AITD (ang. autoimmune thyroid diseases), w tym autoimmunologicznego zapalenia typu Hashimoto, przypisuje się obecnie szlakowi indukcji apoptozy poprzez wiązanie cząsteczki FasL z jej receptorem Fas. Po związaniu ligandu, dochodzi do połączenia wewnątrzkomórkowej domeny Fas z białkiem adaptorowym FADD (ang. Fas-associated death domain protein), które z kolei przyłącza cząsteczki prokaspazy 8 (rodzina białkowych proteaz cysteinowych, określanych też jako FLICE ang. FADD-like interleukin 1b-converting enzyme), tworząc w efekcie kompleks DISC (ang. death-induced signaling complex). Aktywowana w tym procesie cząsteczka kaspaza 8 indukuje aktywację prokaspazy 3, głównej efektorowej proteazy cysteinowej, która selektywnie oddziałując na białka, hamuje ich aktywność bądź aktywuje je i ostatecznie doprowadza do destrukcji komórki. Wspomniana wcześniej droga wewnątrzpochodna, może zostać zainicjowana nie tylko w rezultacie wewnątrzkomórkowych uszkodzeń, ale także poprzez aktywowane komponenty drogi zewnątrzpochodnej cząsteczki kaspazy 8, w czym pośredniczy proapoptotyczne białko z rodziny Bcl-2 (ang. B-cell lymphoma-2) cząsteczka Bid (ang. BH3 interacting domain death agonist). Przy udziale białek Bax (ang. Bcl-2 associated X protein) /Bak (ang. Bcl-2 antagonist killer) następnie tworzone są pory w błonie zewnętrznej mitochondriów, co prowadzi do uwolnienia z przestrzeni międzybłonowej organelli cząsteczek, na czele z cytochromem c. Cytochrom c formuje wraz z prokaspazą 9 i cząsteczką adaptorową APAF-1 (ang. apoptotic protease activating factor-1) kompleks apoptozom. Aktywowana w tym procesie kaspaza 9 uczynnia z kolei kaspazę 3, w tym momencie obie drogi (zewnątrz- i wewnątrzpochodna) powtórnie spotykają się [19]. Opisane procesy podlegają regulacji, dzięki cząsteczkom hamującym, działającym na różnych etapach kaskady reakcji prowadzących do apoptozy. Są to kolejno: białko FAP-1 (ang. Fas-associated phosphatase 1), które przeciwdziała przekazywaniu sygnałów z Fas na domeny regulatorowe, c-flip (ang. FLICE inhibitory protein) zdegenerowany homolog kaspaz, regulujący aktywację kaspazy 8. W tym miejscu należy wymienić też białka z rodziny Bcl-2, wśród których znajdują się zarówno cząsteczki pro-, jak i antyapoptotyczne. Do antyapoptotycznych zalicza się przede wszystkim Bcl-2 i Bcl-x L, których głównym mechanizmem działania jest przeciwdziałanie uwalnianiu cytochromu c z mitochondriów. Ostatnią linią obrony przed apoptozą są inhibitorowe białka apoptozy IAP (ang. inhibitor of apoptosis), których hamujący wpływ jest głównie efektem wiązania proteaz cysteinowych z grupy kaspaz. Ich rola wydaje się jednak ograniczona, prawdopodobnie nie są one w stanie zatrzymać uruchomionego już szlaku apoptozy, a jedynie stanowią zabezpieczenie przed przypadkową aktywacją kaspaz. W czasie aktywacji drogi mitochondrialnej, obok cytochromu c uwalniany jest bowiem inhibitor cząsteczek IAP znany jako Smac (ang. second mitochondria-derived activator of caspase)/diablo [19]. Komórki można podzielić na dwie grupy, zależnie od przebiegu ich odpowiedzi na indukcję apoptozy za pośrednictwem Fas. Do typu I zalicza się komórki mezenchymalne, w ich przypadku związanie FasL do receptora powoduje powstanie znacznych ilości aktywnej kaspazy 8, która jest w stanie aktywować bezpośrednio efektorową kaspazę 3, nie jest zatem konieczne wzmocnienie sygnału poprzez aktywację drogi mitochondrialnej. W związku z tym ekspresja Bcl-2 lub Bcl-x L, mimo hamowania uwalniania czynników mitochondrialnych, nie jest w stanie zatrzymać uruchomionego programu apoptozy. Typ II stanowią komórki nabłonkowe, w tym komórki gruczołu tarczowego, które w odpowiedzi na aktywację receptora Fas wytwarzają niedostateczną ilość aktywnej kaspazy 8 i są całkowicie zależne od wzmocnienia sygnału na drodze aktywacji szlaku mitochondrialnego. W rezultacie istotną rolę odgrywa w tym przypadku białko z rodziny Bcl-2, wspomniana wcześniej cząsteczka Bid to właśnie ona pośredniczy w aktywacji drogi wewnątrzpochodnej. Istotna jest tu także rola inhibitorowych białek Bcl-2 i Bcl-x L, które mogą zablokować apoptozę [1]. ZMIANY EKSPRESJI Fas/FasL W CHOROBIE HASHIMOTO To czy cząsteczki Fas i FasL znajdują się na powierzchni prawidłowego gruczołu tarczowego budziło kontrowersje ze względu na sprzeczne wyniki. Można przyjąć, że białka te podlegają ekspresji w prawidłowych tyreocytach, jednak ich stężenia są niewielkie, niewystarczające do zainicjowania apoptozy [27]. Zakłada się jednak, że ich ekspresja wzrasta w obrębie tarczycy w przebiegu procesu zapalnego, w tym u chorych na autoimmunologiczne zapalenie typu Hashimoto. Ta wzmożona ekspresja obu białek wydaje się prowadzić do aktywacji procesu apoptozy w obrębie komórek pęcherzykowych tarczycy, na drodze mechanizmów samobójczych, jak i bratobójczych. Zwiększenie ekspresji powierzchniowej Fas/FasL w przebiegu choroby Hashimoto potwierdzono w licznych badaniach, wskazując jednocześnie, że jest ona większa nie tylko u osób zdrowych, ale też u chorujących na drugą z chorób autoimmunologicznych tarczycy chorobę Gravesa-Basedowa [3, 17]. Co więcej ta wzmożona ekspresja Fas/FasL pociąga za sobą mierzalne zwiększenie współczynnika apoptozy. Potwierdzeniem aktywacji programowanej śmierci komórek jest także rosnące stężenie kaspazy 8. Tak więc zmiany ekspresji tych proapoptotycznych cząsteczek w obrębie tyreocytów osób chorujących na chorobę Hashimoto prowadzą do nasilenia apoptozy komórek tarczycy, co może mieć swoje konsekwencje w obrazie klinicznym choroby i czynności hormonalnej gruczołu.

Rola procesu apoptozy w etiopatogenezie autoimmunologicznego zapalenia tarczycy 89 Interesującą kwestią wydaje się nie tylko ekspresja Fas/FasL, jaką wykazują tyreocyty, ale też limfocyty wewnątrztarczycowe osób chorujących na autoimmunologiczne choroby tarczycy, bowiem również te komórki mogą podlegać procesom apoptozy zależnym od aktywacji Fas. Badania przeprowadzone przez Bossowskiego i wsp. wskazały, że ekspresja cząsteczek Fas/FasL na wewnątrztarczycowych limfocytach T jest większa u chorych z chorobą Gravesa-Basedova, niż u chorych z zapaleniem Hashimoto. Może się to wiązać z nasileniem apoptozy limfocytów T napływających do tarczycy w chorobie Gravesa-Basedova. To z kolei działa ochronnie na tyreocyty, ze względu na rolę limfocytów T w destrukcji gruczołu tarczowego, prowadząc ostatecznie, inaczej niż w zapaleniu Hashimoto, do przewagi procesów proliferacji nad procesami niszczenia tyreocytów [3]. Przedstawiona teza wymaga jednak z pewnością dalszego potwierdzenia, szczególnie zważywszy na różnice w wynikach otrzymywanych w poszczególnych badaniach. Maruoka i wsp. przedstawili wyniki, zgodnie z którymi ekspresja Fas była podwyższona na powierzchni limfocytów obwodowych chorych na ciężką postać choroby Hashimoto i trudno poddającą się leczeniu chorobę Gravesa-Basedova, podczas gdy u pozostałej części badanych z chorobą Gravesa była ona obniżona. Badacze ci nie wykazali jednocześnie ekspresji FasL w błonie komórkowej obwodowych limfocytów T, tak w grupie chorych, jak i w grupie kontrolnej [23]. Kolejne wyniki z tego zakresu wydają się być zbliżone do rezultatów Maruoka i wsp. proporcja limfocytów T CD4+ i CD8+ wykazujących ekspresję Fas jest podwyższona u chorych z AITD, przy czym intensywność ekspresji tej cząsteczki na komórce limfocytarnej w chorobie Gravesa-Basedowa jest znacząco niższa niż w grupie kontrolnej, jak i u badanych z chorobą Hashimoto. Powtórnie nie udało się stwierdzić występowania FasL na limfocytach obwodowych u chorych oraz w grupie kontrolnej [16]. Limfocyty T wykazujące ekspresję błonowego FasL, teoretycznie również mogłyby indukować apoptozę tyreocytów, jak wynika jednak z badań, w tym tych przedstawionych, ilość przezbłonowych cząsteczek FasL limfocytów jest nieznaczna, mniejsza niż ich ilość na samych tyreocytach. Tak więc rola limfocytów w indukowaniu apoptozy komórek tarczycy, wydaje się sprowadzać przede wszystkim do wpływu na ekspresję proapoptotycznych cząsteczek przez tyreocyty, za pośrednictwem wydzielanych cytokin, a nie na bezpośrednim uśmiercaniu komórek pęcherzykowych poprzez interakcję Fas z FasL [8]. We wspomnianym już wcześniej badaniu Fountoulakis i wsp. zaobserwowali, że cząsteczki Fas/FasL występują także w błonie komórkowej innych składowych układu odporności, czyli na monocytach i granulocytach. Jednak w tym wypadku proporcja komórek wykazujących taką ekspresję, jak i jej intensywność, nie różniły się znacząco statystycznie pomiędzy chorującymi na chorobę Hashimoto, Gravesa-Basedowa oraz grupą kontrolną [16]. Hipoteza przedstawiona w pracy Bossowskiego i wsp., mówiła o tym, że wzmożona ekspresja Fas/FasL na limfocytach obwodowych chorych na chorobę Gravesa-Basedowa, mogła działać ochronnie na komórki tarczycy. Greccy uczeni wskazują za to na inne możliwe wyjaśnienie większej przeżywalności tyreocytów w chorobie Gravesa-Basedowa względem chorych na chorobę Hashimoto. Oprócz postaci Fas i FasL zakotwiczonych w błonie komórkowej, istnieją też rozpuszczalne formy obu cząsteczek, odpowiednio sfas i sfasl. sfas stanowi produkt alternatywnego składania mrna dla Fas i pozbawiona jest domeny przezbłonowej. sfasl natomiast to produkt proteolitycznego rozkładu FasL. O ile rola sfasl w patogenezie chorób autoimmunologicznych tarczycy nie jest określona, o tyle znaczenie sfas wydaje się być potwierdzone. Wyniki badań wskazują na wyższą koncentrację tej rozpuszczalnej formy w chorobie Gravesa-Basedowa, niż w zapaleniu typu Hashimoto. Z kolei wyższa koncentracja sfas w osoczu może działać ochronnie na komórki wykazujące ekspresję przezbłonowej postaci tego białka poprzez związanie FasL, hamując tym samym aktywność apoptozy. Zaobserwowano jednocześnie, że wyższa koncentracja sfas w chorobie Gravesa-Basedowa wiąże się z obniżeniem ekspresji tego białka na powierzchni obwodowych limfocytów T CD4+. Wskazywałoby to, że powstawanie przezbłonowej postaci Fas oraz formy sfas, jest odwrotnie regulowane [16]. ZMIANY EKSPRESJI INHIBITORÓW APOPTOZY W CHOROBIE HASHIMOTO Na stan równowagi między procesami proliferacji i samobójczej śmierci komórek w przebiegu zapalenia autoimmunologicznego tarczycy ma również wpływ ekspresja cząsteczek inhibitorowych apoptozy w obrębie tyreocytów. Należy do nich, co zostało wcześniej opisane, m.in. białko Bcl-2. Również jego występowanie wydaje się być odmienne w przebiegu obu chorób autoimmunologicznych tarczycy. Zgodnie z badaniami wzmożone jest w obrębie tyreocytów w chorobie Gravesa-Basedowa, obniżone natomiast, także w stosunku do próby kontrolnej, w komórkach tarczycy chorych z zapaleniem Hashimoto [8]. Byłby to więc kolejny czynnik, który tłumaczyłby ten skrajnie odmienny obraz kliniczny w obu jednostkach chorobowych tarczycy. Tak więc tyreocyty w chorobie Hashimoto, nie dosć, że narażone są na intensywną aktywację szlaków apoptozy, to osłabione są u nich także mechanizmy regulacyjne, które zahamowałyby tę już rozpoczętą kaskadę prowadzącą do samodestrukcji. Białko Bcl-2 podlega ekspresji także w obrębie limfocytów, w tym tych infiltrujących gruczoł tarczowy. Wzór ekspresji jest jednak przeciwny, w stosunku do obserwowanego dla tyreocytów niskie wartości stwierdzono w limfocytach obwodowych w chorobie Gravesa-Basedowa, podczas gdy wysokie charakteryzowały komórki chorych na chorobą Hashimoto [17]. DEFEKTY SZLAKU APOPTOZY A CHOROBA HASHIMOTO Postulowana jest rola zwiększonej aktywności apoptozy zależnej od Fas w patogenezie choroby Hashimoto, należy jednak zwrócić uwagę na fakt, że uogólniony defekt tego szlaku również może prowadzić do pojawienia się chorób autoimmunologicznych. Zjawisko samobójczej śmierci ma znaczenie dla regulacji homeostazy limfocytów, poprzez mechanizm obwodowej delecji. Dotyczy to zarówno aktywowanych limfocytów po zakończeniu odpowiedzi immunologicznej, jak i autoreaktywnych komórek układu odporności. Zaburzenie tej równowagi, obserwowane u myszy z mutacjami genów dla Fas lub FasL, skutkuje akumulacją limfocyów T i rozwojem limfadenopatii lub chorób autoimmunologicznych [26]. U ludzi stan ten, wynikły z mutacji genu dla Fas, FasL lub dalszych elementów szlaku sygnałowego apoptozy, określa się jako odpowiedni typ autoimmunizacyjnego zespołu limfoproliferacyjnego ALPS (ang. autoimmune lymphoproliferative syndrome). Kolejnych dowodów, na zależność pomiędzy tego typu defektami, a pojawieniem się autoimmunizacji, dostarczają obserwacje przeprowadzone przez Bona i wsp. Przebadali oni grupę chorych na autoimmunologiczne zapalenie tarczycy (choroba Hashimoto i Gravesa-Basedowa w przeważającej części dzieci). Jak się okazało, istotna część z nich, w stosunku do grupy kontrolnej, wykazywała osłabioną odpowiedź na stymulację receptora Fas. W przeciwieństwie do chorych z ALPS, nie obserwowano natomiast cech limfoproliferacji, takich jak: limfadenopatia czy splenomegalia. Ponadto hodowla w warunkach wysokiego stężenia IL-2, prowadziła do uwrażliwienia na apoptozę indukowaną FasL. Obserwowany defekt nie wiązał się z mutacjami Fas ani FasL,

90 K. Łącka, A. Maciejewski co wskazywałoby, że był rezultatem zaburzeń poreceptorowego szlaku przekazywania sygnału. Co istotne, wśród chorych z defektami szlaku apoptozy, stwierdzono cięższy przebieg choroby Hashimoto [2]. CZYNNIKI REGULUJĄCE EKSPRESJĘ MARKERÓW PROLIFERACJI I APOPTOZY Dlaczego w przebiegu choroby Hashimoto dochodzi do opisanych zmian ekspresji markerów apoptozy i proliferacji w stosunku do tarczycy prawidłowej, skąd biorą się różne wzorce dystrybucji tych cząsteczek u chorujących na oba typy autoimmunologicznego zapalenia tarczycy? Są to kolejne pytania, na które należy znaleźć odpowiedź, chcąc wyjaśnić patogenezę chorób autoimmunologicznych gruczołu tarczowego. Istotna wydaje się przede wszystkim rola cytokin prozapalnych, które są uwalniane przez napływające do tarczycy komórki układu odpornościowego. W zapaleniu tarczycy typu Hashimoto dominującą rolę odgrywa odpowiedź związana z limfocytami pomocniczymi typu pierwszego (Th 1 ), prowadząca do wytwarzania głównie cytokin, takich jak: IFN- (ang. interferon gamma), TNF (ang. tumor necrosis factor) i IL-12, a nie ta kontrolowana przez komórki Th 2 (wytwarzane IL-4, IL-10), charakterystyczna raczej dla choroby Gravesa-Basedova [9]. Jak już wcześniej zostało wspomniane, wydaje się, że niewielka ilość powierzchniowych form, zarówno Fas, jak i FasL, jest stale obecna w błonie komórkowej tyreocytów, nie prowadzi to jednak do aktywacji szlaku apoptozy. Badania in vitro z wykorzystaniem hodowli tyreocytów udowodniły, że sytuacja zmienia się pod wpływem ekspozycji na synergistycznie oddziałujące: IFN- oraz TNF lub IL-. Pojedyncze cytokiny mogą co prawda również nieznacznie podnosić stężenie błonowego Fas, ale nie obserwuje się przy tym zwiększonej podatności na apoptozę zależną od Fas [4]. Nowsze prace dostarczają bardziej szczegółowych informacji na temat molekularnych mechanizmów działania tych prozapalnych cytokin. Odbywa się to na drodze kilku mechanizmów, oprócz wspomnianego już zwiększenia ekspresji Fas na powierzchni tyreocytów, zmiany obejmują też różne elementy kaskady sygnałowej szlaku apoptozy. W jednym z badań wykazano, że hodowla tyreocytów w środowisku IFN- i IL- prowadzi do zwiększenia ekspresji Fas na powierzchni komórek, ale też do zwiększenia stężenia prokaspaz: 8, 10 i 7. Spośród białek rodziny Bcl-2 zaobserwowano najistotniejsze zwiększenie ekspresji cząsteczki Bid, w mniejszym stopniu Bcl-x L oraz Bak, a także nieznaczne zmniejszenie stężenia Bcl-2 [24]. Co prawda w kontrolnej hodowli komórek, niepoddanej działaniu cytokin, inkubacja ze stymulującym receptor Fas przeciwciałem, także zdołała zapoczątkować szlak apoptozy doszło do aktywacji proksymalnych kaspaz: 8 i 10. Proces ten jednak zatrzymał się na tym etapie, prawdopodobnie ze względu na działanie inhibitorowych białek XIAP (ang. X-linked IAP rodzina IAP). Najistotniejsze ze zmian w obrębie komórek tarczycy po inkubacji w środowisku cytokin, wydaje się więc znaczne zwiększenie stężenia Bid, co sprawia że staje się możliwa aktywacja drogi mitochondrialnej apoptozy, a w konsekwencji uwolnienie cytochromu c, ale też cząsteczek Smac/DIABLO inhibitorów wcześniejszej przeszkody w postaci XIAP. Wang i wsp. zastosowali inne podejście w badaniach wpływu IFN- i IL- na uwrażliwienie tyreocytów mierzono zmiany ekspresji genów komórki metodą mikromacierzy cdna. W rezultacie stwierdzono, że pobudzane są liczne geny związane ze szlakiem sygnałowym apoptozy, białkami błonowymi komórek, wewnątrzkomórkowymi cząsteczkami związanymi z transportem czy cząsteczkami sygnałowymi retikulum endoplazmatycznego i mitochondriów. Zaobserwowano m.in. zwiększenie stężenia kaspaz 1, 3, 4, 7, 8 i 10 oraz cząsteczki Bid w obrębie tyreocytów [29]. Poza tym na uwagę zasługuje obserwowana aktywacja p38 MAPK (ang. mitogen-activated protein kinase) i wzmożona ekspresja inos (ang. inducible nitric oxide synthase). Obie cząsteczki wiąże się z indukowaniem i przebiegiem apoptozy w różnych typach komórek [10, 11]. Również w obrębie tyreocytów mogą one odgrywać istotną rolę, poprzez aktywację kaspaz 3, 7 i 10 oraz cząsteczki Bid. Uwrażliwianie tyreocytów na zależną od Fas apoptozę pod wpływem cytokin prozapalnych IFN- i IL- lub TNF potwierdziły także badania in vivo, na mysim modelu zapalenia tarczycy [28]. Zaobserwowano wzmożony i przedłużony w czasie naciek limfocytów oraz nasiloną apoptozę komórek tarczycy. Efektów takich nie dało podawanie pojedynczo poszczególnych prozapalnych cząsteczek. Innym czynnikiem, który wymienia się jako mogący mieć wpływ na ekspresję cząsteczek Fas/FasL na powierzchni tyreocytów jest hormon tyreotropowy TSH (ang. thyroid stimulating hormone). Pewne wyniki wskazują, że pod wpływem stymulującego wzrost tyreocytów TSH, dochodzi do zmniejszenia ekspresji cząsteczki Fas na ich powierzchni, jak też do hamowania procesów apoptozy. Podobny wpływ wydaje się mieć, charakterystyczne raczej dla choroby Gravesa-Basedowa, przeciwciało stymulujące tarczycę TSAb (ang. thyroid stimulating antibody). Inne przeciwciało TSBAb (ang. thyroid stimulation blocking antibody), blokujące stymulację receptora dla TSH, nie wykazuje takiego działania, zapobiegając jednocześnie skutkom podania zarówno TSAb, jak i TSH. Wpływ hormonu tyreotropowego oraz przeciwciał na stężenie Fas odbywa się prawdopodobnie za pośrednictwem wewnątrzkomórkowego camp [20]. Istnieją też doniesienia o znaczeniu hormonów tarczycy T 3 i T 4. Mają one wpływ na apoptozę limfocytów T. Komórki te, hodowane in vitro w obecności hormonów, wykazywały większą skłonność do apoptozy, przy jednocześnie stwierdzonym zmniejszeniu ekspresji wewnątrzkomórkowego białka antyapoptotycznego Bcl-2 [25]. Hormony tarczycy T 3 i T 4, wydają się oddziaływać również na stężenie sfas. Ochronna rola sfas rozpuszczalnej formy receptora dla FasL, została już omówiona. Zaobserwowano występowanie dodatniej korelacji pomiędzy stężeniem hormonów tarczycy, a tym rozpuszczalnym białkiem, niezależnie od jednostki chorobowej tarczycy [15]. W warunkach in vitro stężenie jodu również miało wpływ na intensywność procesów apoptozy. Przy niskiej koncentracji było to działanie hamujące, podczas gdy przy wysokiej, jod indukował Fas zależną śmierć tyreocytów [14]. Przebieg kliniczny zapalenia tarczycy typu Hashimoto, może wiązać się z progresją od postaci subklinicznej do jawnej niedoczynności, co odpowiada postępującym procesom włóknienia i zaniku gruczołu. Tymczasem u innych chorych procesy te nie są nasilone, może też następować powrót do prawidłowej czynności gruczołu (eutyreoza). Podejmowane są próby wyjaśnienia tych różnic, a częściową odpowiedź mogą dać badania prowadzone na modelu zwierzęcym mysim modelu eksperymentalnego ziarniniakowatego zapalenia tarczycy G-EAT (ang. granulomatous experimental autoimmune thyroiditis). Ostateczny efekt wydaje się zależeć od równowagi między apoptozą i proliferacją tyreocytów oraz miofibryli napływających podczas procesu zapalnego. Procesy apoptozy i proliferacji w obu tych populacjach komórek wydają się być odwrotnie regulowane i jednocześnie istotne dla ostatecznego efektu. Kolejną kwestią jest odpowiedź na pytanie, jakie czynniki regulują te procesy. Podejrzewa się wpływ TGF-, jako czynnika sprzyjającego włóknieniu, a także IFN- oraz innych cytokin [7]. ROLA TRAIL W PATOGENEZIE CHOROBY HASHIMOTO Inną cząsteczką, o której również należałoby wspomnieć rozważając przebieg i ostateczny efekt procesów toczących się wewnątrz tarczycy, jest białko TRAIL związany z TNF ligand indukujący apoptozę (ang. TNF-related apoptosis-in-

Rola procesu apoptozy w etiopatogenezie autoimmunologicznego zapalenia tarczycy 91 ducing ligand). TRAIL, podobnie jak FasL, jest cząsteczką należącą do nadrodziny białek TNF, zdolną do zainicjowania apoptozy po związaniu z receptorem DR4 lub DR5.Występowanie tych receptorów można wykazać na powierzchni tyreocytów, a ekspresja ich dodatkowo wzrasta pod wpływem pewnych prozapalnych cytokin. Jednocześnie nawet prawidłowe komórki tarczycy mają na swojej powierzchni białko TRAIL, przy czym inkubacja w środowisku IFN- oraz TNF lub IL- zwiększa jego ilość. Limfocyty, w tym te naciekające tarczycę chorych na zapalenie, w odpowiednich warunkach, mogą zarówno indukować apoptozę zależną od TRAIL, jak i paść ofiarą tego procesu [6]. Na podstawie tych informacji zaproponowano trzy hipotezy o roli TRAIL w przebiegu zapalenia tarczycy, w tym zapalenia typu Hashimoto: limfocyty wykazujące ekspresję TRAIL biorą udział w niszczeniu tyreocytów, TRAIL na powierzchni komórek pęcherzykowych może działać ochronnie, niszcząc napływające limfocyty, jednoczesna ekspresja TRAIL i jego receptorów na tyreocytach, spowoduje ich samobójcze i bratobójcze niszczenie (najmniej prawdopodobna ze względu na odmienną regulację ekspresji receptorów śmierci i ligandów) [5]. Stwierdzenie, która z hipotez najlepiej opisuje procesy toczące się w gruczole tarczowym, wymaga dalszych badań. Pewne rezultaty, otrzymane na mysim modelu G-EAT, wskazują raczej na drugą możliwość [13]. Okazało się, że TRAIL w przebiegu zapalenia może pełnić rolę inhibitora procesów autoimmunologicznych, sprzyjając ich wygasaniu i zapobiegając procesom włóknienia tarczycy. Nie jest znany dokładny mechanizm tego działania, zaobserwowano jednak, że u myszy, które poddano neutralizacji endogennego TRAIL wzrosła zawartość prozapalnych cytokin przy zmniejszeniu cząsteczek przeciwzapalnych. Zwiększeniu uległ m.in. TGF-, znany jako czynnik sprzyjający włóknieniu. Podobnie zmianie uległ wzór ekspresji pro- i antyapoptotycznych cząsteczek wzrosła ilość białek FasL oraz cząsteczek antyapoptotycznych FLIP i Bcl-x L na komórkach zapalnych w obrębie gruczołu tarczowego, przy ich zmniejszeniu w obrębie tyreocytów. To z kolei mogło doprowadzić do wzmożonej apoptozy komórek tarczycy, przy zmniejszeniu intensywności tego procesu wśród naciekających limfocytów. Tabela 1. Czynniki pro- i antyapoptotyczne Table 1. Pro- and antiapoptotic factors Markery proliferacji (czynniki antyapoptotyczne) Bcl-2 Bcl-x L Mcl-1 FLIP IAP, (w tym XIAP) sfas Markery apoptozy (czynniki proapoptotyczne) Fas FasL Bax Bak Bcl-x S Bad Bid Bim Smac/DIABLO Kaspazy Tabela 2. Czynniki wpływające na aktywność procesów apoptozy i proliferacji tyreocytów Table 2. Thyrocytes apoptosis and proliferation determining factors Proces Proliferacja TSH TSBAb TSAb Apoptoza IFN- + TNF- TSH IFN- + IL- TSAb TSBAb Niskie stężenie jodu Wysokie stężenie jodu FasL/CD 95L sfasl Fas/CD 95 FADD Prokaspaza 8 cflip Kaspaza 8 IAPs DISC Bid Aktywowana Bid Apoptoza Kaspaza 3 Apoptozom Prokaspaza 3 Cytochrom c Bcl-2 Bcl-x L Bax Bak Aktywacja Smac/DIABLO Prokaspaza 9 APAF-1 Ryc. 1. Przebieg apoptozy w chorobie Hashimoto Fig. 1. Apoptotic pathway in Hashimoto s thyroiditis

92 K. Łącka, A. Maciejewski PODSUMOWANIE Choroba Hashimoto jest jednostką wieloczynnikową, o złożonej etiopatogenezie. Jako jeden z mechanizmów biorących w niej udział zaproponowano apoptozę, w szczególności tę indukowaną wiązaniem ligandu FasL do receptora Fas. Apoptoza bowiem, mimo że jest zjawiskiem fizjologicznym, często, gdy wymknie się spod kontroli, staje się podłożem patologii, o czym już wielokrotnie przekonano się obserwując inne schorzenia. Przedstawione dotychczas badania potwierdziły, że w przebiegu chorób autoimmunologicznych tarczycy, w tym w chorobie Hashimoto, dochodzi do zmian ekspresji receptorów śmierci Fas i ich ligandów, na tyreocytach oraz wewnątrztarczycowych limfocytach. Wiemy też, że głównymi czynnikami, które decydują o tej ekspresji są prozapalne cytokiny, występujące w nadmiarze w tarczycy chorych na przewlekłe limfocytowe zapalenie. Regulacja apoptozy jest jednak dużo bardziej złożona, na jej nasilenie wpływa też występowanie tzw. wabikowych receptorów czy stężenie, zarówno pro-, jak też antyapoptotycznych czynników wewnątrzkomórkowych. Poza tym istnieją pewne nieścisłości pomiędzy rezultatami poszczególnych badań. Nie można też wykluczyć znaczenia innych szlaków aktywacji apoptozy, poza Fas-zależnym. Wszystko to sprawia, że o ile sama rola apoptozy w etiopatogenezie zapalenia typu Hashimoto, jako jednego z mechanizmów, wydaje się być potwierdzona, o tyle kwestią do wyjaśnienia pozostaje to, jak duża jest to rola oraz co ważne jak te procesy destrukcji kontrolować. Wiedza ta mogłaby stać się podstawą rozwoju nowych, przyczynowych sposobów leczenia chorób autoimmunologicznych. PIŚMIENNICTWO 1. Barnhart B.C., Alappat E.C., Peter M.E.: The CD95 type I/type II model. Semin. Immunol., 2003; 15, (3): 185-193. 2. Bona G., Defranco S., Chiocchetti A. i wsp.: Defective function of Fas in T cells from paediatric patients with autoimmune thyroid diseases. Clin. Exp. Immunol., 2003; 133, (3): 430-437. 3. Bossowski A., Czarnocka B., Stasiak-Barmuta A. i wsp.: Analiza ekspresji cząsteczek Fas, FasL oraz kaspazy 8 w tkance gruczołu tarczowego u młodych chorych z chorobami immunologicznymi i nieimmunologicznymi gruczołu tarczowego. Endokrynol. Pol., 2007; 58, (4): 303-312. 4. Bretz J.D., Arscott P.L., Myc A. i wsp.: Inflammatory cytokine regulation of Fas-mediated apoptosis in thyroid follicular cells. J. Biol. Chem., 1999; 274, (36): 25433-25438. 5. Bretz J.D., Baker J.R. Jr: Apoptosis and autoimmune thyroid disease: following a TRAIL to thyroid destruction? Clin. Endocrinol., (Oxf), 2001; 55, (1): 1-11. 6. Bretz J.D., Rymaszewski M., Arscott P.L. i wsp.: TRAIL death pathway expression and induction in thyroid follicular cells. J. Biol. Chem., 1999; 274, (33): 23627-23632. 7. Chen K., Wei Y., Sharp G.C. i wsp.: Balance of proliferation and cell death between thyrocytes and myofibroblasts regulates thyroid fibrosis in granulomatous experimental autoimmune thyroiditis, (G-EAT). J. Leukoc. Biol., 2005; 77, (2): 166-172. 8. Chen S., Fazle Akbar S.M., Zhen Z. i wsp.: Analysis of the expression of Fas, FasL and Bcl-2 in the pathogenesis of autoimmune thyroid disorders. Cell. Mol. Immunol., 2004; 1, (3): 224-228. 9. Chistiakov D.A.: Immunogenetics of Hashimoto s thyroiditis. J. Autoimmune Dis., 2005, 2, (1): 1-21. 10. Choi B.M., Pae H.O., Jang S.I. i wsp.: Nitric oxide as a pro-apoptotic as well as anti-apoptotic modulator. J. Biochem. Mol. Biol., 2002; 35, (1): 116-126. 11. Choi W.S., Eom D.S., Han B.S. i wsp.: Phosphorylation of p38 MAPK induced by oxidative stress is linked to activation of both caspase-8- and -9-mediated apoptotic pathways in dopaminergic neurons. J. Biol. Chem., 2004; 279, 20451-20460. 12. Demirbilek H., Kandemir N., Gonc E.N. i wsp.: Assessment of thyroid function during the long course of Hashimoto s thyroiditis in children and adolescents. Clin. Endocrinol., (Oxf), 2009; 71, 451-454. 13. Fang Y., Sharp G.C., Yagita H. i wsp.: A critical role for TRAIL in resolution of granulomatous experimental autoimmune thyroiditis. J. Pathol., 2008; 216, (4): 505-513. 14. Feldkamp J., Pascher E., PerniokA. i wsp.: Fas-Mediated apoptosis is inhibited by TSH and iodine in moderate concentrations in primary human thyrocytes in vitro. Horm. Metab. Res., 1999; 31, (6): 355-358. 15. Feldkamp J., Pascher E., Schott M. i wsp.: Soluble Fas is increased in hyperthyroidism independent of the underlying thyroid disease. J. Clin. Endocrinol. Metab., 2001, 86, (9): 4250-4253. 16. Fountoulakis S., Vartholomatos G., Kolaitis N.: Differential expression of Fas system apoptotic molecules in peripheral lymphocytes from patients with Graves' disease and Hashimoto s thyroiditis. Eur. J. Endocrinol., 2008; 158, (6): 853-859. 17. Giordano C., Richiusa P., Bagnasco M. i wsp.: Differential regulation of Fas-mediated apoptosis in both thyrocyte and lymphocyte cellular compartments correlates with opposite phenotypic manifestations of autoimmune thyroid disease. Thyroid, 2001; 11, (3): 233-244. 18. Hashimoto H.: Zur Kenntniss der lymphomatösen Veränderung der Schilddrüse, (Struma lymphomatosa). Arch. Klin. Chir., 1912, 97, 219-248. 19. Hengartner M.O.: The biochemistry of apoptosis. Nature, 2000; 407, 770-776. 20. Kawakami A., Eguchi N., Matsuoka N. i wsp.: Modulation of Fas mediated apoptosis of human thyroid epithelial cells by IgG from patients with Graves' disease, (GD) and idiopathic myxoedema. Clin. Exp. Immunol., 1997, 110, 434-439. 21. Kerr J.F., Wyllie A.H., Currie A.R.: Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. Br. J. Cancer, 1972; 26, (4): 239-257. 22. Łącka K., Maciejewski M., Współczesne poglądy na temat etiopatogenezy autoimmunologicznego zapalenia tarczycy, (choroby Hashimoto). Pol. Merk. Lek., 2011; 30, (176): 132-138. 23. Maruoka H., Watanabe M., Matsuzuka F. i wsp.: Increased intensities of fas expression on peripheral T-cell subsets in severe autoimmune thyroid disease. Thyroid, 2004, 14, (6): 417-423. 24. Mezosi E., Wang S.H., Utsugi S. i wsp.: Induction and regulation of Fasmediated apoptosis in human thyroid epithelial cells. Mol. Endocrinol., 2005; 19, (3): 804-811. 25. Mihara S., Suzuki N., Wakisaka S. i wsp.: Effects of thyroid hormones on apoptotic cell death of human lymphocytes. J. Clin. Endocrinol. Metab., 1999; 84, (4): 1378-1385. 26. Nagata S.: Fas ligand-induced apoptosis. Ann. Rev. Genet.,1999, 33, 29-55. 27. Stassi G., Zeuner A., Di Liberto D. i wsp.: Fas/FasL in Hashimoto s thyroiditis. J. Clin. Immunol., 2001; 21, 19-23. 28. Wang S.H., Bretz J.D., Phelps E. i wsp.: A unique combination of inflammatory cytokines enhances apoptosis of thyroid follicular cells and transforms nondestructive to destructive thyroiditis in experimental autoimmune thyroiditis. J. Immunol., 2002; 168, 2470-2474. 29. Wang S.H., Van Antwerp M., Kuick R. i wsp.: Microarray analysis of cytokine activation of apoptosis pathways in the thyroid. Endocrinology, 2007; 148, (10): 4844-4852. Adres do koresponedncji: prof. dr hab. med. Katarzyna Łącka, Uniwersytet Medyczny im. K. Marcinkowskiego w Poznaniu, Katedra Endokrynologii, Przemiany Materii i Chorób Wewnętrznych, ul. Przybyszewskiego 49, 60-55 Poznań, e-mail: K_Lacka@wp.pl