X. Pałeczki Gram-dodatnie. Rodzaje: Corynebacterium, Listeria, Erysipelothtix, Lactobacillus Gramujemne pałeczki auksotroficzne. Rodzaj: Haemophilus, Brucella, Legionella Ćwiczenie 1. Wykonanie preparatu mikroskopowego barwionego metodą Grama Wykonanie ćwiczenia: Opis wykonania ćwiczenia przy temacie II. Budowa komórki bakteryjnej i metody barwienia. preparat bawiony metodą Grama z Corynebacterium pseudodiphtheriticum Opis preparatu: preparat bawiony metodą Grama z Lactobacillus spp. Opis preparatu: preparat bawiony metodą Neissera z. Opis preparatu:
Ćwiczenie 2. Ocena wzrostu szczepów na agarze z dodatkiem 5% odwłóknionej krwi baraniej (AK) rodzaj drobnoustroju: Corynebacterium pseudodiphtheriticum typ hemolizy morfologia kolonii... rodzaj drobnoustroju: typ hemolizy morfologia kolonii... Ćwiczenie 3. Oznaczanie cech biochemicznych szczepów maczugowców a. wykonanie próby na katalazę Wykonanie ćwiczenia: Opis wykonania ćwiczenia przy temacie III. Fizjologia bakterii Szczep badany obserwowane wyniki.. wnioski b. oznaczanie zdolności do redukcji azotanów
Zasada metody: Badanie wykrywa zdolność wytwarzania przez bakterie reduktazy azotanowej. W wyniku jej działania drobnoustroje przekształcają jony azotanowe w azotynowe. Dodanie do hodowli odczynnika Griessa( kwas sulfanilowy: α-naftyloamina w kwasie octowym) powoduje, że zachodzi w roztworze reakcja diazowania kwasu sulfanilowego jonami azotynowymi, której produktem jest związek diazowy o barwie ceglastoczerwonej. Wykonanie: 1. Badanie wykonuje się na bulionie z dodatkiem azotanu potasu. 2. Po 24 godzinnej inkubacji do hodowli dodaje się odczynnika Griessa. Czerwonoceglaste zabarwienie hodowli świadczy o redukcji azotanów. obserwowane wyniki próba dodatnia próba ujemna c. Wytwarzanie zdolności do wytwarzania ureazy Enzymatyczny rozkład mocznika przez bakterie powoduje powstanie NH 3 i CO 2. Powstający NH 3 alkalizuje podłoże i powoduje zmianę zabarwienia z żółtej na różowo-amarantową. 1. Podłoże zawierające 2% mocznika zaszczepić badanym szczepem. 2. Całość inkubować w 37 0 C 18-24 godzin. 3. Odczytać wynik. obserwowane wyniki próba dodatnia próba ujemna d. Ocena zdolności utleniania/fermentacji glukozy, maltozy, sacharozy Badanie zdolności sacharolitycznych bakterii wykonuje się na podłożu zawierającym surowicę końską, enzymatyczny hydrolizat kazeiny, cystynę, 1% glukozy i czerwień fenolową. Kwaśny rozkład węglowodanów powoduje zmianę ph środowiska i zmianę zabarwienia z czerwonego na żółte. 1. Podłoże zawierającego 1% glukozy lub maltozy lub sacharozy zaszczepić badanym szczepem 2. Całość inkubować w 37 0 C 18-24 godzin. 3. Odczytać wynik. obserwowane wyniki próba dodatnia próba ujemna
Ćwiczenie 4. Identyfikacja szczepów Corynebacterium spp. przy użyciu testu API Coryne Odczyt testu Po inkubacji do mikroprobówek NIT, PYZ, PyrA, PAL, GUR, GAL, αglu, βnag dodać odpowiednie odczynniki wg schematu: 1. Test NIT po kropli NIT1 i NIT2 2. Test PYZ 1 kropla PYZ 3. Testy PyrA, PAL, GUR, GAL, αglu, βnag po kropli ZYM A i ZYM B Odczytać wyniki wg załączonej tabeli.
Ćwiczenie 5. Różnicowanie szczepów Corynebacterium spp. na podstawie wybranych cech biochemicznych 1-redukcja azotanów, 2- wytwarzanie ureazy, 3- O/F glukozy, 4-rozkład maltozy, 5- rozkład sacharozy 1 2 3 4 5 1 Corynebacterium diphtheriae Corynebacterium ulcerans Corynebacterium pseudodiphtheriticum Corynebacterium urealyticum
Ćwiczenie 6. Identyfikacja szczepu Listeria monocytogenes a. Próba na katalazę Wykonanie ćwiczenia: Opis wykonania ćwiczenia przy temacie III. Fizjologia bakterii Szczep badany.. wnioski obserwowane wyniki b. Hydroliza eskuliny morfologia kolonii... c. Wzrost w temperaturze 4 0 C Materiał kliniczny miesza się proporcji 1:10 z bulionem i umieszcza w temp. 4 0 C. Pałeczki Listeria mnożą się w niskich temperaturach d. Test CAMP Czynnik CAMP jest białkiem enzymatycznym działającym jako ko-cytolizyna na częściowo zhemolizowane przez β-hemolizynę gronkowcową krwinki baranie. Wynikiem tego działania jest tzw. synergistyczna hemoliza. Wykonanie ćwiczenia: 1. Na powierzchnię płytki agarowej z 5% krwią baranią posiać liniowo (przez środek szalki) szczep Staphylococcus aureus ATCC 25923 wytwarzający hemolizę β. 2. Prostopadle do linii posiewu, w bliskiej odległości (ale nie dotykając) posiać badany szczep. 3. Płytkę inkubować przez 18-24 godzin w temperaturze 35 0 C. 4. Wytwarzanie czynnika CAMP objawia się pojawieniem strefy wzmożonej hemolizy w postaci przejaśnienia, często o kształcie jasnego grota strzały, w miejscu gdzie linia posiewu szczepu nachodzi na strefę hemolizy β gronkowca.
Staphylococcus aureus ATCC 25923 Szczep badany Wnioski..... e. Ocena zdolności hemolitycznych na podłożu agarowym z dodatkiem 5% odwłóknionej krwi baraniej typ hemolizy morfologia kolonii... Listeria monocytogenes ruch + typ hemolizy katalaza wzrost w 4 0 C hydroliza eskuliny test CAMP
Ćwiczenie 7. Wykonanie i ocena preparatu mikroskopowego Haemophilus influenzae barwionego metodą Grama Opis preparatu: Ćwiczenie 8. Zasady hodowli i ocena wzrostu Haemophilus influenzae na podłożach stałych a. Agar czekoladowy H. influenzae rośnie najlepiej na płytkach przygotowanych przez dodanie erytrocytów do płynnego agaru w temperaturze 80ºC i utrzymywanie w temperaturze 50 C przez około 15 minut. Łagodne ogrzewanie erytrocytów powoduje uwalnianie czynnika X - protoporfiryna IX (hematyna), prekursor heminy i czynnika V - nikotynamidoadenozynodifosforan (NAD). Oba te czynniki są niezbędne do wzrostu H. influenzae. Tylko świeżo przygotowany agar czekoladowy umożliwia wzrost H. influenzae, ponieważ czynnik V jest niestabilny i z czasem jest degradowany. Agar czekoladowy... b. Mueller-Hinton II Agar lub Tryptic Soy Agar Po posianiu materiału należy nałożyć krążek BXV (bacytracyna, czynnik wzrostu X i V). Bacytracyna hamuje większość drobnoustrojów, jednocześnie nie wpływając na intensywność wzrostu pałeczek z rodzaju Haemophilus. W strefie obecności czynników X i V (wokół krążka) wzrastają kolonie pałeczek z rodzaju Haemphilus. Trzeba jednak zawsze sprawdzić, czy wyrosłe przy krążku kolonie to drobne pałeczki Gramujemne.
Podłoże Tryptic Soy Agar... Ćwiczenie 8. Różnicownie szczepów Haemophilus influenzae i Haemophilus parainfluenzae Pałeczki z rodzaju Haemophilus wymagają do wzrostu obecności czynnika V i/lub czynnika X. To zapotrzebowanie pozwala na ich różnicowanie w obrębie rodzaju i precyzyjne określenie przynależności do gatunku. W badaniach stosuje się krążki diagnostyczne o średnicy 9 mm nasycone; BV - czynnikiem V + bacytracyna B (a' 2j bacytracyny w krążku), BX - czynnikiem X + bacytracyna B (a' 2j bacytracyny w krążku). W celu przeprowadzenia różnicowania pałeczek z rodzaju Haemophilus należy zastosować wystandaryzowane, zgodnie z zaleceniami NCCLS podłoże Mueller-Hinton II Agar. Doprowadzić płytki do temperatury pokojowej. Czystą hodowlę szczepu Haemophilus (np. kolonie wyrosłe wokół krążka BVX przy posiewie materiału klinicznego na podłoże Mueller-Hintona II) zawiesić w roztworze 0,9% NaCI, tak aby uzyskać zawiesinę o gęstości około 0,5 McFarlanda. Przygotowaną zawiesinę posiać jałowym wacikiem i nałożyć krążki diagnostyczne BV i BX w odległości około 15-20 mm od siebie posiany materiał inkubować w temperaturze 35 C, przez 18-24 godzin, w atmosferze 5-7% CO 2....
Interpretacja wyników i wnioski Ćwiczenie 9. Diagnostyka mikrobiologiczna oparta na teście API NH
Wnioski :. Ćwiczenie 10. Badanie lekowrażliwości Haemophilus influenzae... Wnioski:.