MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2010, 62: 181-188 Aleksander Masny 1, Hanna Żarnowska-Prymek 2,3, Danuta Cielecka 4, Ruslan Salamatin 4,5, Elżbieta Gołąb 1 ROZPOZNAWANIE IZOLOWANYCH OD LUDZI NICIENI Z RODZAJU DIROFILARIA PRZY ZASTOSOWANIU TECHNIK BIOLOGII MOLEKULARNEJ 1 Zakład Parazytologii Lekarskiej NIZP-PZH Kierownik: prof. dr hab. T.H. Dzbeński 2 Klinika Chorób Odzwierzęcych i Tropikalnych WUM w Warszawie p.o. Kierownika Kliniki: dr n. med. M. Olszyńska-Krowicka 3 Wojewódzki Szpital Zakaźny w Warszawie 4 Zakład Biologii Ogólnej i Parazytologii WUM w Warszawie Kierownik: B. Grytner-Zięcina 5 Instytut Zoologii im. I.I. Schmalhausena NAN Ukrainy, Kijów Przedstawiono opis procedur zaadaptowanych do izolacji i wykrywania DNA pasożytów z rodzaju Dirofilaria w materiale izolowanym od ludzi i przechowywanym w: etanolu (24 tygodnie), formalinie (46 tygodni) lub zatopionym w bloczkach parafinowych (25 tygodni). Najwyższą czułość PCR obserwowano dla próbek DNA uzyskanych z robaków przechowywanych w etanolu, a najniższą dla próbek pochodzących z materiału przechowywanego w formalinie. Izolacja DNA z pasożyta utrwalonego w formalinie była trudniejsza niż w wypadku pozostałych preparatów, a produkty jego powielania były wykrywalne tylko w Real Time PCR. Uzyskane wyniki pokazują, że metody molekularne są stosunkowo łatwym w użyciu sposobem identyfikacji nicieni z rodzaju Dirofilaria obecnych w materiale klinicznym utrwalonym na różne sposoby. Wskazane jest niestosowanie formaliny do przechowywania materiału, który ma być użyty do diagnostyki opartej o PCR. Dirofilarioza jest chorobą odzwierzęcą wywoływaną przez nicienie pasożytnicze z rodzaju Dirofilaria. W rodzaju tym znajduje się obecnie 27 gatunków, spośród których największe znaczenie dla medycyny ludzkiej i weterynaryjnej mają D. repens i D. immitis. Psy stanowią główny rezerwuar tych nicieni, a wektorem przenoszącym zarażenie również na ludzi są komary, u których dochodzi do rozwoju larw inwazyjnych (L3) (4). Przez wiele lat uważano, że występowanie Dirofilaria w Europie jest ograniczone do obszarów leżących w strefie klimatu śródziemnomorskiego. W ostatnim dziesięcioleciu zaobserwowano jednak rozprzestrzenianie się zarażeń tymi pasożytami także w krajach o klimacie umiarkowanym, np. w Holandii (12), Słowacji (1, 11), oraz na Ukrainie (8, 9).
182 A. Masny i inni Nr 2 U ludzi objawy dirofilariozy, w postaci guzków podskórnych i narządowych, są czasem klasyfikowane jako zmiany o charakterze nowotworowym, a podwyższone ryzyko błędnych rozpoznań jest szczególnie wysokie w krajach uznawanych za wolne od inwazji wywoływanych przez Dirofilaria (5). Polska należy do tej grupy krajów, ponieważ dopiero w 2008 roku, po raz pierwszy opisano 5 przypadków dirofilariozy D. repens u polskich pacjentów (15) natomiast w 2009 roku pojawiło się pierwsze doniesienie o występowaniu dirofilariozy u psów (6). Wprawdzie udowodnione rodzime zarażenia wykryto tylko u psów, jednak przy występowaniu w naszym kraju komarów należących do wektorów dirofilarii można założyć, że inwazje te obejmują także ludzi. W tej sytuacji niezbędna wydaje się akcja informacyjna, efektem której byłoby uwzględnianie dirofilariozy jako jednego z możliwych etiologicznych czynników guzków podskórnych i narządowych. Istotne znaczenie ma również opracowanie i wprowadzenie do laboratoriów, właściwych dla rozpoznania dirofilariozy, procedur badawczych. Celem niniejszej pracy była adaptacja procedur molekularnego rozpoznawania nicieni z rodzaju Dirofilaria. MATERIAŁ I METODY Izolaty uzyskane od ludzi. Zbadano trzy utrwalone nicienie pobrane w 2009 roku z tkanek trzech pacjentów z podejrzeniem choroby pasożytniczej (Tabela I). Na podstawie cech morfologicznych takich jak: długość i średnica ciała, ułożenie włókien i komórek mięśniowych, wygląd hypodermy i jej bocznych listewek, grubość i urzeźbienie wielowarstwowego oskórka określono, że nicienie te należą do gatunku Dirofilaria repens. Kontrola dodatnia. Do badań wykorzystano izolat DNA z krwi psa zarażonego D. repens. Intensywność inwazji wynosiła 3 larwy na 10 μl krwi. Kontrola ujemna. DNA wyizolowane z krwi zdrowego psa. Izolacja DNA. DNA izolowano z materiału utrwalonego w: alkoholu, formalinie lub utrwalonego w formalinie i zatopionego w bloczku parafinowym (Tabela I). Tabela I. Opis próbek nicieni wyizolowanych od ludzi. Nicień nr. Data izolacji z tkanek pacjenta Sposób przechowywania Czas przechowywania (tygodnie) 1 09.09.2009 r. Alkohol etylowy 24 2 31.08.2009 r. Bloczek parafinowy 25 3 14.04.2009 r. Formalina 46 Fragment robaka o długości około 6 mm utrwalony w 70% etanolu, suszono przez 20 minut w wirówce próżniowej w temperaturze 60ºC, po czym przy użyciu QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen) izolowano DNA zgodnie z zaleceniami producenta po 3 godzinnym trawieniu próbki proteinazą K. Z bloczka parafinowego z zatopionym robakiem ścięto 40 skrawków o grubości 20 µm. Skrawki odparafinowywano poprzez dwukrotne wytrząsanie w 1,5 ml ksylenu przez 10 min., w temp. pokojowej, a następnie dwukrotnie próbkę inkubowano przez 5 minut, kolejno w etanolu o stężeniu: 96%, 70%, 50% i płukano trzykrotnie, przez 10 min, wodą
Nr 2 Techniki genetyczne w diagnostyce dirofilariozy 183 destylowaną. Z tak przygotowanego materiału DNA izolowano za pomocą QIAamp Mini Kit (Qiagen) tak jak opisano powyżej. Próbkę robaka długości około 6-7 mm, przechowywanego w formalinie płukano trzykrotnie przez 30 min w wodzie destylowanej. Tak przygotowany materiał trawiono przez noc proteinazą K w buforze załączonym do zestawu QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen). Ponieważ w próbce wciąż widoczne były niestrawione fragmenty robaka, DNA izolowano z zebranej fazy ciekłej zgodnie z protokołem producenta zestawu Qiagen. Pozostałe fragmenty robaka, ponownie poddawano izolacji DNA używając zawiesiny ziemi okrzemkowej przygotowanej wg Boom i wsp. (2, 3), z następującymi modyfikacjami własnymi: 20μl zawiesiny ziemi okrzemkowej przemywano w 500μl buforu lizującego, w celu osiągnięcia odpowiedniego ph, a następnie wirowano 1 min przy 13000 obrotów na min. Do tak uzyskanego osadu dodawano fragmenty robaka pozostałe po trawieniu proteinazą K i ucierano je przy użyciu zasklepionej końcówki do pipety automatycznej. Dalsze etapy izolacji przebiegały zgodnie z protokołem opisanym przez Boom i wsp. (2). Amplifikacja DNA. W tradycyjnym PCR do powielania trzech różnych markerów genetycznych użyto trzech par starterów: DIDR-F1 AGT GCG AAT TGC AGA CGC ATT GAG i DIDR-R1 AGC GGG TAA TCA CGA CTG AGT TGA komplementarna do regionu 5.8S-ITS2-28S co najmniej dziewięciu gatunków filarii (produkt długości 484 pz dla D. repens), D.rep-F1 TGT TTC GGC CTA GTG TTT CGA CCA i D.rep-R1 ACG AGA TGT CGT GCT TTC AAC GTG otaczająca fragment 5SrRNA D. repens (dwa produkty o długości 247 pz i 153 pz), DR COI-F1 AGT GTT GAT GGT CAA CCT GAA TTA i DR COI-R1 GCC AAA ACA GGA ACA GAT AAA ACT komplementarna do mitochondrialnego genu podjednostki pierwszej oksydazy cytochromowej D. repens (produkt wielkości 208 par zasad) (14). Reakcje przebiegały w warunkach opisanych uprzednio (14), przy zwiększonej liczbie cykli do: 40 dla starterów DIDR-F1 i DIDR-R1 oraz D.rep-r1 i D.rep-F1, oraz do 45 cykli dla starterów DR COI-R1 i DR COI-F1. Do wszystkich reakcji PCR dodawano 1μl roztworu wyizolowanego DNA. Produkty PCR poddawano elektroforezie w żelach agarozowych z bromkiem etydyny, wyniki odczytywano w świetle UV. Real Time PCR przeprowadzono w objętości 25 μl mieszaniny, która zawierała: 500 nm startery DR COI-F1 AGT GTT GAT GGT CAA CCT GAA TTA i DR COI-R1 GCC AAA ACA GGA ACA GAT AAA ACT, jednokrotnie stężony roztwór KAPA SYBR qpcr Universal kit (KAPA Biosystems) zawierający polimerazę, deoksynukleotydy oraz barwnik Sybr Green (KAPA Biosystems) i 1μl DNA. Reakcję i odczyt wyników prowadzono w termocyklerze Corbett 6000 w następujących warunkach: 95ºC / 10 min, i 45 cykli: 95ºC / 30 s, 58ºC / 30 s, 72ºC / 40 s. W celu identyfikacji produktów uzyskano krzywą topnienia DNA inkubując produkty PCR po 5 s w temperaturach rosnących od 58ºC do 90ºC co 0.5ºC, z odczytem fluorescencji po każdej inkubacji. Za pomocą oprogramowania termocyklera Corbett obliczono stężenie DNA względem nierozcieńczonego preparatu izolowanego z materiału przechowywanego w etanolu (EtOH) ponieważ stężenie preparatu referencyjnego (etanol) było zbyt małe by uzyskać wiarygodny wynik pomiaru w spektrometrii UV. Przygotowano szereg dziesięciokrotnych rozcieńczeń materiału EtOH od 10-1 do 10-5. Krzywą standardową wykonano dla zakresu rozcieńczeń od materiału nierozcieńczonego do rozcieńczonego 10-4 (wszystkie reakcje zduplikowane) i na jej podstawie dokonano obliczeń stężeń względnych (Tab. II).
184 A. Masny i inni Nr 2 Tabela II. Względne stężenie DNA w badanych próbkach. Próbka Stężenie względne Etanol 1 Bloczek 4,19 x 10-4 Formalina / krzemionka 2,78 x 10-5 K+ 1,24 x 10-2 WYNIKI W wyniku przeprowadzonych badań wszystkie zbadane próbki nicieni zakwalifikowano do gatunku Dirofilaria repens przy użyciu metod klasycznych i molekularnych. W tradycyjnym PCR z użyciem starterów DIDR-F1 i DIDR-R1, na matrycy DNA wyizolowanego z fragmentu robaka utrwalonego w etanolu, uzyskano produkt wielkości 484 pz charakterystyczny dla D. repens (Ryc. 1). Przy użyciu starterów D.rep-R1 i D.rep-F1 w tradycyjnym PCR dwa produkty oczekiwanej wielkości uzyskano amplifikując DNA izolowane z nicienia przechowywanego w etanolu; jeden produkt wielkości 153 par zasad uzyskano po amplifikacji DNA izolowanego z robaka zatopionego w bloczku parafinowym, co uznano za wynik wątpliwie dodatni (Ryc. 1). Dodatnie wyniki tradycyjnego PCR z parą starterów DR COI-R1 DR COI-F1 uzyskano dla DNA izolowanego z materiału utrwalonego w etanolu i bloczku parafinowym powielając fragment o długości 208 pz charakterystyczny dla D. repens (Ryc. 2). Próbki DNA izolowane z materiału przechowywanego w formalinie, niezależnie od metody użytej do izolacji, ze wszystkimi parami starterów dawały wynik ujemny w tradycyjnym PCR (Ryc. 1). Ryc. 1. Amplifikacja markerów rybosomalnych D. repens DIDR F1 / R1 startery dla genu 5.8S-ITS2-28S; D.rep F1/R1 startery dla fragmentu 5SrRNA D. repens; M marker wielkości fragmentów DNA Vivantis Technlogies VC 100bp Plus DNA Ladder, rozmiary fragmentów w parach zasad podane z boku zdjęcia; K+ kontrola dodatnia; K- kontrola ujemna; DNA izolowane z robaka przechowywanego w: E etanolu, B bloczku parafinowym, Fs formalinie (izolacja zestawem firmy Qiagen), Fq - formalinie (izolacja na ziemi okrzemkowej).
Nr 2 Techniki genetyczne w diagnostyce dirofilariozy 185 W Real Time PCR, po użyciu starterów DR COI-R1 DR COI-F1 uzyskano wynik dodatni dla preparatów z wszystkich robaków, chociaż amplifikacja DNA wyizolowanego zestawem Qiagen z robaka przechowywanego w formalinie dała wynik ujemny (Ryc. 3). Ryc. 2. Amplifikacja fragmentu genu podjednostki pierwszej oksydazy cytochromowej D. repens. M marker wielkości fragmentów DNA Vivantis Technlogies VC 100bp Plus DNA Ladder, rozmiary fragmentów w parach zasad podane z boku zdjęcia; K+, kontrola dodatnia; K-, kontrola ujemna; DNA izolowane z robaka przechowywanego w : E etanolu, B bloczku parafinowym, Fs formalinie (izolacja na ziemi okrzemkowej), Fq - formalinie (izolacja zestawem Qiagen). Na podstawie krzywej standardowej, o współczynniku korelacji R 2 =0.997, uzyskanej przy wydajności reakcji wynoszącej 0.97, i obliczonej za pomocą oprogramowania termocyklera oceniono, że materiał uzyskany z robaka zatopionego w bloczku parafinowym zawierał 4.19 x 10-4 razy mniej DNA niż próbka uzyskana z robaka przechowywanego w etanolu, a materiał uzyskany z robaka utrwalonego z formalinie za pomocą zmodyfikowanej metody Booma i innych (1999) 2.78 x 10-5 razy mniej (Tabela II). Pojawianie się niespecyficznego produktu oraz spadek wydajności i powtarzalności PCR obserwowano przy rozcieńczeniu 1 x 10-5 stężenia wyjściowego DNA uzyskanego z robaka utrwalonego etanolem (Ryc. 3). Ryc. 3. Krzywe topnienia produktów Real Time PCR z parą starterów DR COI-R1 i DR COI-F1. Oś pionowa: ujemna pochodna fluorescencji (F) po czasie (T); 1, 5, 9 - fluorescencja podana w jednostkach umownych. Oś pozioma: temperatura w stopniach Celsjusza; K+, kontrola dodatnia. K-, kontrola ujemna. DNA izolowane z robaka przechowywanego w: EtOH etanolu (podano rozcieńczenia), Bloczek bloczku parafinowym, F Q formalinie (izolacja zestawem Qiagen), F krzem. - formalinie (izolacja na ziemi okrzemkowej). Obok symboli próbek podano temperatury topnienia (Tm) szczytów znajdujących się powyżej krzywej odcięcia (linia równoległa do osi temperatury). Zakres Tm dla wyników dodatnich: od 78.00 ºC (EtOH) do 78.60 ºC (EtOH 10-5 ).
186 A. Masny i inni Nr 2 DYSKUSJA Inwazje D. repens u ludzi najczęściej objawiają się w postaci podskórnych guzków zawierających pojedyncze pasożyty. Guzki te mogą być umiejscowione w różnych okolicach ciała; czasami inwazje mogą dotyczyć także gałki ocznej. Wywoływane przez dirofilarie zmiany mogą być mylone ze zmianami nowotworowymi (5, 13). Rozpoznanie stawiane jest zwykle na podstawie wyników histopatologicznego badania materiału biopsyjnego. Rzadko możliwa jest morfologiczna ocena pasożyta wypreparowanego z tkanek. Identyfikacja mikroskopowa dirofilarii zawartych w skrawkach histopatologicznych jest trudna, gdyż uwidaczniane są różne przekroje ciała pasożytów będących w różnym stadium destrukcji. W przeprowadzonych dla celów obecnej pracy badaniach wykorzystano reakcję łańcuchową polimerazy do amplifikacji fragmentów genów dirofilarii rozpoznając nicienie, które wypreparowano z tkanek ludzkich. Zbadane pasożyty zakwalifikowano do gatunku D. repens, potwierdzając wyniki uprzednio przeprowadzonych badań parazytologicznych opartych na ocenie cech morfologicznych. Dwa ze zbadanych nicieni utrwalone były w formalinie, przy czym jeden był w niej przechowywany od czasu wypreparowania do czasu przeprowadzenia badań, a drugi bezpośrednio po utrwaleniu został zatopiony w bloczku parafinowym (Tabela I). Formaldehyd pozwala zachować morfologię tkanek, a także większość antygenów powierzchniowych jednak ogranicza wydajność reakcji amplifikacji. Reaguje on z zasadami azotowymi w cząsteczce DNA i RNA w wyniku czego dochodzi do modyfikacji i fragmentacji kwasów nukleinowych (7). W trakcie przeprowadzonych badań niepowodzeniem zakończyła się próba izolacji DNA z nicienia przechowywanego w formalinie, przeprowadzona za pomocą zestawu QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen), chociaż przy jego użyciu wyizolowano DNA z dwu pasożytów inaczej utrwalanych. Ponieważ w procedurze zestawu QIAamp DNA Mini Kit etap główny stanowi liza enzymatyczna, postanowiono zastosować metodę zawierającą etapy mechanicznej destrukcji i lizy chemicznej (2, 3). Agresywna homogenizacja przy użyciu ziemi okrzemkowej i liza chemiczna pozwoliły uwolnić DNA z utrwalonych w formalinie komórek chociaż wydajność procesu była zbyt niska by umożliwić wykrycie DNA za pomocą klasycznego PCR. Niekorzystny wpływ formaliny na cząsteczki DNA przekłada się na wyniki PCR (10) dlatego niska wydajność amplifikacji DNA próbki nicienia utrwalonego formaldehydem przed zatopieniem w bloczku parafinowym była spodziewana. Zaobserwowano tylko bardzo mało wydajne powielanie mniejszego (153 pz) z dwóch produktów i brak produktu większego (247 pz) w tradycyjnym PCR ze starterami D.rep-R1 i D.rep-F1 (Ryc. 1), co prawdopodobnie wynikało z fragmentacji DNA. Ponieważ liczba kopii DNA mitochondrialnego w organizmach jest większa niż liczba kopii rybosomalnego RNA, aby zwiększyć prawdopodobieństwo uzyskania dodatnich wyników amplifikacji DNA wyizolowanego z próbek utrwalonych w formalinie wykorzystano startery komplementarne do genu mitochondrialnego DR COI-F1 i DR COI-R1 powielając produkt wielkości 208 pz w Real Time PCR. Ilość DNA była wystarczająca do uzyskania produktu PCR tą metodą, jednak znajdowała się w pobliżu granicy wykrywalności. Ze względu na niską powtarzalność reakcji i pojawienie się niespecyficznego szczytu na wykresie krzywej topnienia za granicę czułości metody Real Time PCR przyjęto rozcieńczenie 10-5 próbki DNA nicienia utrwalonego w etanolu (Ryc. 3). Wartości uzyskane z krzywej
Nr 2 Techniki genetyczne w diagnostyce dirofilariozy 187 wzorcowej pozwalają ocenić różnice stężenia DNA w poszczególnych próbkach (Tabela II), wykazując najniższą czułość detekcji dla próbek przechowywanych w formalinie. W wyniku przeprowadzonych badań stwierdzono, że PCR w wersji tradycyjnej i Real Time mogą być użytecznymi metodami rozpoznawania nicieni Dirofilaria. Uzyskane wyniki pokazują, że materiał przeznaczony do badań molekularnych w kierunku dirofilariozy nie powinien być przechowywany w roztworach formaldehydu. W przypadku takich preparatów uzyskanie dodatniego wyniku badania jest możliwe, jednak wymaga zastosowania wydajnych metod izolacji DNA i wyższej czułości wykrywania produktów amplifikacji niż ta, którą zapewnia tradycyjny PCR z detekcją w żelu agarozowym barwionm bromkiem etydyny - warunki te spełnia Real Time PCR. A.Masny, H. Żarnowska-Prymek, D. Cielecka, R. Salamatin, E.Gołąb PROCEDURES FOR SPECIES IDENTIFICATION OF THE NEMATODES BELONGING TO DIROFILARIA GENUS PRESENT IN THE CLINICAL MATERIAL ISOLATED FROM HUMANS. SUMMARY Procedures for DNA extraction and amplification were modified to allow identification of Dirofilaria nematodes surgically removed from human tissues. Worm samples stored in: ethanol (24 weeks), formalin (46 weeks) or paraffin blocks (25weeks) were examined. Fragments of two ribosomal DNA regions (5.8S-ITS2-28S, 5SrRNA) and mitochondrial cytochrome oxidase subunit I gene were used as diagnostic markers. The highest PCR sensitivity was observed for DNA obtained from the worm preserved in ethanol, while the nucleic acid extracted form the parasite stored in formalin yielded the lowest PCR sensitivity. DNA extraction from the parasite preserved in formalin was more time consuming than DNA extraction from the remaining samples. Furthermore, the amplification of DNA isolated from the formaldehyde preserved worm allowed for identification of the parasite species only when the mitochondrial marker was used in Real Time PCR, and the amount of the obtained product was close to the detection limit. Species identification of the worms stored in the paraffin block and in ethanol was possible with both traditional and Real Time PCR. All analyzed worms were identified as D. repens which confirmed the species identification based on morphological features. The results show that molecular methods are relatively simple to use and suitable for identification of Dirofilaria sp. nematodes present in clinical material. Formalin is not suitable for storing material intended for molecular tests. PIŚMIENNICTWO 1. Babal P, Kobzova D, Novak I, Dubinsky P i inni. First case of cutaneous human dirofilariosis in Slovak Republic. Bratisl Lek Listy 2008; 109: 486-8 2. Boom R, Sol C, Beld M i inni. Improved silica-guanidinium thiocyanate DNA isolation procedure based on selective binding of bovine alpha-casein to silica particles. J Clin Microbiol 1999; 37: 615-9 3. Boom R, Sol CJ, Salimans MM i inni. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J Clin Microbiol 1990; 28: 495-503 4. Cancrini G, Scaramozzino P, Gabrielli S i inni Aedes albopictus and Culex pipiens implicated as natural vectors of Dirofilaria repens in central Italy. J Med Entomol 2007; 44:1064-6
188 A. Masny i inni Nr 2 5. Cordonnier C, Chatelain D, Nevez G i inni. Difficulties in diagnosis of human dirofilariasis outside known enzootic areas. Rev Med Interne 2002; 23: 71-6 6. Demiaszkiewicz AW, Polańczyk G, Pyziel AM i inni. Pierwsze ogniska dirofilariozy psów wywołanej przez Dirofilaria repens Railliet et Henry,1911 w centralnej Polsce. Wiad Parazytol 2009; 55: 367-70 7. Do H, Dobrovic A. Limited copy number-high resolution melting (LCN-HRM) enables the detection and identification by sequencing of low level mutations in cancer biopsies. Mol Cancer 2009; 8:82 8. Korolev VA, Romashova MF. Dirofilariasis in the Autonomous Republic of Crimea Med Parazitol (Mosk). 2005; 1: 50-1 9. Kuzmin Y, Varodi E, Vasylyk i inni. Experimental infection of mosquitoes with Dirofilaria repens (Nematoda, Filarioidea) larvae. Vestn Zool 2005;39:19-24 10. Miething F, Hering S, Hanschke B i inni. Effect of fixation to the degradation of nuclear and mitochondrial DNA in different tissues. J Histochem Cytochem 2006; 54: 371-4 11. Miterpáková M, Antolová D, Hurníková Z i inni. Dirofilaria infections in working dogs in Slovakia. J Helminthol 2010; 84: 173-6 12. Overgaauw PA, van Dijk EP. A worm infection in the skin of a dog. First autochthonous Dirofilaria repens infection of a dog in the Netherlands. Tijdschr Diergeneeskd 2009; 134: 936-8 13. Pampiglione S, Rivasi F. Human dirofilariasis due to Dirofilaria (Nochtiella) repens: an update of world literature from 1995 to 2000. Parassitologia 2000; 42: 231-54 14. Rishniw M, Barr SC, Simpson KW i inni. Discrimination between six species of canine microfilariae by a single polymerase chain reaction. Vet Parasitol 2006 135: 303-14 15. Żarnowska-Prymek H, Cielecka D, Salamatin R. Dirofilarioza - Dirofilaria repens, po raz pierwszy opisana u polskich pacjentów. Przegl Epidemiol 2008; 62: 547-51 Otrzymano: 20 V 2010 Adres Autora: 00-791 Warszawa, ul. Chocimska 24, Zakład Parazytologii Lekarskiej NIZP-PZH