WPŁYW PODSTAWNIKÓW POLIETEROWYCH NA AKTYWNOŚĆ BIOLOGICZNĄ KURKUMINY

UNIWERSYTET WARSZAWSKI WYDZIAŁ CHEMII Tomasz Deptuła WPŁYW PODSTAWNIKÓW POLIETEROWYCH NA AKTYWNOŚĆ BIOLOGICZNĄ KURKUMINY Rozprawa doktorska napisana pod kierunkiem dr hab. Beaty Gruber prof. dr hab. Adama Krówczyńskiego Warszawa 2016

Serdecznie dziękuję moim promotorom; Pani dr hab. Beacie Gruber i Panu Profesorowi dr hab. Adamowi Krówczyńskiemu za cenne wskazówki, naukową inspirację, możliwość wykonywania pod ich okiem badań laboratoryjnych oraz wsparcie merytoryczne podczas pisania niniejszej rozprawy. Dziękuję Pani Prof. dr hab. Ewie Góreckiej za możliwość konsultacji podczas pisania pracy doktorskiej Pragnę wyrazić wdzięczność Pani dr. Irenie Bubko za podzielenie się swoim ogromnym doświadczeniem w pracy z hodowlami komórkowymi. Dziękuję wszystkim pracownikom, doktorantom i studentom Pracowni Fizykochemii Dielektryków i Magnetyków Wydziału Chemii UW oraz Zakładu Biochemii i Biofarmaceutyków Narodowego Instytutu Leków za życzliwość, która spotykała mnie na każdym kroku i wszelką pomoc. Dziękuję za wsparcie moim najbliższym Mamie, siostrze Sylwii, szwagrowi Zbyszkowi oraz Kamilowi Lisieckiemu i moim Przyjaciołom z Fundacji PRZYSZŁOŚĆ W NAUCE. 2

SPIS TREŚCI 1. Cel pracy... 5 2. Wstęp... 6 2.1. Przeciwnowotworowe właściwości kurkuminy... 7 2.2. Kurkumina a chemoprewencja... 15 2.3. Wady kurkuminy... 17 2.4. Synteza pochodnych kurkuminy... 18 2.4.1. Syntetyczne pochodne kurkuminy... 18 2.4.2. Modyfikacje łańcucha łączącego pierścienie aromatyczne... 19 2.4.3. Wprowadzanie podstawników do pierścieni aromatycznych... 23 2.4.4. Tworzenie kompleksów kurkuminy i jej analogów z jonami metali... 26 2.5. Ciekłe kryształy... 27 3. Materiały i metody... 30 3.1. Synteza organiczna... 30 3.1.1. Synteza analogów benzaldehydu... 30 3.1.2. Synteza formylowego analogu eteru koronowego... 30 3.1.3. Synteza analogów A oraz B kurkuminy... 30 3.1.4. Synteza pirazolowych analogów kurkuminy (analogi B )... 31 3.1.5. Synteza 1 metylopirazolowych analogów kurkuminy (analogi B )... 31 3.1.6. Synteza izoksazolowych analogów kurkuminy (analogi B )... 31 3.1.7. Widma NMR... 32 3.2. Badanie aktywności biologicznej pochodnych kurkuminy... 32 3.2.1. Badane związki... 32 3.2.2. Hodowle komórkowe... 32 3.2.3. Ocena żywotności komórek... 32 3.2.4. Ocena morfologiczna komórek... 33 3.2.5. Badanie poziomu białek... 33 3.3. Badanie właściwości ciekłokrystalicznych otrzymanych związków... 35 3.3.1. Mikroskopia polaryzacyjna... 35 3.3.2. Skaningowa kalorymetria różnicowa... 35 4. Wyniki... 36 4.1. Synteza analogów A kurkuminy... 36 4.2. Badanie aktywności biologicznej analogów kurkuminy... 39 3

4.2.1. Ocena żywotności komórek... 39 4.2.2. Badanie apoptozy... 44 4.3. Badanie właściwości ciekłokrystalicznych analogów kurkuminy (analogi B kurkuminy)... 52 4.3.1. Synteza ciekłokrystalicznych analogów kurkuminy (analogi B kurkuminy)... 52 4.3.2. Widma NMR i analiza elementarna analogów B... 54 4.3.3.Właściwości ciekłokrystaliczne analogów kurkuminy (analogi B )... 55 5. Dyskusja... 61 6. Wnioski... 67 7. Bibliografia... 68 Abstract... 83 4

1. Cel pracy Kurkumina jest związkiem wykazującym niezwykle szerokie spektrum działania na poziomie komórki i w obrębie całego organizmu. Najbardziej znane i udokumentowane jest jej działanie przeciwzapalne, przeciwutleniające i przeciwnowotworowe (w rozumieniu hamowania przerzutów i angiogenezy). Szereg prac poświęcono również jej działaniu chemoprewencyjnemu i antyproliferacyjnemu. Chemoprewencję definiuje się jako świadome stosowanie naturalnych bądź syntetycznych związków chemicznych o aktywności biologicznej skierowanej na zapobieganie chorobom nowotworowym. Związki o takiej aktywności wykazują znikomą toksyczność i brak efektów niepożądanych. Większość z nich to substancje pochodzenia roślinnego. Kurkumina wykazuje jednocześnie działanie hamujące etap inicjacji transformacji nowotworowej, jak i działanie antyproliferacyjne na etapie promocji i progresji nowotworu. Wśród wad kurkuminy, które utrudniają jej wykorzystanie w terapii należy wymienić słabą rozpuszczalność w wodzie, a co za tym idzie niską biodostępność oraz szybki metabolizm w organizmie. Zasadniczym celem pracy było otrzymanie rozpuszczalnych w wodzie analogów kurkuminy z hydrofilowymi podstawnikami polieterowymi (grupa analogów A kurkuminy) oraz zbadanie otrzymanych związków pod kątem aktywności cytotoksycznej względem komórek nowotworowych i prawidłowych, a także pod kątem występowania apoptozy i obecności białek pro- i antyapoptotycznych. Wydaje się możliwe, że otrzymane analogi znajdą zastosowanie jako leki przeciwnowotworowe skuteczne, a zarazem nietoksyczne dla organizmu, łatwo przyswajalne oraz wolno metabolizowane. Kurkumina jest -diketonem występującym praktycznie wyłącznie w cyklicznej formie enolowej stabilizowanej przez wiązanie wodorowe. Stanowi układ trzech pierścieni połączonych ugrupowaniami etylenowymi. Ze względu na jej dużą anizotropię geometryczną można oczekiwać, że odpowiednio podstawione analogi kurkuminy (grupa otrzymanych analogów B kurkuminy) będą wykazywały właściwości ciekłokrystaliczne. Innym celem mojej pracy była więc synteza innych już nie hydrofilowych analogów kurkuminy o potencjalnych właściwościach mezogenicznych. Część pracy dotycząca syntezy oraz badań fizykochemicznych potencjalnych mezogenów została wykonana w Pracowni Fizykochemii Dielektryków i Magnetyków na Wydziale Chemii Uniwersytetu Warszawskiego. Badania biologiczne hydrofilowych analogów kurkuminy zostały wykonane w Zakładzie Biochemii i Biofarmaceutyków Narodowego Instytutu Leków. 5

2. Wstęp Kurkumina to żółty barwnik wyizolowany z korzenia ostryżu długiego Curcuma longa, ale występuje też w innych gatunkach tej rośliny [1]. Prawdopodobnym powodem, dla którego ostryż syntetyzuje kurkuminę jest ochrona przed grzybami, z uwagi na grzybobójcze właściwości związków zawartych w korzeniu [2]. Kurkuminę w postaci popularnej przyprawy curry spożywa około 1/4 populacji na świecie [3]. W samych tylko Indiach roczna jej produkcja sięga 500 000 ton, z czego połowa jest eksportowana [4]. Od wieków kurkumina była używana w tradycyjnej medycynie Dalekiego Wschodu. Osiągnięcia tej medycyny próbuje wykorzystywać medycyna współczesna, która coraz częściej sięga po substancje pochodzenia naturalnego, stosowane w medycynie ludowej. Jeśli chodzi, np. o leki przeciwnowotworowe, obecnie ok. 70 % zatwierdzonych przez Agencję ds. Żywności i Leków w USA (z ang. Food and Drug Administration) to produkty naśladujące związki występujące w roślinach [5]. Pierwszej syntezy chemicznej kurkuminy dokonał w 1913 roku polski chemik pracujący na Uniwersytecie Jagiellońskim prof. Wiktor Lampe [6, 7a, 7b, 7c]. Liczne badania naukowe wskazują, że kurkumina może mieć zastosowanie zarówno w terapii przeciwnowotworowej, jak i chemoprewencji. To właśnie właściwości przeciwnowotworowe kurkuminy są obecnie najszerzej badane. Stwierdzono, że może ona wpływać hamująco na rozwój nowotworu, m.in. poprzez: indukcję apoptozy w komórkach nowotworowych i inhibicję metastaz. W literaturze można znaleźć doniesienia o uwrażliwianiu komórek nowotworowych przez ten związek na chemio- i radioterapię [4, 8-11]. Spośród znanych właściwości kurkuminy, które stanowią podstawę jej potencjalnego zastosowania w leczeniu nowotworów, ale także innych schorzeń należy wymienić: działanie przeciwzapalne (chemoprewencja i terapia nowotworów, leczenie choroby Leśniewskiego-Crohna, wspomaganie gojenia się ran) [6, 12-16], właściwości przeciwutleniające (chemoprewencja i terapia nowotworów, opóźnianie procesów starzenia) [4, 6, 16-18], działanie immunosupresyjne poprzez hamowanie proliferacji limfocytów oraz blokowanie wytwarzania przez nie cytokin prozapalnych (leczenie chorób autoimmunizacyjnych oraz alergii) [13, 16, 19], działanie antymutagenne (ochrona organizmu, np. przed mutagennymi aminami występującymi w pożywieniu) [20], 6

działanie neuroprotekcyjne, (indukowanie powstawania chaperonin, które zapobiegają powstaniu źle sfałdowanych białek i ich agregacji, leczenie chorób Alzheimera i Parkinsona, zabezpieczanie przed utratą pamięci, zwłaszcza związaną z wiekiem) [5, 17, 21-23], zdolność solwatowania metali (ochrona przed toksycznymi metalami) [5, 17, 22-24], aktywność przeciwpierwotniakowa (leczenie chorób wywoływanych przez pierwotniaki z rodzajów Trypanosoma, Leishmania oraz Plasmodium, takich jak np. śpiączka afrykańska, czy malaria, przy czym docelowa molekuła, na którą oddziaływują kurkumina i jej pochodne w celu wywołania efektu terapeutycznego nie jest znana) [25, 26], ułatwianie erekcji dzięki indukowaniu hemooksygenazy 1 (leczenie niepłodności) [27], ochrona neuronów dopaminergicznych (leki antydepresyjne) [28, 29], obniżanie poziomu cholesterolu [30], obniżenie poziomu lipidów we krwi [15], ochrona limfocytów przed infekcją wirusem HIV [31], zapobieganie tworzenia adduktów benzopirenu do DNA [32], zapobieganie powstawaniu katarakty [15]. Dodatkowym atutem kurkuminy jako związku o potencjalnym znaczeniu w medycynie jest jej nietoksyczność [13, 24, 25, 33]. 2.1. Przeciwnowotworowe właściwości kurkuminy Obecnie znanych jest ponad 100 typów nowotworów [4]. Wykazano, że ich występowanie może wiązać się z zaburzeniami ekspresji nawet kilkuset różnych genów [35]. Kurkumina moduluje ekspresję genów wpływając aktywująco na 71 z nich, a wyciszająco na 81 [33]. Potwierdzona badaniami wrażliwość poszczególnych nowotworowych linii komórkowych na kurkuminę stwarza nadzieję na jej zastosowanie w terapii, m.in.: białaczek, raka żołądka, nowotworów układu moczowo-płciowego, raka płuc, raka jajnika, nowotworów głowy i szyi, wątroby, czerniaka, nowotworów układu nerwowego i mięśni, jest uzasadnieniem dla prowadzenia dalszych badań w tym zakresie zarówno in vitro, in vivo, jak i badań klinicznych [5,6, 36, 37]. Jedną z właściwości kurkuminy decydujących o jej działaniu przeciwnowotworowym jest zdolność indukowania apoptozy, preferencyjnie w komórkach nowotworowych [38]. Mechanizm wyjaśniający specyficzność działania kurkuminy w tym względzie nie został jednak wyjaśniony [38]. 7

Apoptoza to śmierć programowana, zewnątrz- lub wewnątrzpochodna (tj. zachodząca z udziałem receptorów błonowych lub mitochondriów, odpowiednio), w wyniku której nie powstaje stan zapalny niekorzystnie wpływający na sąsiednie komórki, tak jak w przypadku nekrozy. Procesy apoptotyczne wymagają syntezy ATP. Apoptogenność jest jednym z czynników cytotoksycznych pożądanych w zakresach mechanizmów działania leków przeciwnowotworowych. Kurkumina należy do polifenoli roślinnych. W cząsteczce jest też obecny układ dwuketonowy. Taki układ umożliwia związkowi tworzenie kompleksów z jonami metali. Dodatkowo, w procesie enolizacji powstaje dodatkowa grupa hydroksylowa, która tworząc wewnątrzcząsteczkowe wiązanie wodorowe z tlenem karbonylowym stabilizuje postać enolową. Praktycznie w obrębie całej cząsteczki występuje układ sprzężonych wiązań podwójnych, co powoduje wystąpienie barwy związku. Kurkumina w buforze wykazuje maksimum fluorescencji przy 550 nm, w środowisku lipidowym maksimum fluorescencji pojawia się przy 498 nm [39]. Te właściwości umożliwiają dokładne zlokalizowanie kurkuminy w obrębie komórki. Kurkumina w komórce gromadzi się głównie w błonie komórkowej, choć w niektórych rodzajach komórek stwierdza się jej obecność także w obrębie jądra komórkowego [40]. W badaniach A. Kunwar i wsp. do obserwacji utrwalonych komórek pod kątem wewnątrzkomórkowej lokalizacji kurkuminy wykorzystano fluorescencyjne właściwości tego związku. Na podstawie obserwacji w mikroskopie fluorescencyjnym autorzy artykułu wykazali, że kurkumina kumuluje się głównie w błonie komórkowej w komórkach prawidłowych oraz w błonie i jądrze komórkowym w komórkach nowotworowych. Jednocześnie, pomiary intensywności fluorescencji kurkuminy wykazały większe wartości w komórkach nowotworowych niż prawidłowych, z czego wynika, że związek ten kumuluje się preferencyjnie w komórkach nowotworowych [40]. Podobnie, jak wiele innych związków chemicznych zaliczanych do antyoksydantów kurkumina w pewnych warunkach może wykazywać efekt prooksydacyjny. Jest to jeden z proponowanych mechanizmów indukowania przez kurkuminę apoptozy w komórkach nowotworowych [41, 42]. Innymi możliwymi mechanizmami oddziaływania kurkuminy na komórki nowotworowe są: oddziaływanie na czynniki transkrypcyjne, jak NF- κb, czy P53, oddziaływanie na mitochondria, z jednoczesnym uwolnieniem cytochromu c i aktywacją kaspaz 3 i 8, jak również wpływ na poziom białek proapoptotycznych. Indukcja apoptozy przez kurkuminę, oparta na generowaniu wolnych rodników może mieć związek z metabolizmem energetycznym komórek nowotworowych. 8

Energia komórkowa w rozumieniu ATP pochodzi z procesów fosforylacji substratowej i oksydacyjnej. Fosforylacja substratowa nie wymaga udziału tlenu i zachodzi, np. w glikolizie i cyklu Krebsa. Fosforylacja oksydacyjna do syntezy ATP wykorzystuje energię głównie generowaną w mitochondrialnym łańcuchu oddechowym. W trakcie cyklu komórkowego następuje wzrost intensywności glikolizy i ograniczenie procesów fosforylacji oksydacyjnej zachodzących w mitochondriach. Regulację względnej aktywności tych procesów stwierdzono zarówno w komórkach drożdży, jak i ludzkich. W komórkach stymulowanych do proliferacji równocześnie z początkiem syntezy DNA (faza S) wzrasta poziom ekspresji genów odpowiedzialnych za indukcję glikolizy i zaczynają rozwijać się mitochondria. W tej fazie też syntetyzowane są kluczowe białka [43]. Komórki nowotworowe mogą wykazywać metabolizm oparty na glikolizie lub fosforylacji oksydacyjnej [43]. Za wzajemną przewagę procesów glikolizy i fosforylacji oksydacyjnej w komórkach nowotworowych odpowiadają mutacje w onkogenach c-myc i AKT i w genie supresorowym P53. Podwyższona ekspresja onkogenu AKT indukuje glikolizę, która kompensuje procesy energetyczne w komórkach niedotlenionych, czy zawierających defekty w oddychaniu mitochondrialnym [43]. Na pewnym etapie nowotworzenia komórki rosną w środowisku ubogim w tlen. Skutkiem tego jest stabilizacja czynnika transkrypcyjnego indukowanego niedotlenieniem - HIF1. Poza wpływem na GLUT1 i biogenezę mitochondriów ostatnio wykazano, że HIF1α współdziała z onkogenem c-myc w aktywowaniu ekspresji kinazy dehydrogenazy pirogronianu 1 (PDK1) i heksokinazy II (HK-II), co stanowi o przewadze procesów glikolizy nad fosforylacją oksydacyjną [43]. Gen P53 także ma swój udział w kształtowaniu fenotypu glikolitycznego w komórkach nowotworowych. Nadekspresja zmutowanego genu P53 zwiększa pobór glukozy przez komórki. Białko P53 indukuje ekspresję genu TIGAR indukowanego TP53 regulatora glikolizy i apoptozy i obniża ekspresję genu GLUT1, będącego transporterem glukozy. Konsekwentnie, mutacja w P53 prowadząca do utraty funkcji białka powoduje obniżenie ekspresji TIGAR i podwyższenie ekspresji GLUT1, co przekierowuje komórki na szlaki glikolizy. Białko P53, poza tym, reguluje procesy oddychania mitochondrialnego aktywując SCO2 czynnik związany z funkcjonowaniem kompleksu oksydazy cytochromowej. Utrata funkcji przez P53 lub SCO2 powoduje ograniczenie oddychania mitochondrialnego i zapewnia przewagę glikolizy [43]. 9

Zmiany metabolizmu komórek nowotworowych mogą być spowodowane nie tylko wzmożoną proliferacją oraz obniżonym poziomem tlenu w miejscu powstawania nowotworu. Mogą też być związane z mutacjami w genach kodujących białka odpowiedzialne za oddychanie mitochondrialne. Upośledzone funkcjonowanie łańcucha oddechowego skutkuje zwiększeniem produkcji wolnych rodników [43]. Metabolizm komórek nowotworowych determinuje ich odpowiedź na terapię przeciwnowotworową. W komórkach, w których na skutek upośledzonych procesów mitochondrialnego oddychania i fosforylacji oksydacyjnej powstaje zwiększona ilość wolnych rodników, leki cytotoksyczne, w ogromnej części działające poprzez wytwarzanie wolnych rodników będą wspomagały dodatkowo wewnątrzkomórkowe tworzenie reaktywnych postaci tlenu, skutecznie prowadząc pośrednio przez apoptozę lub bezpośrednio do śmierci komórek. Potencjalnym lekiem z tej grupy może stać się, z uwagi na swoje właściwości, kurkumina. Z kolei, komórki z zachwianą równowagą w produkowaniu energii w kierunku glikolizy i fosforylacji substratowej nie wspomagają działania leków generujących wolne rodniki, ale wrażliwe są na związki aktywujące inne procesy i zjawiska, jak alkilacja DNA skutkująca indukcją nekrozy [43]. W wielu liniach komórek nowotworowych stwierdza się podwyższoną ilość białka antyapoptotycznego BCL-2 [44]. Obecność białka BCL-2 uniemożliwia skierowanie komórek na drogę apoptozy [44, 45]. Białko BCL-2 jest białkiem błonowym zakotwiczonym w błonie swoją C-końcową domeną. Występuje w zewnętrznej błonie mitochondrialnej, a także w siateczce wewnątrzplazmatycznej i błonie jądrowej [46]. Białko BCL-2 tworzy dimer z białkiem proapoptotycznym BAX, co uniemożliwia jego udział w procesach apoptotycznych [44, 47, 48]. Fosforylacja seryny w BCL-2 znosi zdolności wiązania BAX. To białko w swojej proapoptotycznej funkcji depolaryzuje błonę mitochondrialną ułatwiając wydostanie się z mitochondriów cytochromu c, który indukuje tworzenie się kaskady białek apoptotycznych [47, 49]. Kurkumina ma zdolność aktywowania białka BAX [33]. Potwierdzeniem tych właściwości było wykazanie, że komórki nieposiadające BAX są niewrażliwe na apoptozę wywoływaną przez kurkuminę [50]. Jednocześnie, Kuo i wsp. stwierdzili spadek poziomu białka BCL-2 do 30 % po 6 godz. w komórkach eksponowanych na kurkuminę i dalej, do 20 % po 12 godz. [45]. Podobne wyniki uzyskał Balasurbamanian [51]. Kurkumina, jak wykazano, indukuje apoptozę zależną od białka P53 [52]. Na przykładzie ludzkich komórek raka piersi MCF-7 stwierdzono, że związek zwiększa ekspresję genu tego białka, co skutkuje wzrostem ekspresji białka BAX i nasileniem apoptozy [52]. 10

Proapoptotyczne działanie BAX wymaga aktywnej fosforylacji oksydacyjnej. Badania z użyciem komórek drożdży, ale także komórek ssaczych wykazały, że genem, który odpowiada za niewrażliwość komórek na to białko jest gen kodujący jedną z podjednostek syntazy ATP [43]. Kolejnym istotnym białkiem regulującym apoptozę jest antyapoptotyczna surwiwina, której obecność jest stwierdzana tylko w komórkach dzielących się [53]. Surwiwina ma zdolność blokowania aktywności kaspazy 3 i 7 wiążąc się z ich aktywnymi formami i hamując aktywację prokaspaz [49,54-56]. Podwyższoną ekspresję surwiwiny notuje się w komórkach nowotworowych [49]. Badania wykazały, że surwiwina trzykrotnie obniża zdolność BAX do indukcji apoptozy, jednak nie wpływa na jego ekspresję [49]. W swoim proproliferacyjnym działaniu surwiwina łączy się z wrzecionem podziałowym, swoim C-końcem wiąże się z mikrotubulami i reguluje rozdzielenie chromosomów i cytokinezę [53, 57]. Poziom surwiwiny zależy od fazy cyklu komórkowego, jego maksimum przypada na fazę G2, w której zachodzi intensywna synteza DNA. Uważa się, że obecność surwiwiny w fazie G2 może zaburzać regulację podziałów komórkowych i przyczyniać się do niekontrolowanej proliferacji [54]. Jest to efekt przeciwstawny do działania kurkuminy, która hamuje komórki na granicy faz G2 i fazy M czasie podziału mitotycznego i początku cytokinezy [11, 51]. Komórki zahamowane na granicy G2 i M umierają w wyniku katastrofy mitotycznej, procesu równie pożądanego z punktu widzenia działania przeciwnowotworowego, jak apoptoza [58]. Jak dotąd jednak, nie wykazano bezpośredniego ani pośredniego wpływu kurkuminy na ekspresję surwiwiny [59]. Kurkumina generuje apoptozę komórkospecyficznie (obserwowane są różnice w działaniu na komórki zdrowe i nowotworowe). Jiang i wsp. stwierdzili, że kurkumina może wywoływać apoptozę w komórkach nowotworowych, ale nie działa na prawidłowe, nieunieśmiertelnione mysie fibroblasty [60]. Niektóre badania wskazują, że związek ten pojedynczo nie jest silnym apoptogenem, jak np. w przypadku ludzkich komórek raka trzustki P-34, w których kurkumina w stężeniu 10 moli indukowała apoptozę zaledwie w 4 % komórek. Po zastosowaniu w stężeniu 10 M z inhibitorem COX-2, celekoksybem, 25 M indukowała natomiast apoptozę w 23 % komórek badanej linii wykazując, tym samym addytywność działania (celokoksyb samodzielnie indukował apoptozę w stężeniu 25 M w zbliżonym do kurkuminy zakresie, tj. w 4-12 % komórek) [61]. Jak wykazano, kurkumina zależnie od dawki indukuje fragmentację DNA w toku apoptozy i również dawkozależnie wywołuje w komórkach nekrozę. Kuo i wsp. wykazali, że 11

w ludzkich komórkach białaczki HL-60 dawka kurkuminy 5 g/ml indukuje apoptozę, natomiast 14 g/ml indukuje nekrozę [45]. Sikora i wsp. w badaniach prowadzonych na linii komórek ludzkiej białaczki limfocytarnej Jurkat stwierdzili brak fragmentacji DNA charakterystycznej dla apoptozy [62]. Autorzy sugerują, że w komórkach pod wpływem kurkuminy może zachodzić tak zwana nekroptoza. Jest to rodzaj śmierci komórkowej pośredni między apoptozą i nekrozą, czyli tzw. programowana nekroza. W procesie nekroptozy nie uczestniczą kaspazy, a kluczową rolę odgrywa kinaza RIP oddziaływująca z receptorem FAS [63]. Z opisanych eksperymentów Kuo i Sikory wynika, że rodzaj śmierci wywoływanej przez kurkuminę zależy od rodzaju komórek i stężenia kurkuminy. Niezwykle istotną cechą kurkuminy, mającą liczne konsekwencje dla komórki (w tym indukcję apoptozy) jest hamowanie aktywacji czynnika transkrypcyjnego NF- B. Czynnik ten należy do rodziny czynników transkrypcyjnych Rel, które regulują odpowiedź immunologiczną i powstawanie stanu zapalnego. U ssaków do tej rodziny należą białka RelA/p65, c-rel, RelB, p50(nf- B1) i p52(nf- B2). NF- B znajduje się w cytoplazmie komórek w postaci nieaktywnego kompleksu dimeru zawierającego kombinacje polipeptydów z rodziny Rel z inhibitorowym białkiem I B. Aktywacja białka NF-kB zachodzi pod wpływem cytokin prozapalnych, estrów forbolu, toksyn bakteryjnych, wirusów, promieniowania UV i różnych mitogenów. W większości przypadków następuje wówczas fosforylacja, ubikwitynacja i degradacja proteasomalna białka I B, które oddysocjowuje od dimeru, a ten przedostaje się do jądra komórkowego [64,65]. NF-kB reguluje ekspresję około 400 genów w tym, odpowiedzialnych za kodowanie białek antyapoptotycznych: BCL-2, BCL-X L i surwiwiny [35, 47, 66-68]. Dodatkowo, NF-kB aktywuje mitochondrialną dysmutazę ponadtlenkową, manganozależną [69]. Reguluje też ekspresję protoonkogenu c-myc, a także metaloproteinazy matriks oraz proangiogenów, takich jak IL-8 i VEGF [68]. Na przykładzie komórek mięśniowych stwierdzono, że NF- B jest inhibitorem różnicowania [64, 70]. Jak wykazali Choudhuri i wsp. oraz Amit i wsp. na skutek hamowania ekspresji przez kurkuminę czynnika NF- B wzrasta w komórkach MCF-7 ekspresja genu P53, co skutkuje wzrostem stężenia białka BAX i indukcją apoptozy [52, 70]. Z wpływem kurkuminy na NF- B wiąże się selektywne uwrażliwianie komórek nowotworowych na promieniowanie jonizujące [10, 36, 55]. Pod wpływem naświetlania promieniowaniem jonizującym w komórkach nowotworowych wzrasta aktywność NF- B, co 12

powoduje wzrost stężenia białek antyapoptotycznych oraz manganozależnej dysmutazy ponadtlenkowej, a w konsekwencji odporność nowotworu na radioterapię [65, 69]. Zahamowanie aktywacji wspomnianego czynnika uwrażliwia komórki na promieniowanie. Efekt ten można też wiązać z antywolnorodnikowym działaniem kurkuminy, ponieważ omawiany czynnik transkrypcyjny pod wpływem wolnych rodników ulega aktywacji i, m.in. indukuje enzymy ochrony przeciwutleniającej, jak wspomniana dysmutaza [71-74]. Zdrowe komórki natomiast kurkumina, jako zmiatacz wolnych rodników powstających w procesie radiolizy wody, chroni przed skutkami promieniowania [14, 75]. Wydaje się, że ten efekt jest niewystarczający, aby ochronić przed promieniowaniem komórki nowotworowe, które dodatkowo produkują znaczne ilości wolnych rodników na skutek zaburzeń metabolicznych i posiadają upośledzone systemy naprawy DNA [71, 76-78]. Z oddziaływania kurkuminy na NF- B wynika szereg innych skutków dla komórki, jak np. wpływ na cykl komórkowy. NF- B bowiem reguluje ekspresję cykliny D odpowiedzialnej za przejście komórki przez punkt kontrolny w fazie G1, tj. zakończenia cytokinezy i wzrostu oraz rozpoczęcie replikacji DNA w fazie S [43, 51, 64, 70]. Podwyższoną ekspresję cykliny D stwierdzono w wielu liniach ludzkich komórek nowotworowych, np. w komórkach raka sutka, wątroby, nerek, mięsaka i białaczkach [64, 79]. Poza wpływem na czynnik NF-kB, kurkumina hamuje też czynniki transkrypcyjne z rodziny AP-1, takie jak c-jun i c-fos, regulujące ekspresję genów związanych z proliferacją, apoptozą i nowotworzeniem [80, 81]. Ich aktywność jest warunkowana przez potencjał redoks komórki, podobnie, jak w przypadku P53 i AP-1 [77, 82, 83]. Badania in vitro wykazały, że w warunkach utleniających wyżej wymienione czynniki tracą zdolność wiązania się z DNA [83]. Kurkumina jako zmiatacz wolnych rodników lub prooksydant, może wpływać na potencjał oksydacyjno-redukcyjny komórki i pośrednio wpływać na czynniki transkrypcyjne. Istotna w kontekście przeciwnowotworowego działania kurkuminy jest jej zdolność do oddziaływania z białkami ABC, które są, m.in. odpowiedzialne za odporność wielolekową komórek nowotworowych. Białka te działają jako transportery usuwające cząsteczki ksenobiotyku poza komórkę kosztem energii zgromadzonej w ATP [84, 85]. Rodzina ABC obejmuje 7 klas białek o symbolach od A do G [86]. Do tej rodziny białek należą, m. in. białka P-gp (z ang. P-glycoprotein), MRP1 (z ang. Multidrug Resistance-associated Protein) i LRP (z ang. Lung Resistance-related protein). Białka te zawierają domenę wiążącą usuwaną substancję, domenę transbłonową i domenę wiążącą ATP [85]. 13

Komórki z podwyższoną ekspresją tych białek są mniej wrażliwe na chemioterapię [85]. Kurkumina wpływa hamująco na białka ABC. Efekt ten potwierdzono, m. in. w eksperymencie, w którym hodowano komórki ludzkiego raka piersi MCF-7 i MDA-MB w obecności mitomycyny C, leku hamującego replikację DNA, z dodatkiem lub bez kurkuminy. Stwierdzono, że obecność kurkuminy wspomaga działanie antyproliferacyjne mitomycyny C [84]. Podobny synergizm obserwowano w przypadku kurkuminy i doksorubicyny. Potwierdzają to badania prowadzone z użyciem komórek guza Ehrlicha EAC [87]. Chearware i wsp. wykazali zwiększoną kumulację barwników fluorescencyjnych w komórkach eksponowanych na kurkuminoidy, co świadczy o upośledzaniu zdolności usuwania ksenobiotyków z komórki, a zatem o zablokowaniu białek transportujących [88]. Jak wykazano, dzięki hamowaniu białek z rodziny ABC kurkumina może jednakowo oddziaływać cytotoksycznie na komórki wrażliwe, jak i wykazujące oporność na cytostatyki, opartą na upośledzeniu transportowych białek błonowych. Przykładem jest eksperyment, w którym komórki linii MCF-7 i wielolekoopornej linii MCF-7R inkubowano z kurkuminą przez 72 h. Nie zaobserwowano statystycznie istotnej różnicy w IC 50 dla kurkuminy wyznaczonych dla obydwu linii (MCF-7: 29.3 ± 1.7 M; MCF- 7R: 26.2 ±1.6 M). Podobne wyniki otrzymano dla IC 70 (MCF-7: 51.7 ± 2.2 M; MCF-7R: 46.2 ±13.9 M) [89]. Jednakowa wrażliwość komórek obu linii na kurkuminę wskazuje, że mechanizm chroniący komórki linii MCF-7R przed działaniem leków przeciwnowotworowych nie chroni ich przed działaniem kurkuminy. Z przeprowadzonych badań in vitro i symulacji komputerowych wynika, że kurkumina łączy się z domeną wiążącą leki w białkach z rodziny ABC, choć, co ciekawe, prawdopodobnie nie jest przez to białko transportowana [85, 88]. Wskazuje to na kompetycyjny charakter inhibicji. Poza hamowaniem transporterów błonowych na poziomie białkowym, kurkumina obniża także ekspresję genów dla białek z grupy ABC [87, 90, 91]. Z szeregu właściwości kurkuminy wpływających na jej potencjalne działanie jako związku przeciwnowotworowego, należy też wspomnieć o bezpośrednim jej wpływie na procesy związane z proliferacją komórek. I tak, kurkumina hamuje aktywność reduktazy rybonukleotydowej, enzymu niezbędnego w syntezie DNA [92]. Znaczenie mają w tym procesie jej właściwości chelatujące, ponieważ wspomniany enzym posiada w swoim centrum aktywnym jony żelaza. Konkurowanie chelatującego związku z enzymem o jony żelaza zaburza enzymatyczną aktywność [92, 93]. Właściwości chelatujące kurkuminy znajdują także swoje odzwierciedlenie w upośledzaniu przez nią funkcjonowania metaloproteinazy macierzy zewnątrzkomórkowej, posiadającej w swoim centrum aktywnym jony cynku lub wapnia, co 14

z kolei sprzyja procesom angiogenezy i metastazom przez osłabianie wiązania komórek z macierzą [36, 94]. Uważa się, że przeciwnowotworowe działanie kurkuminy, dzięki hamowaniu NF- B może być związane z ograniczaniem angiogenezy i przerzutowania [68, 70]. 2.2. Kurkumina a chemoprewencja Chemoprewencyjne działanie kurkuminy wiąże się z aktywnością przeciwzapalną, właściwościami przeciwutleniającymi oraz zdolnością kompleksowania toksycznych metali ciężkich. Udowodniono je, jak na razie, na zwierzętach. Kurkumina podawana per os myszom chroniła je przed powstawaniem nowotworu indukowanego benzopirenem lub dimetylobenzoantracenem [21, 33, 75]. Szacuje się, że m.in. 15-20 % zgonów z powodu chorób nowotworowych jest związanych z nowotworami stanowiącymi konsekwencję chronicznego stanu zapalnego lub infekcji bakteryjnej spowodowanej, m.in. Helicobacter pylori lub wirusem zapalenia wątroby typu C [66, 95]. Jako pierwszy zasugerował związek nowotworu z chronicznym stanem zapalnym Virchow w XIX wieku [66]. Aktywność przeciwzapalna kurkuminy wiąże się głównie ze wspomnianym już wpływem na czynnik transkrypcyjny NF- B, ale także z wpływem na inne czynniki, związane z procesem zapalnym, jak: p53, PPAR-, Nrf2, C/EBP, CHOP, czy ATF3 [6, 96]. Czynnik transkrypcyjny PPAR- jest odpowiedzialny za regulację ekspresji genów związanych z różnicowaniem komórek i apoptozą. Jego ligandami są, m.in. wielonienasycone kwasy tłuszczowe i prostaglandyny. Nadekspresję PPAR- stwierdzono, m.in. w komórkach nowotworów przewodu pokarmowego [97]. Czynnik transkrypcyjny Nrf2 aktywuje enzymy odpowiedzialne za syntezę glutationu [98]. Jest też związany z aktywacją genów związanych z ochroną antyoksydacyjną oraz białek przeciwzapalnych [99]. Aktywowany Nrf2 ma, m.in. działanie antyneurodegeneracyjne [98]. ATF3 to czynnik działający antagonistycznie do NF- B, w zakresie regulacji odpowiedzi immunologicznej [96]. Jest aktywny w komórkach poddawanych warunkom stresowym, prawdopodobnie odpowiada również za regenerację neuronów [100]. Czynnik transkrypcyjny C/EBP ulega ekspresji w granulocytach, monocytach i eozynofilach, indukuje różnicowanie i hamuje proliferację komórek [101]. CHOP z kolei, jest zaangażowany w apoptozę [102]. Ważną właściwością kurkuminy w aspekcie aktywności przeciwzapalnej jest też oddziaływanie na główne enzymy odpowiedzialne za procesy zapalne, tj. cyklooksygenazy [81]. 15

Cyklooksygenaza 1 wykazuje stałą ekspresję i jest odpowiedzialna za syntezę prostaglandyn [11, 103]. Cyklooksygenaza 2 jest natomiast aktywowana przez mitogeny, onkogeny, promotory nowotworzenia i czynniki wzrostowe, co czyni ten enzym obiecującym celem dla terapii przeciwnowotworowej [11, 103]. Cyklooksygenaza odgrywa rolę w procesach wzrostu guza nowotworowego i przerzutowaniu [61, 104]. Związana jest też z powstawaniem czynników proangiogennych m.in. VEGF, czy syntazy tlenku azotu [105]. Jej znaczenie wykazano, m.in. w powstawaniu nowotworów żołądka spowodowanych zakażeniem Helicobacter pylori [104]. Jak wcześniej wspomniano, chemoprewencyjne właściwości kurkuminy wiążą się również z działaniem przeciwutleniającym związku umożliwiającym zmiatanie agresywnych, w odniesieniu do kwasów nukleinowych i białkowo-lipidowych, struktur komórkowych reaktywnych form tlenu i azotu [4, 29, 106-108]. Jak się okazuje, aktywność kurkuminy jako przeciwutleniacza jest kilkakrotnie większa niż tokoferolu i, jak w przypadku tego rodzaju właściwości aktywność ta determinowana jest szeregiem czynników [4, 6, 17].. Obecność ugrupowań fenolowych jest istotna w przypadku aktywności związku jako zmiatacza wolnych rodników. Dodatkowo, w procesie enolizacji powstaje dodatkowa grupa hydroksylowa wspomagająca działanie kurkuminy jako zmiatacza wolnych rodników. Rycina 1. Wzór kurkuminy w formie ketonowej i enolowej. Wewnątrzcząsteczkowe wiązanie wodorowe stabilizuje występującą praktycznie wyłącznie formę enolową. Wspomniane już wcześniej w aspekcie przeciwnowotworowego działania kurkuminy kompleksowanie jonów metali jest kolejną właściwością tego związku, który może decydować o jego działaniu chemoprewencyjnym. Szereg jonów metali, bowiem uczestniczy w reakcji Fentona, w wyniku której ulegają rozkładowi nadtlenki wodoru, czy lipidowe tworząc tym samym najbardziej toksyczne dla komórki reaktywne formy tlenu rodniki hydroksylowe. Wśród nich są jony glinu, kadmu, żelaza i miedzi [5, 17, 22-24, 109-114]. 16

2.3. Wady kurkuminy Jak opisano w poprzednich rozdziałach, kurkumina stwarza nadzieje na stosowanie jej w terapii przeciwnowotworowej i chemoprewencji, jednak ograniczeniem mogą być jej niektóre właściwości determinujące ewentualne zastosowanie jako substancji czynnej w produktach leczniczych. Kurkumina wykazuje bowiem niestabilność w formie rozpuszczonej, jest nierozpuszczalna w wodzie, a in vivo ulega zbyt szybkiemu metabolizowaniu [115]. Nierozpuszczalność w wodzie i wrażliwość na odczyn środowiska omawianego związku definiują jego biodostępność, która jest wysoce niezadowalająca. Aż 80 % spożytej kurkuminy nie trafia do krwioobiegu [116]. Związek ten, po podaniu doustnym jest usuwany drogą jelitową (89,4 %) i przez nerki (6,3 %), a w tkankach nie stwierdza się go już po 3-6 godzinach [117, 118]. Z dużym prawdopodobieństwem można oczekiwać, że rozpuszczalne w wodzie analogi kurkuminy będą wykazywały zdecydowanie korzystniejsze właściwości terapeutyczne. Kurkumina kumuluje się w błonach śluzowych, wątrobie i nerkach. W pozostałych badanych narządach poziom kurkuminy jest kilkakrotnie niższy niż we krwi, co wskazuje na brak akumulacji [118]. Jak wykazano w badaniach na szczurach, w wątrobie kurkumina ulega procesowi nie utleniania, a redukcji. Wynika to z jej hamującego działania na cytochrom P450, odpowiedzialny za utlenianie ksenobiotyków [119, 120]. Produktami redukcji kurkuminy są nieaktywne biologicznie: tetrahydrokurkumina, heksahydrokurkumina, i oktahydrokurkumina, najczęściej połączone z glukozą [120, 121]. W mniejszej ilości w organizmie występują metabolity kurkuminy połączone z resztą kwasu siarkowego [120, 121]. Redukcji w wątrobie ulega również ugrupowanie diketonowe, obecne w cząsteczce związku [122]. Obecny postęp we wszystkich dziedzinach nauki umożliwia modyfikację właściwości farmakokinetycznych danego związku. Jedna z możliwości to projektowanie i synteza pochodnych, które charakteryzowałyby się lepszą biodostępnością i wolniejszym metabolizmem w porównaniu do cząsteczki macierzystej. Druga, to zastosowanie adjuwantów, nanocząstek, miceli, liposomów, cyklodekstryn oraz kompleksów fosfolipidowych ułatwiających biodostępność. Takie rozwiązania próbuje się wdrożyć w przypadku kurkuminy [1, 120, 123]. 17

2.4. Synteza pochodnych kurkuminy Pochodne kurkuminy można otrzymać różnymi drogami. W niniejszej pracy została zastosowana metoda opracowana przez Pabona [124]. W metodzie tej wykorzystuje się aldehydy aromatyczne i borowe kompleksy acetyloacetonu. Reakcje prowadzi się w warunkach zasadowych. Ostatnim etapem syntezy jest hydroliza kompleksu borowego. Utworzony kompleks borowy uniemożliwia zajście reakcji na atomie węgla położonym pomiędzy ugrupowaniami ketonowymi. Na poniższych schematach zamieszczono alternatywne metody. Należy zauważyć, że bardzo często wykorzystuje się w nich związki metaloorganiczne. Rycina 2. Schemat syntezy analogów kurkuminy, gdzie Mtl to reagent bimetaliczny złożony z miedzi i cynku [125]. 2.4.1. Syntetyczne pochodne kurkuminy Prace nad stworzeniem pochodnych kurkuminy, której wzór strukturalny przedstawiony jest na Rycinie 3 obejmują następujące zmiany strukturalne w cząsteczce kurkuminy: - modyfikacje łańcucha łączącego pierścienie aromatyczne, - wprowadzanie podstawników do pierścieni aromatycznych, - tworzenie kompleksów kurkuminy i jej pochodnych z jonami metali, schematycznie zobrazowane na Rycinie 4. Rycina 3. Wzór strukturalny kurkuminy. 18

2.4.2. Modyfikacje łańcucha łączącego pierścienie aromatyczne Na poniższym Schemacie przedstawiono rodzaje modyfikacji łańcucha 3,5-dioksa-1,6,- heptadienowego łączącego pierścienie aromatyczne: Rycina 4. Typy modyfikacji łańcucha hepta-1,6-dien,3-5-dionowego [126]. Wykazano, że pochodne kurkuminy ze zredukowanymi wiązaniami podwójnymi, takie jak tetrahydrokurkumina, heksahydrokurkumina i oktahydrokurkumina wykazują lepsze właściwości antyoksydacyjne niż kurkumina. Właściwości te oceniano w środowisku bezkomórkowym badając redukcję poziomu wolnych rodników metodą spektrofotometryczną [3]. Tetrahydrokurkumina dodatkowo wykazuje aktywność hamującą w stosunku do białek z grupy ABC [86]. Niezależne badania zespołów badaczy niemieckich i japońskich wskazują, że proces redukcji wiązań podwójnych we fragmencie alkilowym kurkuminy osłabia lub wręcz znosi aktywność antyproliferacyjną pochodnych kurkuminy w odniesieniu do komórek nowotworowych, czy pierwotniaków z rodzajów Trypanosoma i Leishmania, co nie wyklucza, 19

że podwójne wiązania w łańcuchu alkilowym są niezbędne dla oddziaływania kurkuminy z białkami regulującymi cykl komórkowy [3, 25, 127]. Pochodne kurkuminy z zablokowanym ugrupowaniem ketonowym, np. poprzez połączenie z aminami mają natomiast słabsze właściwości cytotoksyczne [12, 128]. W przypadku właściwości antyoksydacyjnych okazało się, że kurkumina podstawiona w obrębie jednej grupy ketonowej semikarbazonem (Rycina 5) reaguje z wolnymi rodnikami w wolniejszym tempie niż związek podstawowy, jednak nie wpływa to znacząco na aktywność zmodyfikowanej cząsteczki [129]. Przeciwnie, antyoksydacyjny potencjał grupy fenolowej (Rycina 5 wzór dolny) (dwie struktury rezonansowe tej samej pochodnej) obecnej w cząsteczce pochodnej semikarbazonowej okazał się wyższy. Wzór struktur rezonansowych pochodnej semikarbazonowej zamieszczono na schemacie poniżej. W czasie połączenia z wolnymi rodnikami następuje przemieszczenie wiązania podwójnego w semikarbazonie pomiędzy dwa atomy azotu. Umożliwia to powstanie sprzężonego układu wiązań podwójnych wzdłuż całej cząsteczki i zwiększa stabilność tworzącego się rodnika. Rycina 5. Struktury graniczne rodnika tworzonego przez pochodną semikarbazonową kurkuminy. Kolejną modyfikacją układu diketonowego może być wprowadzenie podstawionego grupą benzylową oksymu. Taka modyfikacja zwiększa działalność antyproliferacyjną względem linii HA22T/AGH (nowotwory wątroby) i MCF-7 (rak piersi) oraz MCF-7R (rak piersi odporność wielolekowa) [89]. 20

Inną modyfikacją, w której z części łańcucha łącznikowego został utworzony pierścień dihydropironowy jest cyklokurkumina (Rycina 6). Rycina 6. Wzór strukturalny cyklokurkuminy. Badania A. Simon i wsp., przeprowadzone z użyciem linii ludzkich komórek raka piersi - MCF-7 wykazały, że cyklokurkumina jest nieefektywnym inhibitorem proliferacji komórek [1, 130]. Dołączenie do atomu węgla między grupami ketonowymi podstawnika metylowego lub benzylowego powoduje wzrost aktywności przeciw białkom z grupy AP-1, nie powodując utraty właściwości antyutleniacza [80]. W przypadku szeregu modyfikacji kurkuminy, układu cyklicznego nie daje się otrzymać w wyniku przegrupowania w obrębie tej samej cząsteczki kurkuminy, gdzie zmienia się wyłącznie sposób wzajemnego połączenia atomów, a nie ich liczba. Wówczas konieczne jest wprowadzanie do cząsteczki podstawowej zewnętrznych elementów strukturalnych, np. cyklicznego ketonu. Wykazano, że najwyższą aktywność antyproliferacyjną w stosunku do komórek nowotworowych wykazują analogi 2,6-dibenzylidenocykloheksanonu (Rycina 7) w których atomem X nie jest węgiel, a np. atom tlenu [128, 131]. Wykazują one pewne podobieństwo strukturalne do kurkuminy. Rycina 7. Wzór ogólny analogów 2,6-dibenzylidenocykloheksanonu z ketonem cyklicznym. Spośród produktów przekształceń kurkuminy posiadających dodatkowe pierścienie poprzez dołączenie dodatkowych ugrupowań z zewnątrz, najciekawsze właściwości zdaje się mieć pochodna pirazolowa (Rycina 8, seria 2) [128]. W każdej parze wszystkie podstawniki oznaczone przez R były takie same. Stwierdzono, że związek z serii pierwszej wykazywał kilka 21

razy większą aktywność cytotoksyczną od związku z serii 2 w 6 z 8 porównywanych par wobec komórek ludzkiego raka piersi MCF-7 [12]. Jak widać na schemacie związki z serii pierwszej posiadają ugrupowanie diketonowe, które w związkach z grupy drugiej zostało zastąpione pierścieniem pirazolowym Według J. Ishida i wsp., oraz S. Dutta i wsp., stopień inhibicji podziałów komórkowych zależy od rodzaju utworzonej pochodnej, np. dla pirazolowej pochodnej (Rycina 8, seria 2) wzmaga właściwości antyproliferacyjne w stosunku do pochodnej z wolną grupą ketonową (Rycina 8, seria 1) [89, 127, 129]. Wykazuje ona potencjalną aktywność antyangiogenną, a także hamuje proliferację komórek nowotworowych oraz aktywność lipooksygenazy, która uczestniczy w powstawanie stanu zapalnego oraz cyklooksygenazy [81, 89, 128]. Z kolei izoksazolowe analogi kurkuminy wykazują większą aktywność przeciwko Mycobacterium tuberculosis (prątkowi gruźlicy) niż związki posiadające układ diketonowy [132]. Analogi kurkuminy zawierające zarówno układ 1,3- -diketonowy w formie enolowej jak też możliwy do otrzymania z niego pierścień pirazolowy bądź izoksazolowy, ze względu na ich dużą anizotropię geometryczną mogą prawdopodobnie wykazywać właściwości mezogeniczne, o ile będą odpowiednio podstawione łańcuchowymi grupami alkoksylowymi. Wydaje się to bardzo prawdopodobne, ponieważ odpowiednio podstawione pochodne 3,5 difenylopirazolu i 3,5 difenyloizoksazolu, które w przeciwieństwie do analogów kurkuminy, nie zawierają ugrupowań etylenowych między pierścieniami heterocyklicznymi a pierścieniami fenylowymi,są ciekłymi kryształami [133, 134]. Rycina 8. Analogi kurkuminy w formie -diketonowej (seria 1) oraz pirazolowej (seria 2). 22

2.4.3. Wprowadzanie podstawników do pierścieni aromatycznych Modyfikacje cząsteczki kurkuminy, opisane w tej części dotyczą rozmieszczenia grup hydroksylowych w pierścieniach bocznych, ich liczby oraz blokowania w reakcjach tworzenia estru, eteru lub acetalu. Najprostszą z wymienionych modyfikacji jest zamiana miejscami grup fenolowej i metoksylowej, czego przykładem jest izokurkumina: Rycina 9.Wzór strukturalny izokurkuminy. Izokurkumina wykazuje porównywalne do kurkuminy działanie antyproliferacyjne, jednak słabsze niż związek podstawowy właściwości zmiatania wolnych rodników [3]. Jak wykazano, zdolności antyoksydacyjne pochodnych kurkuminy są pozytywnie skorelowane ze wzrostem ilości grup hydroksylowych (fenolowych) w pierścieniach aromatycznych [3, 108, 135, 136]. Obserwacja ta potwierdza łatwość oddziaływania grup fenolowych z reaktywnymi formami tlenu [131]. Izokurkumina wydaje się więc być jedynym wyjątkiem od przedstawionej reguły. Nie są wyjaśnione powody tego odstępstwa. Pochodne kurkuminy bez wolnych grup fenolowych nie wykazują właściwości przeciwutleniających [80]. Demetoksykurkumina i bisdemetoksykurkumina (Rycina 10) to naturalnie występujące pochodne kurkuminy. Różnią się od podstawowego związku brakiem jednej lub dwóch grup metoksylowych przy pierścieniach aromatycznych. Obie pochodne wykazują niższą aktywność przeciw pierwotniakom z rodzaju Trypanosoma w porównaniu do kurkuminy [25]. Bisdemetoksykurkumina wykazuje większą niż kurkumina aktywność przeciwzapalną i jest bardziej efektywna jako związek antywolnorodnikowy, a także hamujący podziały komórkowe, jak wykazano w przypadku komórek HCT116 (ludzki nowotwór okrężnicy) [36, 37]. 23

Rycina 10. Analogi kurkuminy pozbawione jednej lub dwóch grup metoksylowych. Jak wykazano w badaniach in vitro z wykorzystaniem ludzkich komórek czerniaka - RPMI 7951 i ludzkich komórek raka piersi - MDA- MB-23, najlepszą lokalizacją dla grupy fenolowej w cząsteczce kurkuminy, przy braku grupy metoksylowej, w kontekście aktywności cytotoksycznej okazała się pozycja orto- w stosunku do łącznika alkilowego, mniej aktywne okazały się pozycje meta- i para- (Rycina 11) [131]. Rycina 11. Rozmieszczenie grup hydroksylowych w cząsteczce pochodnych kurkuminy. Grupy fenolowe są stosunkowo reaktywne, co stwarza duże możliwości ich modyfikowania [39]. W naturalnie występującej kurkuminie po jednej grupie fenolowej przy każdym z pierścieni tworzy wiązanie eterowe (najbardziej stabilna modyfikacja grupy fenolowej) z grupą metylową. Okazuje się, że powstająca w ten sposób grupa metoksydeterminuje aktywność cytotoksyczną związku, co wykazano w badaniach z użyciem ludzkich komórek raka piersi MCF-1 SKBr3, płuc - A-549, nerki- CAKI-1, złośliwe glejaki - U-87-MG, 24

kostniakomięsak- HOS, wątroby - HepG2, prostaty - PC-3 i LNCaP, a także białaczki - HCT-8 i czerniaka SKME L -2 [12, 126, 136]. Pochodne tego rodzaju charakteryzuje większa stabilność [75, 137]. Ilość grup fenolowych w cząsteczce kurkuminy pozytywnie koreluje z aktywnością pochodnych jako inhibitorów cyklooksygenazy-1 [103]. Z kolei, wprowadzenie podstawnika sulfonamidowego zwiększa aktywność antyproliferacyjną analogów kurkuminy względem komórek linii PC-3, LNCaP, MCF-7 i MDA- MD-231 [81]. Okazuje się, że istotny dla przeciwnowotworowej aktywności kurkuminy jest tlen połączony z pierścieniem aromatycznym. Zastąpienie go halogenem lub łańcuchem alkilowym powoduje utratę właściwości przeciwnowotworowych [128]. Związki zawierające polieter działają głównie poprzez kompleksowanie i transportowanie przez błonę jonów metali. Skutkiem tego może być wywołanie apoptozy, zahamowanie cyklu komórkowego, powstawanie stresu oksydacyjnego, utrata potencjału mitochondrialnego. Polietery mogę mieć działanie przeciwnowotworowe, jak również przeciw szerokiemu spektrum bakterii, szczególnie gramdodatnich, a także przeciw grzybom, pierwotniakom, pasożytom, wirusom. Wszystkie opisywane w pracy polietery miały wolną grupę karboksylową, przez co mogła powstawać cykliczna postać stabilizowana wiązaniem wodorowym (głowa do ogona) co usprawniało aktywność. Niestety taka struktura była wrażliwa na ph, mogła powstawać tylko w ph obojętnym lub zasadowym, kiedy grupa karboksylowa była zdysocjowana [138]. Projektowanie pochodnych ma na celu, poza poprawą aktywności biologicznej kurkuminy także poprawę jej właściwości fizyko-chemicznych, np. przez zwiększenie rozpuszczalności w wodzie mającej bezpośredni wpływ na biodostępność związku. Kurkumina połączona wiązaniem acetalowym z glukozą lepiej rozpuszcza się w wodzie zachowując swoje właściwości chelatujące w szerokim zakresie ph [24, 110]. Sama glukoza nie oddziaływuje z metalami, a żelazo jest chelatowane przez ugrupowanie diketonowe pochodzące od kurkuminy [24]. Do poprawienia rozpuszczalności kurkuminy w wodzie przyczynia się także utworzenie jej estru z aminokwasem, np. waliną lub glicyną. Pochodne tego typu charakteryzują się większą biodostępnością niż kurkumina, a dodatkowo wykazują aktywność przeciwbakteryjną i przeciwwirusową [31, 128]. Estry disukcynylodietylowe (Rycina 12) zwiększają stabilność cząsteczki kurkuminy, przez co pochodne kurkuminy tego typu mogą być wykorzystywane jako proleki, czyli nieaktywne substancje podawane do organizmu, które nabywają leczniczych właściwości pod wpływem procesów metabolicznych [139]. W tym przypadku zachodzi prosta hydroliza estru. 25

Rycina 12. Disukcynylodietylowy ester demetylowanej kurkuminy. Zacetylowanie grupy fenolowej nie wpływa znacząco na aktywność cytotoksyczną, wzmaga natomiast właściwości przeciwbakteryjne i przeciwgrzybicze, osłabiając jednak aktywność związku jako przeciwutleniacza [3, 29, 140]. 2.4.4. Tworzenie kompleksów kurkuminy i jej analogów z jonami metali Do tej pory, znane są kompleksy kurkuminy z jonami miedzi, manganu, wanadu, galu, indu, boru, samaru, złota i platyny [1, 29, 140-144]. Ważną grupę wśród kompleksów kurkuminy stanowią kompleksy z metalami, które mogą względnie łatwo zmieniać swój stopień utlenienia. Takie kompleksy mogą wykazywać działanie pro-, ale też antyoksydacyjne. Do takich metali należą mangan, miedź i żelazo. Kompleksy wyżej wymienionych metali z kurkuminą są mimetykami dysmutazy ponadtlenkowej, katalizują bowiem rozkład rodnika ponadtlenkowego do tlenu i nadtlenku wodoru [29, 144, 145]. Kompleksy z manganem są stosunkowo bezpieczne, ponieważ w przeciwieństwie do jonów miedzi i żelaza nie katalizują reakcji Fentona, której produktem są wolne rodniki. Siła wiązania kompleksu mangan- kurkumina przewyższa wiązanie manganu z kompleksującym go EDTA [29]. Według Vairagupty i wsp. oraz Sumanont i wsp., manganowe kompleksy kurkuminy i jej pochodnych przeciwdziałają neurodegeneracji wywołanej kwasem kainowym skuteczniej niż sama kurkumina lub jej pochodne niezawierające w swojej cząsteczce manganu [29, 145]. Kompleksy te blokują również aktywowaną przez kwas kainowy produkcję tlenków azotu, odgrywających znaczącą rolę w indukowanej przez ten kwas neurodegeneracji, poprawiają pamięć i zdolność uczenia się [29, 147]. Kompleksy kurkuminy z wanadylem (jonem VO 2+ ), indem, galem i palladem okazały się efektywniejsze od wolnej kurkuminy jako inhibitory podziałów komórek nowotworowych, co wykazano na przykładzie komórek mysiej białaczki [1, 140, 145]. Potencjalnie najskuteczniejsze w terapii przeciwnowotworowej wydają się jednak być kompleksy kurkuminy z miedzią. 26

W badaniach in vitro z użyciem ludzkich komórek raka piersi MDA-MB-31 i MCF-7 oraz komórek EAC (komórki guza Ehrlicha) wykazano, że kompleksy takie wzmagają hamowanie podziałów komórkowych w porównaniu do kurkuminy niekompleksowanej, W badaniach in vivo obserwowano wydłużenie czasu życia u myszy z zaawansowaną białaczką, otrzymujących kompleks miedziowy z kurkuminą w porównaniu do zwierząt obciążonych takim samym nowotworem, ale nieotrzymujących tego związku [141, 144, 145, 147]. W literaturze są też doniesienia potwierdzające właściwości przeciwreumatyczne kompleksów kurkuminy z wanadylem i złotem [120, 144, 145]. Kompleksy z wanadylem mogą również obniżać poziom cukru we krwi [148]. Z kolei, borowe kompleksy kurkuminy okazały się inhibitorami proteaz wirusa HIV [1]. Badania zostały przeprowadzone przez Sui i wsp z użyciem wyizolowanego enzymu działającego na polipeptyd, będący substratem dla proteazy HIV [149]. 2.5. Ciekłe kryształy Ciekłymi kryształami nazywamy substancje wykazujące właściwości pośrednie między stanem skupienia stałym i ciekłym. Podobnie jak substancje ciekłe wykazują płynność, natomiast podobnie jak kryształy wykazują anizotropię optyczną. Strukturalnie są to zwykle cząsteczki o dużej anizotropii geometrycznej (zwykle jeden wymiar bardzo różni się od pozostałych). Kształt cząsteczki mezogenu jest zwykle albo silnie wydłużony (mezogeny kalamityczne) lub spłaszczony (mezogeny dyskoidalne). Najważniejszym w biologii układem ciekłokrystalicznym jest błona komórkowa i inne błony biologiczne. Tworzące ją lipidy i białka mogą praktycznie bez ograniczeń przemieszczać się obrębie warstw lipidowych tworzących błonę, zupełnie tak jakby pływały znajdowały się w roztworze. Natomiast przechodzenie lipidów i białek z warstwy do warstwy jest bardzo utrudnione, co przypomina właściwości kryształu. Dzięki tym właściwościom błona komórkowa może lepiej spełniać swoje biologiczne funkcje: izolować komórkę od środowiska zewnętrznego, jednocześnie umożliwiając komórce odbieranie bodźców, ruch oraz selektywne pobieranie substancji odżywczych ze środowiska. 27

Fotografia 1. Polaryzacja komórki i skupianie się białka receptorowego (wybarwione na czerwono) w pobliżu komórki prezentującej antygen(strzałka) [150a]. Skupianie się receptorów na jednym biegunie komórki jest możliwe dzięki płynności błony komórkowej. Cząsteczki kalamityczne zawierają w swojej strukturze co najmniej dwa pierścienie aromatyczne połączone ze sobą bezpośrednio lub grupą mostkową. Zawierają one zazwyczaj również łańcuchowe podstawniki terminalne (wzdłuż długiej osi cząsteczki przeważnie alkilowe lub alkoksylowe. W przypadku tego typu cząsteczek jeden z wymiarów cząsteczki jest zdecydowanie większy niż pozostałe. Tego typu cząsteczki tworzą fazy nematyczne lub smektyczne [150b,150c]. W fazie nematycznej cząsteczki wykazują jedynie uporządkowanie orientacyjne. W tej fazie długie osie cząsteczek są uporządkowane względem tego samego kierunku zwanego direktorem. Natomiast w fazie smektycznej oprócz tej samej orientacji osi cząsteczek ułożone są również w warstwy, wykazując jednowymiarowe uporządkowanie translacyjne. Najprostszymi fazami smektycznymi są fazy A i C, w których nie występuje uporządkowanie translacyjne wewnątrz warstwy smektycznej. W smektyku A direktor jest prostopadły do warstwy, a wsmektyku C tworzy on z normalną do warstwy niezerowy kąt zwany tiltem. Smektyk C stanowi fazę pochyloną. Rycina 13. Porównanie uporządkowanie molekuł w nematyku, smektyku A i smektyku C. Strzałką oznaczono direktor. 28

W przypadku gdy jeden z wymiarów cząsteczki jest dużo mniejszy od pozostałych cząsteczki tworzą fazy kolumnowe lub nematyczne. Mezogeny takie zbudowane są zwykle ze skondensowanych pierścieni aromatycznych i przyłączonych do nich łańcuchowych podstawników alkilowych lub alkoksylowych W tych fazach uporządkowanie dotyczy krótkich osi cząsteczki. Wśród faz kolumnowych najczęściej spotykana jest faza heksagonalna w której kolumny uporządkowane są w przestrzeni tworząc dwuwymiarową sieć heksagonalną. Rycina 14. Uporządkowanie molekuł w fazie kolumnowej. 29

3. Materiały i metody 3.1. Synteza organiczna Wszystkie syntezy przeprowadziłem w Pracowni Fizykochemii Dielektryków i Magnetyków na Wydziale Chemii Uniwersytetu Warszawskiego. 3.1.1. Synteza analogów benzaldehydu Polieterowe pochodne benzaldehydu otrzymałem z odpowiednich hydroksylowych pochodnych tego aldehydu (Sigma Aldrich) oraz 1-chloro-3-oksa-butanu lub 1-chloro-3,6- dioksaheptanu w reakcji Williamsona. Alkoksylowe pochodne benzaldehydu otrzymałem z odpowiednich hydroksylowych pochodnych tego aldehydu (Sigma Aldrich) oraz 1-bromooktanu w reakcji Williamsona. 3.1.2. Synteza formylowego analogu eteru koronowego 4 -formylobenzo-18-korona-6 otrzymałem z benzo-18-korona-6 (Sigma Aldrich) w reakcji Vilsmeiera- Haacka, zgodnie z procedurą opisaną w pracy O.P. Kryatovej [151], w której ten związek jest opisany. 3.1.3. Synteza analogów A oraz B kurkuminy Reakcje przeprowadziłem metodą zaproponowaną przez Pabona [124]. Acetyloaceton (4g, 40 mmol, Reachim) rozpuściłem w 40 ml octanu etylu (Sigma Aldrich) i dodałem 2 g (28 mmol) bezwodnika kwasu borowego (POCh). Roztwór mieszano na mieszadle magnetycznym przez 30 minut w temperaturze 40 C. Następnie dodałem 90 mmola odpowiedniej pochodnej benzaldehydu i 40 ml boranu tributylu (0,15 mmol, Sigma Aldrich) i mieszano przez 30 minut. Po upływie tego czasu wkraplałem przez 15 min. 6 ml butyloaminy (60 mmol, POCh) rozpuszczonej w 40 ml octanu etylu. Mieszanie kontynuowano przez 24h w temperaturze 40 C, powstały kompleks borowy hydrolizowałem przez dodanie 120 ml 4 N kwasu solnego (POCh), a następnie ogrzewano przez 30 minut w temperaturze 60 C. Przebieg reakcji kontrolowałem za pomocą chromatografii TLC (silikażel, CH 2 Cl 2 /aceton). Mieszaninę reakcyjną zobojętniono wodorowęglanem sodowym i wyekstrahowano produkt octanem etylu. Produkt wstępnie 30

oczyściłem chromatografią kolumnową stosując układ chlorek metylenu (POCh): acetonu (POCh) 20:1. Czysty produkt otrzymałem metodą preparatywnej chromatografii cienkowarstwowej (silikażel, chlorek metylen: aceton 9:1). Związki z podstawnikami alkoksylowymi krystalizowałem z heptanu. Rycina 15. Schemat syntezy pochodnych kurkuminy. 3.1.4. Synteza pirazolowych analogów kurkuminy (analogi B ) Hydrazynę (50 mg 1,6 mmol) oraz odpowiedni (1,7-bis(mono- di- lub trialkoksyfenylo) hepta-1,6-dien,3-5- dion (1,2 mmol) rozpuściłem w lodowatym kwasie octowym. Mieszaninę utrzymywałem w temperaturze wrzenia przez 24 h. Rozpuszczalnik odparowałem pod zmniejszonym ciśnieniem, dodałem 70 ml wody; wydzielony oleisty produkt ekstrahowałem eterem dietylowym. (50 ml). Pirazolowy analog oczyściłem za pomocą chromatografii cienkowarstwowej (SiO 2, aceton, chlorek metylenu 1:10). 3.1.5. Synteza 1 metylopirazolowych analogów kurkuminy (analogi B ) Metylohydrazynę (0,1 ml 1,9 mmol) oraz odpowiedni (1,7-bis(mono-, di- lub trialkoksyfenylo) hepta-1,6-dien,3-5-dion (1,2 mmol) rozpuściłem w lodowatym kwasie octowym. Mieszaninę utrzymywałem w temperaturze wrzenia przez 24 h. Rozpuszczalnik odparowałem pod zmniejszonym ciśnieniem, dodałem 70 ml wody; wydzielony oleisty produkt ekstrahowałem eterem dietylowym (50 ml). Pirazolowy analog oczyściłem za pomocą chromatografii cienkowarstwowej (SiO 2, aceton, chlorek metylenu 1:10). 3.1.6. Synteza izoksazolowych analogów kurkuminy (analogi B ) Chlorowodorek hydroksyloaminy (200 mg, 3,2 mmol) i odpowiedni 1,7- bis (mono- dilub trioktyloksyfenylo)hepta-1,6-dien-3,5 dion (1,2 mmol) rozpuściłem w lodowatym kwasie octowym. Mieszaninę utrzymywałem w temperaturze 82ºC przez 24 godziny. Następnie 31

odparowałem rozpuszczalnik i dodałem 70 ml wody. Analog izoksazolowy ekstrahowałem eterem dietylowym i oczyściłem za pomocą chromatografii cienkowarstwowej (SiO 2, aceton, chlorek metylenu 1:10). 3.1.7. Widma NMR Widma NMR były rejestrowane na aparacie o częstotliwości 500 MHz, związki rozpuszczono w deuterowanym chloroformie. 3.2. Badanie aktywności biologicznej pochodnych kurkuminy 3.2.1. Badane związki Ocenie aktywności biologicznej poddano nowozsyntetyzowane pochodne oznaczone w rozdziale Wyniki jako analogi A kurkuminy oznaczone numerami od 1 do 7. Związek porównawczy stanowiła kurkumina. Badania przeprowadziłem w Zakładzie Biochemii i Biofarmaceutyków Narodowego Instytutu Leków. 3.2.2. Hodowle komórkowe Human B-lymphocyte GM14467 Coriell Institute Human promyelocytic leukemia HL60 American Type Culture Collection. 3.2.3. Ocena żywotności komórek Do oceny żywotności komórek wykorzystałem gotowy test EZ4U (Biomedica). Komórki posiewałem na płytki 96 studzienkowe (300 tys./studz.) i zawiesiłem je w pożywce wzrostowej zawierającej badane związki w następujących stężeniach: 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 μm. Hodowle kontrolne stanowiły komórki zawieszane w czystej pożywce, bez dodatku związków. Po 24 godzinach inkubacji w 37 C do studzienek dodałem po 20 l odczynnika EZ4U. Po 4 godzinach inkubacji mierzyłem absorpcję roztworów w poszczególnych studzienkach za pomocą czytnika mikropłytek IEMS Reader MF, przy długościach fal 492 nm i 620 nm. Test EZ4U umożliwia wykrywanie żywych komórek dzięki wykazywanej przez nie zdolności enzymatycznej redukcji soli tetrazoliowej o żółtej barwie do intensywnie zabarwionej pochodnej formazanowej o zabarwieniu purpurowym (λ max = 492 nm). Wzrost absorpcji przy λ max = 492 nm pozostaje w liniowej zależności od liczby żywych komórek w badanej hodowli. 32

3.2.4. Ocena morfologiczna komórek Do 0,1 ml zawiesiny komórek o gęstości ok. 10 6 /ml, eksponowanych uprzednio przez 24 godziny na związki w stężeniach równych właściwym dla danych komórek wartościom ½ IC 50 oraz IC 50, tj. komórki GM14467 na kurkuminę w stężeniach 14 M i 28 M lub pochodną 3 w stężeniach 5 M i 9 M, odpowiednio, a komórki HL60 na kurkuminę w stężeniach 12µM i 24 µm lub pochodną 3 w stężeniach 8 M i 15 M, odpowiednio dodawałem 0,1 ml roztworu DAPI (Bio- Rad) w PBS (Pracownia Chemii Ogólnej II TD PAN) o stężeniu 0,1 ng/ml. Kroplę tak przygotowanej zawiesiny, po wymieszaniu nanosiłem na szkiełko podstawkowe i oglądałem w mikroskopie fluorescencyjnym Nikon typ Eclipse TS100- F. 3.2.5. Badanie poziomu białek Przygotowanie lizatów komórkowych 48 godzinne hodowle komórkowe o wyjściowej gęstości 300 tys./ml eksponowałem przez kolejne 24 godz. na badane związki w stężeniach równych właściwym dla danych komórek wartościom ½ IC 50 oraz IC 50 Po 24 godz. komórki odwirowywałem przy 2000 obr/min, 10 min, w temperaturze +4 C. Następnie, osady zawiesiłem w 1,5 ml PBS i ponownie wirowałem w probówkach Eppendorf przy 12000 obr/min, 3 min, w tej samej temperaturze. Lizę komórek prowadziłem przez 15 minut, w temperaturze +4 C dodając do każdej probówki po 100 l buforu CEB o składzie: Tris-HCl (Sigma Aldrich), 10 mm, ph 7,9; KCl (Sigma Aldrich), 1 mm; EDTA (Sigma Aldrich), 1 mm; DTT (ditiotreitol), 1 mm; Nonidet P- 40 (Igepal), 0,4 %; Leupeptin (ICN Biomedica), 1 g/ml); Pepstatin A (Sigma Aldrich), 1 g/ml; Aprotinin ICN Biomedica), 2 g/ml; benzamidine (Sigma Aldrich), 0,5 g/ml; PMSF (Sigma Aldrich), 0,5 mm. Po 15 min próbki wirowałem przy 12000 obr/min, 5 min, +4 C i zbierano supernatanty (lizaty). Western blot 30 μl lizatu (ilość odpowiadająca ok. 80 g białka) inkubowałem z 10μl buforu Laemlliego (Metlab) i odpowiedniej ilości Tris-HCl, 100mM, ph 7.0 w temperaturze 100 C, 5 min, a następnie nanosiłem na 12 % żele poliakrylamidowe (30 μl/studzienkę). Elektroforezę SDS-PAGE prowadziłem w żelu poliakrylamidowym, 12 %, 1,5 h, 10 V, w temperaturze +4 C, w buforze o składzie: Tris, 0,05 M, glicyna, 0,05 M (Biochimica) i SDS, 0,4 M (Sigma Aldrich). Transfer rozdzielonych na żelu białek na membranę nitrocelulozową (Whatman; 0,45 m) prowadziłem 2 godz., w warunkach: 90V, +4 C, w buforze o składzie: Tris, 27 mm; 33

glicyna, 27 mm; metanol, 0,19 M (Sigma Aldrich) (stężenie końcowe metanolu 20 %). Efektywność transferu sprawdzałem za pomocą barwnika Ponceau S (Sigma Aldrich), który następnie odpłukiwałem trzykrotnie wodą w temperaturze pokojowej. Blokowanie białek na membranie przeprowadzałem w temperaturze pokojowej, 2 godz, w roztworze 5 % odtłuszczonego mleka w proszku, na kołysce laboratoryjnej. Znakowanie pierwszorzędowymi przeciwciałami monoklonalnymi: króliczymi anti- Bcl-2 (Eppendorf),1:250, króliczymi anti- Bax (Eppendorf), 1:125, króliczymi anti- survivine (Eppendorf), 1:67 prowadziłem w temperaturze +4 C, przez noc, na wytrząsarce. Znakowanie β-aktyny prowadziłem przy pomocy przeciwciał mysich anti- -actine (Therms Scientica),1:17000) przez 1h, w temperaturze +4 C. Następnie, po 3-krotnym odpłukaniu przeciwciał pierwszorzędowych przy pomocy roztworu mleka odtłuszczonego w PBS-T (PBS + Tween), białka na membranie znakowałem przeciwciałami drugorzędowymi antykróliczymi przez 2 h, (Sigma, 1:500) lub antymysimi (Sigma, 1:500), w temperaturze pokojowej. Po odpłukaniu przeciwciał drugorzędowych, prążki odpowiadające badanym białkom wykrywałem z zastosowaniem zestawu HPR Colour Development Reagent (Bio-Rad), zgodnie z instrukcją producenta. Odczynniki przygotowywałem ex tempore. Identyfikację prążków potwierdzałem względem wzorca mas cząsteczkowych (10, 17, 26, 34, 43, 55, 72, 95, 130, 170 kda (Fermentas)). Otrzymane wyniki archiwizowano przy użyciu Gel Doc 2000 (Bio Rad) w postaci zdjęć żeli poliakrylamidowych. Oznaczanie białka metodą Bradford Pomiar wykonywałem względem wody demineralizowanej, w próbkach zawierających 2 l lizatu komórkowego i 18 l wody demineralizowanej. Do każdej próbki dodałem 1 ml wodnego roztworu odczynnika Bradford (Sigma Aldrich), 1:4. Próbki z odczynnikiem inkubowałem przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Pomiar wykonywałem na biofotometrze (Eppendorf), przy długości fali 595 nm. Zawartość białka, w g/ml w poszczególnych próbkach obliczano w oparciu o krzywą kalibracji, przygotowaną z użyciem kolejnych rozcieńczeń roztworu albuminy o znanym stężeniu. 34

3.3. Badanie właściwości ciekłokrystalicznych otrzymanych związków 3.3.1. Mikroskopia polaryzacyjna Wstępną identyfikację właściwości ciekłokrystalicznych przeprowadzano za pomocą obserwacji w mikroskopie polaryzacyjnym. Wykorzystałem mikroskop polaryzacyjne Zeiss Imager A2m posiadający stolik grzewczy Linkam LTS-350 i kamerę Canon EOS 7D. Próbka została ogrzano do otrzymania fazy izotropowej, a następnie wolno chłodzona. W metodzie tej wykorzystywano zjawisko wykazywania przez większość związków ciekłokrystalicznych dwójłomności optycznej. Dla takich związków takie umieszczone pomiędzy skrzyżowanymi polaryzatorami obserwowanie są tekstury charakterystyczne dla danej fazy. 3.3.2. Skaningowa kalorymetria różnicowa Temperatury przejść fazowych oznaczyłem za pomocą skaningowego kalorymetru różnicowego TA DSC Q200. Pomiary wykonywałem przy ogrzewaniu i chłodzeniu. Szybkość zmian temperatury wynosiła 5-10ºC /minutę. Skaningowa kalorymetria różnicowa to technika polegająca na pomiarze różnicy energii dostarczanej do próbki badanej i próbki odniesienia (puste naczynko), podczas chłodzenia lub grzania ze stałą szybkością. Ta technika rejestruje zmiany przepływu ciepła w funkcji temperatury. W przypadku zachodzenia przemiany fazowej zachodzi konieczność dostarczenia lub odebrania dodatkowej ilości ciepła co jest rejestrowane przez aparat. 35

4. Wyniki 4.1. Synteza analogów A kurkuminy Dla analogów z grupy A zastosowano numerację od 1 do 7. Aldehyd będący substratem do syntezy pochodnej 4 został otrzymany z izowaniliny oraz 1-chloro-3,6-dioksaheptanu metodą Williamsona z wydajnością 91%. Pozostałe aldehydy otrzymałem tą samą metodą, ich syntezy zostały wcześniej opisane w literaturze. Wydajności wszystkich syntez przekroczyły 90%, wyjątkiem była synteza aldehydu z podstawnikiem polieterowym w pozycjach 3,4,5, gdzie wydajność wynosiła 74%. Syntezę analogów kurkuminy wykonałem zgodnie z procedurą opisaną w publikacji Pabona [124]. Konieczną modyfikacją procedury była jedynie rezygnacja z przemywania mieszaniny poreakcyjnej wodą celem oddzielenia nadmiaru kwasu solnego. Zamiast tego zobojętniono kwas stałym, kwaśnym węglanem potasu i ekstrahowałem octanem etylu. Modyfikacja taka została wprowadzona, ponieważ otrzymane analogi wykazywały znaczącą rozpuszczalność w wodzie i ekstrahowanie ich wodą powodowało znaczące straty w produkcie. Wydajności syntez analogów kurkuminy przedstawiono w tabeli nr 1. Wzory otrzymanych analogów przedstawiono na Rycinach 17-23. Struktury otrzymanych związków udowodniono za pomocą widma NMR oraz analizy elementarnej. Wszystkie związki nie były dotychczas opisywane w literaturze. W tabeli widać, że najniższe wydajności otrzymano dla analogów z największą ilością łańcuchów polieterowych, a więc również o największej rozpuszczalności w wodzie. W przypadku analogów 6 i 7 konieczne było zastosowanie do oczyszczanie metodą chromatografii cienkowarstwowej (celuloza, chlorek metylenu 1:4 heksan). Struktury kurkuminy i otrzymanych analogów Rycina 16. Kurkumina (C 21 H 20 O 6, 368 g/mol) 36

Rycina 17. Analog 1 (C 31 H 40 O 10, 572 g/mol) Rycina 18. Analog 2 (C 39 H 56 O 14, 748 g/mol) Rycina 19. Analog 3 (C 31 H 40 O 10, 572 g/mol) Rycina 20. Analog 4 (C 31 H 40 O 10, 572 g/mol) 37

Rycina 21. Analog 5 (C 29 H 36 O 8, 512 g/mol) Rycina 22. Analog 6 (C 49 H 76 O 20, 984 g/mol) Rycina 23. Analog 7 (C 39 H 52 O 14, 744 g/mol) Tabela 1. Otrzymane wydajności kurkuminy i analogów 1-7. Związek Wydajność [%] Kurkumina 86 Analog 1 77 Analog 2 62 Analog 3 60 Analog 4 67 Analog 5 67 Analog 6 59 Analog 7 52 38

Widma NMR i analiza elementarna analogów A Analog 1: 1 H NMR (CDCl 3 ): 3. 46 (s, 6H); 3.47 (s, 6H), 3.77-3.80 (m, 8H); 4.18-4.22 (m, 8H); 5.79 (s, 1H); 6.48 i 7.58 (AB, J= 15.7 Hz, 4H); 6.91 (d, J=8.1 Hz, 2H); 7.11-7.15 (m, 4H); 15.96 (s,1h), Analiza elementarna dla C 31 H 40 O 10 Obliczono: C 65.02%, H 7.04%, O 27.94%. Znaleziono C 65,00%, H 7,01%, O 27,95%. Analog 2: 1 H NMR (CDCl 3 ): 3. 38 (s, 6H); 3.39 (s, 6H), 3.69-3.92 (m, 16H); 4.08-4.25 (m, 8H); 5.81 (s, 1H); 6.49 i 7.58 (AB, J= 15.6 Hz, 4H); 6.97 (d, J=8.1 Hz, 2H); 7.15-7.18 (m, 4H); 16.02 (s, 1H) Analiza elementarna dla C 39 H 56 O 14. Obliczono: C 62.55%, H 7.54%, O 29.91%. Znaleziono C 62,54%, H 7,59%, O 29,89%. Analog 3: 1 H NMR (CDCl 3 ): s, 6 3. 55-3.93 (m, 2H); 3.71-3.75 (m, 4H); 4.19 (t, J= 4.9 Hz, 4H); 5.82 (s, 1H); 6.50 i 7.60 (AB, J= 15.6 Hz, 4H); 6.92 (d, J=8.2, 2H); 7.08 (broad s, 2H); 7.12 (d, J= 8.2 Hz, 2H), 16.03 (s, 1H) Analiza elementarna dla C 31 H 40 O 10 Obliczono: C 65.02%, H 7.04%, O 27.94%. Znaleziono C 65,03%, H 7,03%, O 27,98% Analog 4: 1 H NMR (CDCl 3 ): s, 6H); 3.56-3.92 (m, 24H); 4.24 (t, J= 5.1 Hz, 4H); 5.89 (s, 1H); 6.50 i 7.62 (AB, J= 15.9 Hz, 4H); 6. 93 i 7.50 (AA BB, J= 8.6 Hz, 8H); 15.98 (s, 1H) Analiza elementarna dla C 31 H 40 O 10. Obliczono: C 65.02%, H 7.04%, O 27.94%. Znaleziono C 64,97%, H 6,99%, O 27,96% Analog 5: 1 H NMR (CDCl 3 ): 3. 43 (s, 6H); 3.57-3.85 (m, 12H); 5.81 (s, 1H); 6.35 i 7.38 (AB, J= 15.9 Hz, 4H); 6.91 i 7.51 (AA BB, J= 8.7 Hz, 8H); 16.02 (s, 1H) Analiza elementarna dla C 29 H 36 O 8 Obliczono: C 67.95%, H 7.08%, O 24.97%. Znaleziono C 67,97%, H 7,10%, O 24,92% Analog 6: 1 H NMR (CDCl 3 ): 3.45 (s, 12H); 3.48 (s, 6H); 3.58-3.94 (m, 36H); 4.09-4.28 (m, 12H); 5.82 (s, 1H); 6.49 (s, 4H); 6.52 i 7.53 (AB, J= 15.6 Hz, 4H); 16.05 (s, 1H) Analiza elementarna dla C 49 H 76 O 20 Obliczono: C 59.74%, H 7.78%, O 32.48%. Znaleziono C 59.79%, H 7,74%, O 32,78% Analog 7: 1 H NMR (CDCl 3 ): m, m, (s, 1H); 6.50 i 7.76 (AB, J= 15.6 Hz, 4H); 6.95 (d, J= 8.3 Hz, 2H); 7.15-7.19 (m, 4H); 15.99 (s, 1H) Analiza elementarna dla C 39 H 52 O 14 Obliczono: C 62.89%, H 7.04%, O 30,07%. Znaleziono C 62,88%, H 7,00%, O 30,10% 4.2. Badanie aktywności biologicznej analogów kurkuminy 4.2.1. Ocena żywotności komórek Celem badań była ocena aktywności cytotoksycznej kurkuminy i nowozsyntetyzowanych analogów w odniesieniu do ludzkich prawidłowych limfocytów B GM14467 i ludzkich komórek białaczki promielocytarnej HL60. Test EZ4U umożliwia wykrywanie żywych komórek dzięki wykazywanej przez nie zdolności enzymatycznej redukcji soli tetrazoliowej o żółtej barwie do intensywnie zabarwionej 39

pochodnej formazanowej o zabarwieniu purpurowym (λ max = 492 nm). Wzrost absorpcji przy λ max = 492 nm pozostaje w liniowej zależności od liczby żywych komórek w badanej hodowli. Aktywność cytotoksyczną badanych związków określiłem na podstawie zależności procenta żywych komórek obliczanego w odniesieniu do hodowli nieeksponowanej (tj. 100 % żywych komórek) i stężenia badanego związku wyznaczając dla każdego z nich wartość IC 50, tj. stężenie powodujące 50 %-owe zahamowanie wzrostu hodowli. Związek referencyjny w ocenie aktywności cytotoksycznej nowozsyntetyzowanych analogów stanowiła aktywność cytotoksyczna kurkuminy. Kryterium wyboru spośród nowych analogów związków bardziej aktywnych od kurkuminy stanowiły: niższa w stosunku do związku referencyjnego wartość IC 50 oraz współczynnik oporności RF (IC 50 GM14467//IC 50 HL60) > 1. Jak przedstawiono na wykresie 1, wartości IC 50 wyznaczone dla kurkuminy w odniesieniu do komórek GM14467 i HL60 były porównywalne i wynosiły odpowiednio 28 M i 24 M. Współczynnik RF wyniósł ok. 1,2. Po analizie wykresów 1 8 oraz Tabeli 2, można stwierdzić, że obu warunków nie spełnił żaden z badanych analogów. Związki te wykazywały w większości porównywalną z kurkuminą lub znacznie niższą cytotoksyczność (IC 50 40 μm) względem obu rodzajów komórek (analog 4, 5, 7) bądź znacznie niższą aktywność (IC 50 > 50 μm) względem komórek nowotworowych (analog 1, 2). Najwyższa wartość RF w powyższych przypadkach mieściła się poniżej 0,8 (vide analog 7). Na podstawie uzyskanych wyników w tej części pracy, można wskazać dwa związki wyróżniające się spełnieniem przynajmniej pojedynczych z dwóch wymienionych wyżej warunków, tj. analog 3, o istotnie większej w porównaniu do kurkuminy aktywności cytotoksyczności względem komórek białaczki (IC 50 = 15 ± 2 μm, wykres 4), choć RF w tym przypadku wyniósł zaledwie 0,6 i analog 6, który wprawdzie względem komórek nowotworowych wykazał aktywność porównywalną z kurkuminą (IC 50 = 28 M), ale za to RF wyniósł ok. 1,8 (IC 50.GM14467 > 50 μm). Na podstawie przeprowadzonej oceny żywotności komórek, do dalszych badań nad aktywnością biologiczną wybraliśmy analog 3, aby prześledzić porównawczo potencjalne mechanizmy zwiększonej w stosunku do kurkuminy aktywności cytotoksycznej wobec komórek nowotworowych. 40

Wykres 1. Zależność ilości żywych komórek [% ± SD] od stężenia kurkuminy [μm]. Wykres 2. Zależność ilości żywych komórek [% ± SD] od stężenia analogu 1 [μm]. Wykres 3. Zależność ilości żywych komórek [% ± SD] od stężenia analogu 2 [μm]. 41

Wykres 4. Zależność ilości żywych komórek [% ± SD] od stężenia analogu 3 [μm]. Wykres 5. Zależność ilości żywych komórek [% ± SD] od stężenia analogu 4 [μm]. Wykres 6. Zależność ilości żywych komórek [% ± SD] od stężenia analogu 5 [μm]. 42

Wykres 7. Zależność ilości żywych komórek [% ± SD] od stężenia analogu 6 [μm]. Wykres 8. Zależność ilości żywych komórek [% ± SD]od stężenia analogu 7 [μm]. Tabela 2. Wyznaczone wartości IC 50 dla kurkuminy i analogów 1-7. Związek GM 14667 HL 60 IC 50 ±SD [ M] Kurkumina 28 ± 4 24 ± 1 Analog 1 32 ± 9 > 50 Analog 2 12 ± 1 > 50 Analog 3 9 ± 1 15 ± 2 Analog 4 29 ± 8 26 ± 2 Analog 5 > 50 > 50 Analog 6 > 50 28 ± 0 Analog 7 40 ± 1 > 50 43

4.2.2. Badanie apoptozy W ramach porównawczej oceny mechanizmów cytotoksyczności wywoływanych w komórkach przez analog 3 i kurkuminę przeprowadziłem ocenę morfologiczną komórek w poszukiwaniu cech właściwych apoptozie oraz badanie Western blot pod kątem stężenia białek pro- i antyapoptotycznych. W obu badaniach komórki GM14467 i HL60 były inkubowane przez 24 godziny z kurkuminą lub analogiem 3 w stężeniach równych odpowiednim wartościom: ½ IC 50 lub IC 50. Hodowle kontrolne stanowiły komórki nie poddawane działaniu związków. Ocena morfologiczna Do badania morfologicznych oznak apoptozy wykorzystałem metodę mikroskopową z użyciem barwnika fluorescencyjnego DAPI, specyficznego dla DNA, który w takim połączeniu fluoryzuje na niebiesko. Pozwala to uwidocznić kondensację chromatyny, fragmentację DNA, charakterystyczną dla apoptozy oraz obecność ciałek apoptotycznych tworzących się na skutek fragmentacji DNA zachodzącej podczas apoptozy. Na podstawie obserwacji mikroskopowych, morfologiczne cechy apoptozy głównie w postaci biegunowej kondensacji chromatyny zanotowałem jedynie w hodowlach komórek GM 14467 poddawanych działaniu kurkuminy lub analogu 3 w stężeniach równych właściwym wartościom IC 50, tj. 28 i 9 μm, odpowiednio (Fotografia 4 i 6). W pozostałych układach doświadczalnych z zastosowaniem komórek GM14467 poddawanych działaniu kurkuminy i wspomnianego analogu w stężeniach równych ½ właściwych wartości IC 50, tj. 14 i 5μM, odpowiednio nie stwierdziłem w badaniu mikroskopowym oznak apoptozy (Fotografia 3 i 5). Brak apoptozy zanotowałem też we wszystkich poddanych ocenie hodowlach komórek HL60 poddawanych działaniu kurkuminy i analogu 3, niezależnie od zastosowanego stężenia tych związków (Fotografia 7-11). 44

Fotografia 2. Hodowla komórek GM 14467 nieeksponowanych na związki (kontrola). Fotografia 3. Hodowla komórek GM 14467 poddawana działaniu kurkuminy w stężeniu 14 M przez 24 godziny. 45

Fotografia 4. Hodowla komórek GM 14467 poddawana działaniu kurkuminy w stężeniu 28 M przez 24 godziny (strzałkami oznaczono kondensację chromatyny). Fotografia 5. Hodowla komórek GM 14667 poddawana działaniu analogu 3 w stężeniu 5 M przez 24 godziny. 46

Fotografia 6. Hodowla komórek GM 14667 poddawana działaniu analogu 3 w stężeniu 9 mol/l przez 24 godziny (strzałkami oznaczono kondensację chromatyny). Fotografia 7. Hodowla komórek HL 60 nieeksponowanych na związki (kontrola). 47

Fotografia 8. Hodowla komórek HL 60 poddawana działaniu kurkuminy w stężeniu 12 M przez 24 godziny. Fotografia 9. Hodowla komórek HL 60 poddawana działaniu kurkuminy w stężeniu 24 M przez 24 godziny. 48

Fotografia 10. Hodowla komórek HL 60 poddawana działaniu analogu 3 w stężeniu 8 M przez 24 godziny. Fotografia 11. Hodowla komórek HL 60 poddawana działaniu analogu 3 w stężeniu 15 M przez 24 godziny. 49

Badanie stężenia białek związanych z apoptozą metodą Western blot Metoda Western blot opiera się na elektroforetycznym rozdzielaniu na żelu poliakrylamidowym białek według ich mas cząsteczkowych, w celu ich wykrycia w danej próbce, identyfikacji i oceny stężenia w komórce. Po ich transferze za pomocą odpowiednich buforów z żelu na membranę, np. nitrocelulozową ich obecność stwierdza się najczęściej za pomocą specyficznych przeciwciał pierwszo- i drugorzędowych, w tym drugim przypadku połączonych ze znacznikiem umożliwiającym zlokalizowanie na membranie w postaci prążków. Intensywność prążków pozytywnie koreluje z poziomem danego białka w badanej próbce. W niniejszej pracy oceniałem stężenie trzech białek apoptotycznych, tj.: antyapoptotycznych BCL-2 i surwiwiny i proapoptotycznego białka BAX. Ilość naniesionego na żel białka standaryzowałem względem -aktyny, jednego z podstawowych białek strukturalnych komórek. Analiza Western blot wykazała obecność wszystkich trzech białek w komórkach GM 14467, z największym stężeniem białka BCL-2 i znacznie niższym i porównywalną względem siebie pozostałych, tj. BAX i surwiwiny (Fotografia 12). Komórki białaczkowe HL 60 charakteryzowała w tym zakresie jedynie obecność i znaczne stężenie białka BCL-2 (Fotografia 13). Kurkumina w komórkach GM 14467 wyraźnie indukowała pojawienie się tylko dwóch białek, BCL-2 i BAX, ale dopiero w stężeniu równym IC 50 Nie wpływała natomiast, niezależnie od zastosowanego stężenia na poziom surwiwiny w komórce. Odmienny profil stężeń wspomnianych białek ukształtował się pod wpływem analogu 3. Stężenie związku równe ½ IC 50 i jednocześnie ok. 6-krotnie niższe od stężenia kurkuminy jako jedyne okazało się efektywne w indukcji BAX, BCL-2 i surwiwiny. Stężenie związku równe IC 50 powodowało jedynie niewielki wzrost stężenia antyapoptotycznego białka BCL-2 (Fotografia 12). W przypadku komórek HL 60, kurkumina w obu zastosowanych stężeniach bardzo nieznacznie ekspresję zwiększała stężenie białka BAX i nieco wyraźniej BCL-2 i surwiwiny, jednak bez istotnej różnicy w zależności od stężenia. Analog 3 w tych komórkach okazał się nieaktywny jako stymulator obecności wobec każdego z analizowanych białek (Fotografia 13). 50

Fotografia 12. Zdjęcie membrany nitrocelulozowej uzyskanej w analizie Western blot z widocznymi prążkami, które odpowiadają poszczególnym białkom izolowanym z komórek GM 14467 natywnych (KH) oraz poddawanych działaniu wybranych stężeń kurkuminy lub analogu 3 przez 24 godziny. Fotografia 13. Zdjęcie membrany nitrocelulozowej uzyskanej w analizie Western blot z widocznymi prążkami, które odpowiadają poszczególnym białkom izolowanym z komórek HL 60 natywnych (KH) oraz poddawanych działaniu wybranych stężeń kurkuminy lub analogu 3 przez 24 godziny. 51

4.3. Badanie właściwości ciekłokrystalicznych analogów kurkuminy (analogi B kurkuminy) Rozpuszczalne w wodzie polieterowe analogi kurkuminy 1-7 nie wykazywały właściwości ciekłokrystalicznych. Aby uzyskać właściwości ciekłokrystaliczne pochodne kurkuminy zostały zmodyfikowane poprzez wprowadzenie po jednym, dwóch lub trzech podstawnikach oktoksylowych do każdego pierścienia aromatycznego, oraz poprzez zastąpienie układu diketonowego pirazolem, N-metylopirazolem lub izoksazolem. 4.3.1. Synteza ciekłokrystalicznych analogów kurkuminy (analogi B kurkuminy) Dla analogów z grupy B zastosowano w pracy numerację od 8 do 27. Z pośród otrzymanych analogów właściwości ciekłokrystaliczne wykazywały związki oznaczone numerami 13, 16, 23 oraz 26. Wzory wymienionych związków zamieszczono na Rycinie 24 [126]. 52

Rycina 24. Wzory strukturalne otrzymanych analogów kurkuminy, a=tlenek boru, acetyloaceton, boran tributylu, butyloamina i kwas solny, b= hydrazyna, c=metylohydrazyna, d=hydroksyloamina. 53

4.3.2. Widma NMR i analiza elementarna analogów B Analog 8 1 H NMR (CDCl 3 ): 0.85 1.85 (30H, m); 3.98 (4H, t, J=6.6);5.77 (H, s); 6.49 i 7.61 (4H, AB, J=15.9); 6.90 i 7.49 (8H, AA BB, J= 8.8), 16.09 (H,szeroki s) Analiza elementarna dla C 35 H 48 O 4 Obliczono: C 78.91%, H 9.08%. Znaleziono C 78.86%, H 9.18%, Analog 9 1 H NMR (CDCl 3 ): 0.85 1.90 (30H, m); 3.91 (6H, s);4.04 (4H, t, J=6.9 Hz); 5.81 (H, s); 6.49 i 7.60 (4H, AB, J=15.6 Hz); 6.87 (2H, d, J=8.4 Hz); 7.07 (2H,d, J=1.9 Hz);7.15 (2H, dd, J= 1.9, 8.4 Hz); 16.07 (H, szeroki s) Analiza elementarna dla C 37 H 52 O 6 Obliczono: C 74.97%, H 8.84%. Znaleziono C 74.83%, H 8.56%. Analog 10 1 H NMR (CDCl 3 ): 0.85 1.88 (60H, m); 4.01-4.04 (8H, m); 5.80 (H, s); 6.47 i 7.58 (4H, AB, J= 15.7); 6.86 (2H, d, J= 8.4 Hz); 7.09 (2H, d, J= 1.9 Hz); 7.10 (2H, dd, J= 1.9, 8.4 Hz); 16.07 (H, szeroki s) Analiza elementarna dla C 51 H 80 O 6 Obliczono: C 77.62%, H 10.22%. Znaleziono C 77.68%, H 10.01%. Analog 11 1 H NMR (CDCl 3 ): 0.85 1.86 (90H, m); 4.01 (4H, t, J=6.6); 5.84 (H, s); 6.48 i 7.55 (4H, AB, J= 15.7); 6.75 (4H, s); 15.93 (H, szeroki s). Analiza elementarna dla C 67 H 112 O 8 Obliczono: C 76.96%, H 10.80. Znaleziono C 76.72%, H 10.50%. Analog 12 1 H NMR (CDCl 3 ): 0.88 1.80 (30H, m); 4.34-4.43 (2H, m); 5.78 (H, s); 6.49 i 7.61 (4H, AB, J= 15.9); 6.89 i 7.49 (8H, AA BB, J= 8.8 Hz), 16.09 (H, szeroki s). Analiza elementarna dla C 35 H 48 O 4 Obliczono: C 78.91%, 9.08%. Znaleziono C 78.83%, H 9.14%. Analog 13 1 H NMR (CDCl 3 ): 0.85 1.82 (30H, m); 3.91 (4H, t, J=6.6);6.57 (H, s); 6.78 i 7.33 (8H, AA BB, J=8.7); 6.91 i 7.04 (4H, AB, J= 16.5) Analiza elementarna dla C 35 H 48 N 2 O 2 Obliczono: C 79.50%, H 9.15%, N 5.30%. Znaleziono C 79.31%, H 8.93%, N 5.56% Analog 14 1 H NMR (CDCl 3 ): 0.86 1.88 (30H, m); 3.83 (6H, s); 3.99 (H, t, J= 6.8); 6.60 (H, s); 6.77 (2H, d, J= 8.3); 6.92 i 7.04 (4H, AB, J=16.3); 6.95 (2H, dd, J= 1.8, J= 8.3); 6.99 (2H, d, J= 1.8) Analiza elementarna dla C 37 H 52 N 2 O 4 Obliczono: C 75.47%, H 8.90%, N 4.76%. Znaleziono C 75.60%, H 9.06%, N 4.65%. Analog 15 1 H NMR (CDCl 3 ): 0.85 1.85 (60H, m); 3.95 (4H, t, J= 8.8); 3.96 (4H, t, J= 8.8); 6.58 (H, s); 6.76 (2H, d, J= 8.3); 6.92 i 7.11 (4H, AB, J= 16.4); 6.94 (2H, dd, J= 2.0, 8.3); 7.00 (2H, d, J= 2.0). Analiza elementarna dla C 51 H 80 N 2 O 4 Obliczono: C 79.50%, H 9.15%, N 5.30%. Znaleziono C 79.31%, H 8.93%, N 5.56% Analog 16 1 H NMR (CDCl 3 ): m); 3.95-4.01 (12H, m); 6.58 (H, s); 6.68 (4H, s); 6.91 i 6.97 (4H, AB, J=16.4) Analiza elementarna dla C 67 H 112 N 2 O 6 Obliczono: C 77.26%, H 10.84%, N 2.57%. Znaleziono C 77,26%, H 7,59%, O 29,89% Analog 17 1 H NMR (CDCl 3 ): 0.84 1.80 (32H, m); 4.30-4.37 (2H, m);6.60 (H, s); 6.80 (4H, d, J= 8.79) 6.95 i 7.10 (4H, AB, J= 16.4) Analiza elementarna dla C 35 H 48 N 2 O 2 Obliczono: C 79.50%, H 9.15%, N 5.30%. Znaleziono C 79.49%, H 8.94%, N 5.55% Analog 18 1 H NMR (CDCl 3 ): 0.86 1.83 (30H, m); 3.90 (3H, s); 3.96 (2H, t, J= 6.7); 3.98 (2H, t, J= 6.7); 6.60 (H,s); 6.75 i 7.00 (4H, AB, J= 16.1); 6.85-6.91 (4H, m); 6.93 i 7.05 (2H, AB, 54

J= 16.4); 7.39-7.44 (4H,m) Analiza elementarna dla C 36 H 50 N 2 O 2 Obliczono: C 79.66%, H 9.28%, N 5.16%. Znaleziono C 79.57%, H 9.13%, N 5.01% Analog 19 1 H NMR (CDCl 3 ): 0.86 1.90 (30H, m); 3.90 (3H, s); 3.92 (3H, s); 3.93 (3H,s); 4.02 (2H, t, J= 7.1); 4.04 (2H, t, J= 7.1); 6.62 (H,s); 6.75 (H, d, J=16.1); 6.84-6.91 (H, d, J= 8.3); 6.87 (1H, d, J= 8.1); 6.95 (H, d, J= 16.4); 76.97-7.09 (6H,m) Analiza elementarna dla C 38 H 54 N 2 O 4 Obliczono: C 75.44%, H 9.01%, N 4.48%. Znaleziono C 75.60%, H 9.06%, N 4.65% Analog 20 1 H NMR (CDCl 3 ): 0.85 1.89 (60H, m); 3.91 (3H, s); 3.98-4.07 (8H, m); 6.61 (H,s); 6.74 (h, d, J= 16.1); 6.84-6.91 (H, d, J= 8.30; 6.86 (H, d, J= 8.1);6.93 (H, d, J= 16.4); 6.95-7.09 (6H,m) Analiza elementarna dla C 52 H 82 N 2 O 4 Obliczono: C 78.15%, H 10.34%, N 3.50%. Znaleziono C 77.95%, H 10.07%, N 3.70%. Analog 21 1 H NMR (CDCl 3 ): 0.85 1.87(90H, m); 3.93 (3H, s); 3.95-4.05 (12H, m); 6.62 (H,s); 6.69 (2H,s);6.70 (2H, s)6.76 i 6.96 (2H, AB, J= 16.4); 6.97 i 7.00 (2H, AB, J= 16.6); 7.39-7.44 (4H,m) Analiza elementarna dla C 68 H 114 N 2 O 6 Obliczono: C 79.66%, H 9.28%, N 5.16%. Znaleziono C 79.57%, H 9.13%, N 5.01% Analog 23 1 H NMR (CDCl 3 ): m t, J t, J=6.6); 6.40 (H, s); 6.80 i 7.29 (4H, AB, J= 16.4); 6.98 i 7.10 (4H, AB, J=16.5); 6.90 i 7.45 (8H,AA BB, J-8.7) Analiza elementarna dla C 35 H 47 NO 3 Obliczono: C 79.35%, H 8.94%, N 2.64%. Znaleziono C 79,41%, H 9.15%, N 2.40% Analog 24 1 H NMR (CDCl 3 ): m s, s); 4.03 (2H, t, J= 6.8); 4.04 (2H, t, J= 6.8); 6.42 (H, s); 6.82 i 7.29 (2H, AB, J= 16.3); 6.85-6.89 (2H aromat,m); 7.00 i 7.11 (2H, AB, J=16.3); 7.02-7.09 (4H aromat,m) Analiza elementarna dla C 37 H 51 NO 3 Obliczono: C 75.35%, H 8.72%, N 2.37%. Znaleziono C 75,40%, H 8.40%, N 2.47%. Analog 25 1 H NMR (CDCl 3 ): m m); 6.40 (H, s); 6.80 i 7.27 (2H, AB, J= 16.3); 6.86(H,d, J= 8.4); 6.87 (H, d, J= 8.1); 6.97 i 7.08 (2H, AB, J=16.3); 7.01-7.10 (4H,m) Analiza elementarna dla C 51 H 79 NO 5 Obliczono: C 77.91%, H 10.13%, N 1.78%. Znaleziono C 77,96%, H 10.23%, N 1.64%. Analog 26 1 H NMR (CDCl 3 ): m); 3.96-4.04 (12H, m); 6.42 (H, s); 6.72 (2H, s); 6.73 (2H, s); 6.82 i 7.25 (2H, AB, J=16.3); 7.00 i 7.06 (2H, AB, J= 16.3). Analiza elementarna dla C 68 H 113 NO 7 Obliczono: C 77.30%, H 10.78%, N 1,33%. Znaleziono C 77.14, H 10.45%, N 1.29% Analog 27 1 H NMR (CDCl 3 ): m m); 6.41 (H, s); 6.82 i 7.30 (2H, AB, J= 16.4); 6.89 (4H,d, J= 8.74); 6.99 i 7.12 (2H, AB, J=16.6); 7.45 (4H,d, J=1.8) Analiza elementarna dla C 35 H 47 NO 3 Obliczono: C 79.35%, H 8.94%, N 2.64%. Znaleziono C 79,11%, H 9.12%, N 2.36%. 4.3.3.Właściwości ciekłokrystaliczne analogów kurkuminy (analogi B ) Żaden z otrzymanych analogów kurkuminy z zachowaniem układu -diketonowego nie wykazywał właściwości ciekłokrystalicznych. Właściwości takie wykazywały jednak pewne 55

pochodne pirazolowe i izoksazolowe. Sekwencje fazowe otrzymanych związków przedstawia Tabela 3. Wzory strukturalne otrzymanych analogów znajdują się na Rycinie 9. Tabela 3 Analog Przejścia fazowe badanych związków analogów B kurkuminy. Sekwencja fazowa 8 Cr, T = 147.0ºC (ΔH = 36.9) I 9 Cr, T = 108.3ºC (ΔH = 42.7) I 10 Cr, T = 79.8ºC (ΔH = 60.5) I 11 T t poniżej pokojowej 12 Cr, T = 64.1ºC (ΔH = 22.8) I 13 Cr, T = 126.0ºC (ΔH = 9.1) SmC, T = 222.5ºC (ΔH = 0.5) SmA, T = 230.9ºC (ΔH = 4.4) I 14 Cr, T = 103ºC (ΔH = 33.7) I 15 Cr, T = 104.9ºC (ΔH = 58.2) I 16 T t poniżej pokojowej, Col h, T = 37.1ºC (ΔH = 2.5) I 17 Cr, T = 62.4ºC (ΔH = 17.0) I 18 Cr, T = 92.9ºC (ΔH = 48.4) I 19 Cr, T = 75.14ºC (ΔH = 7.7) I 20 Cr, T = 68.75ºC (ΔH = 47.0) I 21 T t poniżej pokojowej 23 Cr, T = 123.1ºC (ΔH = 38.1) SmC, T = 189.8ºC (ΔH = 2.2) N, T = 209.5ºC (ΔH = 1.6) I 24 Cr, T = 117.3ºC (ΔH = 38) I 25 Cr, T = 97.4ºC (ΔH = 42.8) I 26 T t poniżej pokojowej, Col h, T = 34.9ºC (ΔH = 2.6) I 27 Cr, T = 67.3ºC (ΔH = 11.9) I T t temperatura topnienia, T temperatura przejścia fazowego, ΔH entalpia przejścia fazowego (w kj/mol), I faza izotropowa, SmA smektyk A, SmC smektyk C, N nematyk, Col h faza kolumnowa heksagonalna, Cr kryształ. Właściwości ciekłokrystaliczne (Tabela 3) wykazywały jedynie pochodne pirazolu (analog 13 i 16) oraz izoksazolu (analog 23 i 26). Poniżej zamieszczam zdjęcia tekstur ciekłokrystalicznych otrzymanych analogów kurkuminy. 56

Fotografia 14. Tekstura smektyku C, analog 13 (T=159 C), tzw. tekstura schlierenowa. Fotografia 15. Tekstura smektyka A, analog 13 (T=224 C),tzw. tekstura wachlarzowa. 57

Fotografia 16. Tekstura smektyku C, analog 23 (T=170 C), tzw. tekstura schlierenowa. Fotografia 17. Tekstura nematyku, analog 23 (T=207 C) tzw. tekstura schlierenowa. 58

Fotografia 18. Tekstura fazy kolumnowej heksagonalnej, analog 16 (T=27 C). Fotografia 19. Tekstura fazy kolumnowej heksagonalnej, analog 26 (T=25 C). 59

Wyniki badań właściwości ciekłokrystalicznych analogów kurkuminy zostały opublikowane w pracy: Krówczyński, A.; Zep A.;. Kuć K.; Deptuła T.; Salomończyk M.; Górecka E.; Szydłowska J., Liquid crystalline analogues of curcumin. Liquid crystals 2014, 41(5), 685-693 Studia literaturowe zostały zebrane w publikacji: Deptuła, T.; Gruber B.; Krówczyński, A. Kurkumina i Jej Pochodne - Zastosowanie w Terapii Przeciwnowotworowej i Chemoochronnej. Postępy Fitoterapii 2014, 3, 155 165 Publikacje są dołączone do niniejszej rozprawy. Publikacja z badań biologicznych analogów rozpuszczalnych w wodzie - w przygotowaniu. 60

5. Dyskusja Polieterowe analogi kurkuminy (analogi A ), opisane w niniejszej pracy, zostały otrzymane w oparciu o metodę zaproponowaną przez Pabona w wyniku kondensacji aldehydów podstawionych łańcuchem polieterowym z acetyloacetonem [124]. Analogi tego rodzaju nie zostały dotychczas opisane w literaturze i w związku z tym, ich aktywność biologiczna nie była dotąd znana. W publikacji J. Chittigori i wsp. opisano jedynie syntezę mieszaniny takich analogów, o łańcuchach polieterowych różnej długości; bez przeprowadzenia na niej badań biologicznych [152]. Według doniesień literaturowych, zamiana grupy hydroksylowej przy pierścieniu aromatycznym kurkuminy na eter metylowy zwiększa aktywność cytotoksyczną związku, co wykazano w badaniach z użyciem ludzkich komórek raka piersi (MCF-7, SKBr3), płuc (A-549), nerki (CAKI-1, białaczki (HCT-8), czerniaka (SKME L -2), mózgu (U-87-MG), kości (a HOS), wątroby (HepG2) i prostaty (PC-3, LNCaP) [12, 127, 137]. Ponadto, związki po powyższej modyfikacji wykazują większą stabilność zarówno w warunkach in vitro, jako dodatek do pożywki komórkowej, jak i in vivo, w organizmie człowieka [10, 137]. Z tych względów, podjęto próby zmodyfikowania cząsteczki kurkuminy polegającego na wprowadzeniu polieterowych (tj. 3,6-dioksaheptoksylowych) podstawników do pierścienia aromatycznego w miejsce grupy hydroksylowej lub metoksylowej. Wprowadzenie podstawnika lub podstawników polieterowych, zawierających w swojej strukturze atomy tlenu, mogące tworzyć wiązania wodorowe z cząsteczkami wody wpływa na zwiększenie rozpuszczalności otrzymanych związków w wodzie i poprawę, tym samym, parametrów farmakokinetycznych ewentualnych produktów leczniczych zawierających omawiane związki. Wszystkie otrzymane w ramach opisywanej pracy analogi z grupy A wykazywały lepszą w stosunku do kurkuminy rozpuszczalność w wodzie. Lepszą rozpuszczalność w wodzie zawdzięczają te związki wprowadzeniu podstawnika polieterowego, co znajduje potwierdzenie w licznych doniesieniach literaturowych. [153-155] W przeprowadzonych badaniach aktywności biologicznej otrzymanych analogów grupy A uwzględniono aktywność cytotoksyczną i apoptotyczną wobec ludzkich prawidłowych limfocytów B oraz limfocytów białaczkowych, w odniesieniu do niezmodyfikowanej cząsteczki kurkuminy. Z danych literaturowych wynika, że zacetylowanie grupy hydroksylowej kurkuminy nie wpływa na aktywność cytotoksyczną związku [3, 29, 140]. Wiadomo też, że do zachowania aktywności biologicznej kurkuminy konieczny jest atom tlenu w pierścieniu aromatycznym, zaś 61

wiązania eterowe mogą zapewnić większą stabilność związków in vivo. Zastąpienie wspomnianego atomu tlenu innym atomem powoduje utratę aktywności przeciwnowotworowej związku [127]. Stąd, opisane w niniejszej pracy modyfikacje obejmowały wprowadzenie do cząsteczki podstawników połączonych z pierścieniem aromatycznym poprzez atomy tlenu. Znaczenie obecności podstawników metoksylowych dla aktywności cytotoksycznej związków jest szeroko opisywane w literaturze [12, 127, 137]. Dla potwierdzenia, uzyskany w opisywanej pracy analog 3 kurkuminy, w którym grupa metoksylowa w pozycji meta- (podobnie, jak w kurkuminie) została zachowana, a podstawnik polieterowy został dołączony do grupy hydroksylowej w pozycji para-, wykazywał najwyższą aktywność spośród nowozsyntetyzowanych związków w porównaniu z aktywnością określoną dla kurkuminy, tj. 3- krotnie wyższą względem badanych komórek prawidłowych i 1,5-krotnie wyższą względem badanych komórek nowotworowych. Związek ten został zmodyfikowany przez podstawienie dwóch grup hydroksylowych podstawnikami polieterowymi, tj. 3,6-dioksaheptoksylowymi. Większość pozostałych związków (analogi 1, 2, 4, 5, 7), których modyfikacje polegały na wprowadzeniu jednego, dwóch lub trzech podstawników polieterowych do każdego pierścienia aromatycznego kurkuminy w miejsce grupy hydroksylowej lub metoksylowej, charakteryzowała się porównywalną lub wręcz słabszą od kurkuminy aktywnością cytotoksyczną. Powyższe obserwacje mogą wskazywać na istotną rolę podstawnika metoksylowego w pozycji meta- dla aktywności cytotoksycznej badanych związków. Niestety, zadowalająca aktywność wspomnianego analogu nie była jednocześnie wybiórcza, czego oczekiwano w odniesieniu do komórek nowotworowych. Komórkoselektywność zaobserwowano wyłącznie dla analogu 6. Analog ten nie posiadał podstawników metoksylowego i hydroksylowego. Zamiast nich, do każdego pierścienia aromatycznego dołączono trzy podstawniki 3,6- dioksaheptoksylowe. Analog ten wykazywał porównywalną z kurkuminą aktywność względem badanych komórek nowotworowych. Nie stwierdzono przy tym, zgodnie z oczekiwaniami, wpływu tego analogu na badane komórki prawidłowe w badanym zakresie stężeń. Właściwość ta jest korzystna dla potencjalnego zastosowania terapeutycznego badanego związku, ponieważ umożliwia podanie pacjentowi większej dawki związku bez szkody dla zdrowych komórek organizmu. Dodatkowo, analog 6 posiada w cząsteczce najwięcej spośród zsyntetyzowanych analogów elementów hydrofilowych, tj. podstawników polieterowych, co skutkuje najlepszą spośród badanych związków rozpuszczalnością w wodzie i, co za tym idzie, konkurencyjną w stosunku do nich biodostępnością [24, 31, 110, 128]. W zestawieniu z efektami wywołanymi przez analog 3 62

wydaje się, że zwiększenie liczby podstawników polieterowych, przy jednoczesnym usunięciu grup metoksylowych nie zwiększa cytotoksyczności związku. Mimo, że związek taki wykazuje lepszą rozpuszczalność. [27, 31, 127]. Porównując aktywność cytotoksyczną analogów 1 i 2 można zauważyć, że wydłużenie łańcucha polieterowego miało znaczenie wybiórczo dla aktywności biologicznej względem badanych komórek prawidłowych. Analog 2 zawierający w swojej strukturze łańcuchy 3,6- dioksaheptoksylowe wykazywał bowiem prawie 3-krotnie wyższą aktywność cytotoksyczną względem tych komórek w porównaniu z analogiem 1 zawierającym łańcuchy 3-oksybutylowe. Natomiast liczba łańcuchów polieterowych w cząsteczce nie wpływa na aktywność analogów względem komórek prawidłowych, co widać na przykładzie analogów 2, 5 i 6. Najwyższą aktywność względem komórek prawidłowych spośród nich wykazywał analog 2 (IC 50 = 12 M) posiadająca dwa łańcuchy polieterowe przy każdym pierścieniu aromatycznym. IC 50 dla pozostałych analogów 5 i 6 posiadających odpowiednio jeden lub trzy takie łańcuchy przy pierścieniu aromatycznym było wyższe od 50 M. W komórkach nowotworowych, najwyższą aktywność spośród omawianych analogów, choć nieco słabszą od kurkuminy wykazał analog 6 posiadająca trzy łańcuchy polieterowe przy każdym pierścieniu aromatycznym (IC 50 = 28 M). Pozostałe związki, tj. 2 i 5 zawierające w strukturze odpowiednio dwa i jeden łańcuch polieterowy przy pierścieniu aromatycznym wykazywały wartość IC 50 przekraczającą 50 M. Z kolei, z porównania aktywności analogów 2 i 7 względem komórek prawidłowych wynika, że analogi kurkuminy zawierające pierścieniowy polieter (analog 7) są mniej cytotoksyczne względem komórek prawidłowych niż analogi zawierające łańcuchy polieterowe o takiej samej liczbie atomów węgla jednak nie połączone w pierścień (analog 2). Analog 7 wykazywał bowiem 3,5 razy niższą aktywność cytotoksyczną od analogu 2 względem komórek prawidłowych. Analog 4 (analog izokurkuminy) posiada w swej strukturze podstawniki identyczne z analogiem 3, tyle, że w położeniu odwrotnym - grupę metoksylową w pozycji para-, a podstawnik 3,6- dioksaheptoksylowy w pozycji meta-. Aktywność cytotoksyczna tego analogu okazała się być zbliżona do aktywności związku macierzystego kurkuminy względem obu linii komórkowych, jednocześnie 3-krotnie niższa niż aktywność analogu 3 względem komórek prawidłowych i 2-krotnie niższa niż analogu 3 względem komórek nowotworowych. Jak zanotowali Deters i wsp. w przypadku kurkuminy i izokurkuminy nie modyfikowanej, takie różnice w aktywności cytotoksycznej nie występują [3]. 63

W świetle wyników uzyskanych w omawianej pracy można zatem wnioskować, że wpływ na aktywność cytotoksyczną związku może mieć wzajemne położenie podstawnika metoksylowego i polieterowego (3,6- dioksaheptoksylowego). Wyższą aktywność cytotoksyczną wykazuje, bowiem związek, w którym grupa metoksylowa znajduje się w takim samym położeniu jak w niezmodyfikowanej kurkuminie, tj. w pozycji meta-. Niestety, zwiększona wspomniana aktywność nie idzie w parze z wybiórczością tego efektu względem komórek nowotworowych, co jest niekorzystne z terapeutycznego punktu widzenia. Jak dotąd, nie przeprowadzono badań wpływu stopnia hydrofilowości analogów kurkuminy na ich aktywność cytotoksyczną [27, 31, 127]. Tym bardziej interesujące są wyniki uzyskane w niniejszej pracy, w której analogi pozbawione grupy metoksylowej (analogi 1, 2, 5, 6, 7), zastąpionej podstawnikiem polieterowym (analogi 1, 2, 6, 7) lub atomem wodoru (analog 5), mimo swojej lepszej rozpuszczalności w wodzie, wykazywały zbliżoną lub ponad dwukrotnie niższą aktywność względem komórek nowotworowych w porównaniu do kurkuminy. Pożądany efekt uzyskano przy tym w odniesieniu do komórek prawidłowych. Aktywność cytotoksyczna okazała się bowiem zbliżona bądź znacząco niższa od kurkuminy. Wyjątek stanowił analog 2 oddziaływujący niekorzystnie w sensie przeżycia na prawidłowe i korzystnie na nowotworowe komórki. W stosunku do kurkuminy analog ten różni się brakiem wolnej grupy hydroksylowej oraz grupy metoksylowej. W miejsce wyżej wymienionych grup wprowadzono dwa podstawniki polieterowe do każdego pierścienia aromatycznego. Brak aktywności przeciwnowotworowej analogu 2 może wynikać z braku grupy metoksylowej i jednocześnie potwierdzać jej znaczenie dla aktywności przeciwnowotworowej i/lub z utrudnionej penetracji przez błonę komórkową dla związków hydrofilowych, którą to właściwość nadają cząsteczce podstawniki polieterowe. W oparciu o przeprowadzone badania można wskazać kierunki dalszych prac nad modyfikacjami cząsteczki kurkuminy, aby uzyskać związek bardziej od niej cytotoksyczny i zarazem selektywny względem komórek nowotworowych. Optymalnym rozwiązaniem zdawałoby się połączenie w jednej strukturze cech analogu 3 i analogu 6. Zatem, najbardziej odpowiednimi związkami bazowymi do dalszych modyfikacji struktury wydają się analog 3 (wykazujący największą aktywność cytotoksyczną) i analog 6 (największa selektywność w stosunku do komórek nowotworowych). Na podstawie opisanych badań można wskazać, jakie modyfikacje łącznie należało by wziąć pod uwagę w dalszych planach na polu poszukiwań skutecznych i selektywnych analogów kurkuminy, tj. wprowadzenie formy pierścieniowej podstawników polieterowych, z ukierunkowaniem na podstawnik 3,6-dioksoheptylowy (selektywność działania) i pozostawienie grupy metoksylowej w pozycji meta-, przy 64

jednoczesnym wprowadzeniu podstawnika polieterowego w pozycje para- (stosunkowo wysoka aktywność cytotoksyczna); Zważywszy na znaczenie dla aktywności cytotoksycznej pozycji poszczególnych podstawników w cząsteczce zsyntetyzowanych i przebadanych analogów, warto było by zsyntetyzować i ocenić także związki z uwzględnieniem pozycji orto- w rozmieszczeniu podstawników przy pierścieniu aromatycznym. Według doniesień literaturowych, kurkumina wykazuje zdolność wywoływania apoptozyselektywnie w komórkach nowotworowych, przy braku takiego działania na komórki prawidłowe [38, 60]. W niniejszej pracy udało się potwierdzić selektywność w zakresie aktywności cytotoksycznej jedynie w przypadku analogu 6, jednak nie notowano podobnej wybiórczości efektu indukowania apoptozy. Obiecujący w badaniach aktywności cytotoksycznej analog 3 o najniższych wartościach IC 50 względem obu rodzajów komórek spośród badanych związków w zastosowanych warunkach doświadczalnych nie indukowała apoptozy w badanych komórkach nowotworowych w żadnym z zastosowanych stężeń, a jedynie w komórkach prawidłowych, w stężeniu równym wartości IC 50. W świetle wyników uzyskanych w badaniach poziomu białek związanych z apoptozą, BCL-2, BAX i surwiwiny, wskazujących na zauważalną indukcję białek proi antyapoptotycznych i widoczne cechy apoptozy głównie w komórkach prawidłowych pod wpływem kurkuminy i analogu 3, trudno określić związek aktywności cytotoksycznej badanych analogów z indukcją programowanej śmierci komórki. Brak wpływu kurkuminy na stężenie surwiwiny w komórce, obserwowany w prawidłowych limfocytach B jest zgodny z wynikami badań Zhu i wsp. [59], prowadzonych na prawidłowych ludzkich komórkach nabłonka oskrzeli BEAS-2B. Komórki eksponowano przez 24 godziny na kurkuminę w stężeniu 50 M, warunki hodowli i czas ekspozycji były identyczne jak w niniejszej pracy. Dla niższych stężeń kurkuminy (5 M) również nie zaobserwowano wzrostu stężenia surwiwiny [33, 59]. Jeśli chodzi o komórki nowotworowe, Bush i wsp. badając ludzkie komórki czerniaka linii: MMAN, MMRU, RPEP, PMWK, Sk-mel-2, Sk-mel-5, Sk-mel-28 i MEWO notowali brak wpływu kurkuminy na białko BCL-2 [55]. W niniejszej pracy nieznaczny wzrost stężenia białka BCL-2 w badanych ludzkich komórkach białaczki promielocytarnej HL 60 obserwowano, co może świadczyć o komórkospecyficzności zjawiska. Badania Kuo i wsp. wskazują też na zależność wpływu kurkuminy na poziom białek związanych z apoptozą od stężenia związku. Autorzy w przypadku komórek HL60 eksponowanych na kurkuminę w stężeniu 19 mm przez 65

okres od 1 do 12 godzin stwierdzili spadek stężenia BCL-2 podobnie, jak w ludzkich komórkach raka prostaty DU145 i LNCaP [45, 156]. Nie zostały opisane w literaturze produkty metabolizmu polieterowych pochodnych kurkuminy. Można się spodziewać, że typowa dla kurkuminy przemiana metaboliczna polegająca na sprzężeniu kurkuminy z resztą kwasu siarkowego lub glukozą poprzez grupę fenolową w pierścieniu aromatycznym nie zachodzi lub jest utrudniona. Ma to związek z zablokowaniem grup hydroksylowych w pierścieniu aromatycznym przez podstawnik polieterowy. W związku z tym można się spodziewać zmniejszenia tempa metabolizmu otrzymanych w ten sposób analogów kurkuminy. Jedną z możliwych ścieżek metabolicznych, którymi potencjalnie mogę ulegać polieterowe analogi kurkuminy jest przemiana w polieterowe analogi kwasu ferulowego. Jednak jak dotąd nie wiadomo nic o właściwościach biologicznych tak zmodyfikowanej cząsteczki tego kwasu. Wiadomo, że sam kwas ferulowy jest praktycznie nieaktywny biologicznie [3]. Alternatywna ścieżka metabolizmu związku może prowadzić przez hydrolizę wiązania polieterowego do wolnej kurkuminy. Właściwości ciekłokrystaliczne wykazują jedynie analogi kurkuminy, które posiadają w pierścieniach aromatycznych po jednym lub po trzy łańcuchy oktoksylowe. Dodatkowo związki takie muszą zawierać w swojej strukturze pierścień pirazolowy lub izoksazolowy. Związki, zawierające układ - diketonowy lub zawierające N-metylopirazol nie są mezogenami. Opisane przez Barbera i wsp. pochodne pirazolu i izoksazolu nie posiadające łącznika winylowego, a więc o krótszym rdzeniu mezogenicznym wykazują właściwości ciekłokrystaliczne w wyraźnie mniejszym zakresie temperatur [157]. Niezależnie od obecności czy braku łącznika winylowego pochodne pirazolowe wykazują szerszy zakres faz smektycznych niż pochodne izoksazolowy. Może mieć to związek z możliwością tworzenia międzycząsteczkowych wiązań wodorowych przez cząsteczki pirazolu, co prowadzi do dimeryzacji. Tworzenie takich wiązań sprzyja uporządkowaniu środków ciężkości molekuł. Nie ma natomiast wpływu na trwałość faz kolumnowych analogów posiadających po trzy łańcuchy oktyloksylowe w pierścieniach aromatycznych. Rycina 25. Dimery pirazolowe. 66