Endonukleazy restrykcyjne i metody molekularne w diagnostyce

ROZDZIAŁ 5 Endonukleazy restrykcyjne i metody molekularne w diagnostyce Tomasz Francuz Agnieszka Kłych Amplifikacja materiału genetycznego metodą PCR jest zaledwie jednym z pierwszych etapów analizy DNA. Mimo istnienia wielu odmian reakcji PCR, zwykle na podstawie obecności, bądź też nieobecności produktu reakcji niewiele możemy powiedzieć o zmianach w badanym genomie (do wyjątków należy analiza głównego układu zgodności tkankowej (MHC) za pomocą ASO-PCR, analiza obecności genomów bakteryjnych w badanym materiale), dlatego też uzyskany produkt reakcji PCR poddajemy dalszym analizom, m.in. trawieniu enzymami restrykcyjnymi. Enzymy restrykcyjne dzięki rozpoznawaniu specyficznej dla siebie sekwencji DNA umożliwiają trawienie helisy DNA w ściśle określonych miejscach, co znajduje zastosowanie w: wykrywaniu mutacji punktowych, 33

przygotowaniu amplikonu (produktu reakcji PCR) np. do reakcji ligacji znajdującej zastosowanie w klonowaniu cząsteczki DNA do wektorów (wirusowych, plazmidowych). Gwałtowny wzrost zainteresowania zastosowaniem enzymów w technikach biologii molekularnej rozpoczął się w latach 50-tych, kiedy Artur Kornberg wyizolował pierwszą polimerazę DNA (1955), w 1966 Weis i Richardson wyizolowali pierwszą ligazę, a 2 lata później, w 1968 roku Smith, Wilcom i Kelly wyizolowali i określili rozpoznawaną sekwencję pierwszej restryktazy bakteryjnej (HindII z Haemophilus influenzae). Enzymy te szybko stały się potężnym narzędziem służącym do manipulacji DNA, m.in. otrzymywania cząstek o zupełnie nowych sekwencjach. Właściwości i budowa endonukleaz Enzymy restrykcyjne odkryto, kiedy okazało się, że fagi bakteryjne infekują różne szczepy bakterii należące do tego samego gatunku z różną efektywnością. Niektóre szczepy bakterii były zupełnie oporne na infekcję fagiem, podczas, gdy inny szczep ulegał jej z dużą łatwością. Szybko okazało się, że zjawisko to jest spowodowane obecnością u bakterii swoistych enzymów metylaz oraz endonukleaz. W komórce bakteryjnej enzymy te zawsze występują w parach. Metylazy są odpowiedzialne za metylację niektórych nukleotydów wchodzących w skład rozpoznawanych przez nie sekwencji DNA, natomiast endonukleazy rozpoznając te same sekwencje, trawią je tylko wtedy, kiedy budujące je nukleotydy nie zostały zmodyfikowane. Mechanizm ten stanowi system obronny bakterii przed wtargnięciem obcego DNA, np. fagowego. Materiał genetyczny faga nie jest zabezpieczony przed działaniem endonukleaz restrykcyjnych komórki gospodarza i dzięki temu ulega strawieniu, a dany szczep bakterii jest oporny na infekcję. Endonukleazy restrykcyjne są enzymami występującymi wyłącznie u bakterii. Składają się z dwóch identycznych podjednostek białkowych połączonych antyrównolegle. Takie połączenie warunkuje rozpoznawanie sekwencji palindromowych (każda podjednostka rozpoznaje pełną sekwencję dlatego też sekwencja nukleotydów musi tworzyć palindrom). Pierwszą odkrytą restryktazą była wspomniana restryktaza HindII rozpoznająca sześcionukleotydową sekwencję 5 GT(T/C)(A/G)AC-3. Restryktaza ta tnie podwójną nić DNA zawsze w środku rozpoznawanej sekwencji. Miejsce w DNA, które jest rozpoznawane i 34

cięte przez restryktazę nazywamy miejscem restrykcyjnym, a sekwencję nukleotydów sekwencją rozpoznawaną przez restryktazę. Do chwili obecnej zidentyfikowano ponad 1000 restryktaz u ponad 230 gatunków bakterii. Oczywiście wśród tak wielu restryktaz znajdują się restryktazy pochodzące z różnych gatunków bakterii rozpoznające identyczne sekwencje nukleotydowe. Takie restryktazy nazywamy izoschizomerami. Jakkolwiek rozpoznają one identyczną sekwencję, mogą różnić się optimum ph i optymalnym składem środowiska, w którym przebiega reakcja. Przykładem izoschizomerów są restryktazy MboI oraz Bsp143I, które rozpoznają identyczną sekwencję GATC, lecz restryktaza Bsp143I nie jest wrażliwa na metylację rozpoznawanych nukleotydów. Z kolei restryktazy o identycznej specyficzności, a różniące się miejscem cięcia nazywamy neoschizomerami (Rys. 5.1). MaeII 5...ACGT...3 3...TGCA...5 TaiI 5...ACGT...3 3...TGCA...5 Rysunek 5.1 Przykłady neoschizomerów. In vivo restryktazy z dużą swoistością rozpoznają właściwe sobie miejsca restrykcyjne, jednakże in vitro poprzez zmiany w warunkach reakcji ta wysoka specyficzność może ulec zmniejszeniu, a enzym będzie trawił wiele podobnych sekwencji nukleotydowych. Tą właściwość restryktaz nazywamy rozluźnieniem specyficzności (ang. star activity). Zwykle efekt taki nie jest pożądany i może prowadzić do błędnych interpretacji wyników badania. Wykorzystywane w biologii molekularnej restryktazy wymagają do swojej aktywności jonów Mg 2+, dodanie chelatorów jonów dwuwartościowych (np. EDTA) odwracalnie je inaktywuje, natomiast nieodwracalna inaktywacja następuje na skutek denaturacji termicznej (zwykle w temp. powyżej 65 ºC). Nazewnictwo Zwyczajowo restryktazy zawdzięczają swoje nazwy gatunkowi bakterii, z których zostały wyizolowane, np. EcoRI to restryktaza pochodząca z bakterii Escherichia coli, szczep RY13. Cyfry rzymskie na końcu nazwy określają numer kolejny restryktazy wyizolowanej z danego gatunku bakterii. Lepkie i tępe końce Jak wspomniano wcześniej miejsce cięcia restryktazy w obrębie rozpoznawanej sekwencji nie jest przypadkowe, lecz jest uzależnione od typu restryktazy i jest dla niej charakterystyczne. 35

Wszystkie restryktazy możemy podzielić w zależności od sposobu cięcia nici DNA na dwie grupy: restryktazy dające tzw. tępe końce jeśli obie nici DNA cięte są w tym samym miejscu (Rys. 5.2). oraz restryktazy dające tzw. lepkie końce jeśli cięcie jest asymetryczne (Rys. 5.3). 5...GATATC...3 3...CTATAG...5 EcoRV 5...GAT 3...CTA + ATC...3 TAG...5 Rysunek 5.2 Przykład reakcji dającej tępe końce. 5...GAATTC...3 3...CTTAAG...5 EcoR1 5...G AARTC...3 + 3...CTTAA G...5 Rysunek 5.3 Przykład reakcji dającej lepkie końce. Powstałe fragmenty DNA posiadające lepkie końce po rozcięciu nadal pozostają ze sobą powiązane dzięki istnieniu słabych wiązań wodorowych pomiędzy komplementarnymi do siebie zasadami. Wiązania te ulegają zniszczeniu po zadziałaniu czynnika denaturującego, np. podwyższonej temperatury. Stwarza to unikalną możliwość łączenia takich produktów z innymi produktami działania restryktaz pod warunkiem, że oba łączone końce będą do siebie komplementarne. Takie słabo połączone nici DNA mogą zostać połączone ponownie w jedną całość dzięki innej klasie enzymów ligazom DNA (Rys. 5.4). Znajduje to zastosowanie m.in. w klonowaniu produktów PCR, np. do reakcji sekwencjonowania, przy wprowadzaniu do plazmidów nowych genów kodujących pożądane przez nas białka lub antybiotykooporność bakterii. Aktywność enzymów restrykcyjnych Za jednostkę aktywności enzymu restrykcyjnego przyjmuje się taką aktywność, która hydrolizuje 1 µg DNA w ciągu 60 min. w optymalnej dla danego enzymu temperaturze i buforze. Zwykle jako substratu używa się DNA faga λ. Jeśli badana restryktaza nie ma miejsca restrykcyjnego w DNA faga λ używa się innego DNA. Reakcję zwykle przeprowadza się w 36

temp. 37 ºC, lecz niektóre enzymy mają optima temperatury znacznie odbiegające od tej wartości (enzymy mezofilne i termofilne). Enzymy restrykcyjne rozpoznają sekwencje składające się najczęściej z 4 do 8 nukleotydów. W technikach biologii molekularnej znajdują zastosowanie restryktazy o długości rozpoznawanej sekwencji 4-6 nukleotydów. Zakładając, że cząsteczka DNA składa się z losowej sekwencji nukleotydów, restryktazy o rozpoznawanej sekwencji składającej się z 4 nukleotydów będą znajdowały miejsce restrykcyjne średnio co 4 4 =256 bp (ang. base pairs par zasad). Przy sekwencji 6-nukleotydowej co 4 6 =4096 nukleotydów. Tak więc w genomie człowieka składającym się z około 4 10 9 nukleotydów, każda restryktaza szóstkowa (rozpoznająca sekwencje 6 nukleotydowe) znajdzie ok. 4 10 9 /4096, czyli około miliona miejsc restrykcyjnych. Dlatego też w wyniku trawienia jądrowego DNA uzyskujemy mieszaninę cząsteczek DNA nie nadającą się do bezpośredniej analizy. W przypadku produktów reakcji PCR mających długość od kilkudziesięciu do kilku tysięcy par zasad sytuacja jest o wiele prostsza. W wyniku ich trawienia zwykle otrzymujemy, co najwyżej kilka produktów o wyraźnie różniących się długościach. Umożliwia to łatwą analizę produktów cięcia na żelu agarozowym lub poliakrylamidowym. Technika ta znana jest pod nazwą PCR-RFLP (ang. polymerase chain reaction restriction fragments length polymorphism). Umożliwia ona analizę sekwencji otrzymanego produktu reakcji PCR poprzez analizę obecności/braku miejsc restrykcyjnych. Znalazła ona zastosowanie do wykrywania mutacji punktowych w genach (ang. SNP single nucleotide polymorphism). Warunkiem możliwości jej zastosowania jest istnienie enzymu restrykcyjnego, który swoiście rozpoznaje interesującą nas sekwencję w genie dzikim lub zmutowanym. Dlatego też nie wszystkie mutacje punktowe mogą być analizowane tą techniką. Zasadę techniki PCR-RFLP wyjaśnia rys. 5.5. 37

Umieszczenie przykładowego DNA w plazmidzie G G A A T T A C T T A C G C T T A A A A T T C Wkładane DNA Plazmid DNA cięte przez EcoRI G C T T A A G A A T T C G Otrzymane DNA z lepkimi (komplementarnymi) końcami C A T T A G A G A T T C Zrekombinowane DNA G C T A T A A T A T G C Otrzymane DNA łączy się za pomocą ligazy Rysunek 5.4. Wykorzystywanie lepkich końców przy klonowaniu produktów PCR. 38

R Allel 1 Allel 2 R (1) Amplifikacja (2) Cięc ie produktu PCR enzymem restrykcyjnym (3) Rozdział na żelu a b a + b a + b a b Allel 1,1 2,2 1,2 Rysunek 5.5. Zasada techniki PCR-RFLP. Southern i northern blot Techniką obecnie, coraz rzadziej stosowaną jest technika RFLP (rys. 5.6). Polega ona na trawieniu enzymem restrykcyjnym nie krótkiego produktu reakcji PCR, lecz całego genomu, w wyniku czego uzyskujemy setki tysięcy, a nawet miliony fragmentów różnej długości (fragmentów restrykcyjnych). Dalszy etap analizy wykorzystuje technikę Southern blot. Uzyskane fragmenty rozdzielamy na żelu, a następnie przenosimy na błonę nitrocelulozową. Następnie przeprowadzamy hybrydyzację pomiędzy badanym materiałem, a specyficzną sondą, która z milionów fragmentów wybierze fragmenty do niej komplementarne. W technice northern blot przeprowadzamy hybrydyzację pomiędzy sondą a RNA (w Southern blot jest to hybrydyzacja DNA-DNA), stąd też etap trawienia restryktazą ze względu na mniejszą długość cząsteczki RNA nie jest potrzebny. W trakcie płukania błony nadmiar sondy jest usuwany. Ponieważ sonda jest wyznakowana izotopem radioaktywnym, po przyłożeniu kliszy fotograficznej w miejscach, w których zaszła hybrydyzacja dojdzie do zaczernienia kliszy. W efekcie powstaje wzór prążków unikalny i charakterystyczny dla każdego człowieka. Technika ta znalazła zastosowanie do identyfikacji ludzi na podstawie śladów 39

biologicznych oraz do określania stopnia pokrewieństwa. Można dzięki niej identyfikować obecność w genomie specyficznych sekwencji, a w przypadku northern blot obecność wirusów RNA w badanym materiale. Obecnie techniki te są stosunkowo rzadko stosowane ze względu na swoje wady: dużą ilość materiału genetycznego wymaganego do analizy, długi czas analizy i pracochłonność techniki, istnienie szybszych i bardziej czułych technik, jak np. techniki wykorzystującej polimorfizm ilości powtórzeń (STR). Komórkowe DNA Trawienie enzymem restrykcyjnym Mieszanina frag mentów restrykcyjnych Elektroforeza na żelu Błona Żel Denatura cja i przeniesienie fragmentów jednoniciowych na błonę nitrocelulozową Inkubacja błony z radioaktywną sondą ( DNA lub RNA) Błona fotograficzna Autoradiografia Błona nitrocel ulozowa Prążek odpowiada hybrydzie DNA-sonda Rysunek 5.6. Zasada techniki Southern blot. 40

Polimorfizm długości krótkich fragmentów powtórzonych (ang. STR short tandem repeats) Opisana wcześniej technika RFLP znajdująca zastosowanie do identyfikacji osób od 1999 roku została stopniowo zastąpiona nową techniką wykorzystującą STR. W ludzkim genomie znajdują się fragmenty DNA zbudowane z licznych powtarzających się sekwencji kilku nukleotydów. Ilość takich powtórzeń jest zmienna u różnych ludzi. Jeśli odpowiednio zaprojektujemy primery tak aby pokrywały rejon DNA obejmujący STR to długość otrzymanego produktu będzie zależna od ilości powtórzeń nukleotydów (rys. 5.7). AATG 7 powtórzeń 8 powtórzeń Rysunek 5.7. Zasada techniki STR. Primery (zaznaczone strzałkami) użyte w reakcji rozpoznają stałe sekwencje flankujące, długość uzyskanego amplikonu zależna jest od ilości powtórzeń czwórek nukleotydów (w tym wypadku AATG). Po reakcji wystarczy rozdzielić otrzymany produkt na żelu, aby określić jego masę, a co za tym idzie ilość powtórzeń STR. Ze względu na konieczność precyzyjnego rozróżnienia długości amplikonu, rozdziału dokonuje się na specjalnych żelach poliakrylamidowych lub w automatycznych analizatorach DNA. Zakładając, że mamy do czynienia z STR, w przypadku, w którym może istnieć z równym prawdopodobieństwem np. 6, 7, 8 i 9 powtórzeń, szansa, że dwie próbki DNA pochodzące od różnych osób będą miały taką samą ilość powtórzeń wynosi 25%. W przypadku analizy jednocześnie 13 różnych polimorfizmów STR, szansa błędnej identyfikacji jest mniejsza niż 1/67108864. W praktyce analizowane polimorfizmy przyjmują znacznie więcej możliwych wartości, co powoduje, że przy rutynowo oznaczanych w kryminalistyce, co najmniej 13 41

różnych polimorfizmach, szansa popełnienia błędu jest mniejsza niż 1:13 miliardów, a więc znacznie mniejsza niż ilość wszystkich ludzi na świecie. Wykrywanie mutacji techniką real-time Podobnie jak technika STR wyparła technikę RFLP, co raz częściej technika PCR-RFLP jest wypierana przez technikę real-time opisaną w poprzednim rozdziale. Technika ta umożliwa także wykrywanie mutacji. W tym przypadku stosuje się primery flankujące region w którym występuje mutacja, oraz dwie sondy, z których jedna jest komplementarna do sekwencji prawidłowej, a druga do sekwencji zmutowanej. Każda z sond znakowana jest innym znacznikiem fluorescencyjnym, co umożliwia ich rozróżnienie. W trakcie amplifikacji sondy przyłączają się do komplementarnej sekwencji i są degradowane co powoduje wzrost związanej z daną sondą fluorescencji. Jeśli sonda nie może znaleźć sekwencji komplementarnej, nie może się przyłączyć, w efekcie nie będzie degradowana. Nie będziemy więc obserwować związanego z nią wzrostu fluorescencji. Technika ta jest szybsza, analiza dokonywana jest w trakcie reakcji PCR, umożliwia pełną automatyzację, co praktycznie eliminuje ryzyko błędów ludzkich. Obecnie technika ta jest co raz częściej stosowana, jej ograniczeniem jest konieczność posiadania urządzenia do real-time PCR. Hybrydyzacja z allelem dzikim Hybrydyzacja z allelem zmutowanym Rysunek 5.8. Genotypowanie z wykorzystaniem techniki real-time PCR. Znakowana sonda hybrydyzuje z jednym z alleli, co powoduje w czasie reakcji PCR jej degradację i wzrost fluorescencji. Brak degradacji sondy świadczy o braku sekwencji komplementarnej. 42

Homozygoty Heterozygoty Homozygoty Rysunek 5.9. Wynik genotypowania techniką real-time PCR. Poszczególne próbki na podstawie fluorescencji mierzonej w dwóch kanałach można zakwalifikować do grupy homozygoty pod względem allelu dzikiego, homozygoty pod względem allelu zmutowanego lub heterozygoty. Technika western-blot Powszechnie wykorzystywaną w diagnostyce jest technika western-blot. Jest ona podobna do opisanych wcześniej technik Southern i northern blot, z tym, że w przypadku techniki western blot wykrywamy białka. Technika ta stanowi metodę referencyjną w diagnostyce bakteriologicznej i wirusologicznej, umożliwiając specyficzną identyfikację białek bakteryjnych lub wirusowych. Zazwyczaj w pierwszym etapie diagnostyki bazujemy na wykryciu specyficznych przeciwciał przeciwko określonej bakterii lub wirusowi. Jednak ich wykrycie niekoniecznie musi świadczyć o aktywnym zakażeniu, a możliwość wystąpienia reakcji krzyżowych ogranicza specyficzność metody. Stąd też w przypadku podejrzenia zakażenia niebezpiecznymi patogenami, np. wirusem HIV, oprócz diagnostyki serologicznej przeprowadza się dodatkowo diagnostykę molekularną polegającą na wykryciu obecności specyficznego dla patogenu kwasu nukleinowego lub specyficznych białek. W technice western blot, próbkę badaną rozdziela się na żelu poliakrylamidowym, przy czym samą próbkę przed rozdziałem ogrzewa się do około 95 C w buforze zawierającym SDS (siarczan dodecylu sodu). Jest to detergent anionowy, który z jednej strony chroni białko przed denaturacją termiczną, z drugiej strony przyłącza się do niego, nadając cząsteczce silny ładunek ujemny. W efekcie białka będą wędrować w czasie elektroforezy do anody. Po przeprowadzeniu elektroforezy transferuje się rozdzielone białka z żelu na membranę 43

nitrocelulozową lub z PVDF (polifluorku winylidenu). Nastęnie błonę inkubuje się z przeciwciałami skierowanymi przeciwko poszukiwanemu białku. Po inkubacji błonę płucze się i inkubuje z kolejnymi przeciwciałami znakowanymi fluorescencyjnie lub enzymatycznie (patrze rozdział Zastosowanie przeciwciał w diagnostyce ). W efekcie uzyskujemy w miejscu wystąpienia poszukiwanego białka prążek. Jego położenie zależne jest od masy cząsteczkowej białka. W efekcie technika western blot jest bardzo specyficzna białko identyfikuje się na podstawie jego masy cząsteczkowej (elektroforeza) i obecności specyficznych determinant antygenowych (z którymi łączą się przeciwciała) rys. 5.10. Kontrole ++ + - Wyniki gp 160 gp 120 p 55 gp 41 p 31 p 24 Rysunek 5.10. Zastosowanie techniki western blot do identyfikacji zakażenia wiurusem HIV. Błona była inkubowana z koktajlem przeciwciał przeciwko antygenom wirusa HIV. Technika podobna do westen-blot może służyć także do identyfikacji profilu przeciwciał, np. w diagnostyce chorób autoimmunologicznych jest to odmiana testu, tzw. strip line. W tego typu teście na błonie w określonych pozycjach immobilizowane są kontrolne antygeny przeciwko którym poszukujemy przeciwciał. Taką błonę inkubuje się z surowicą badaną, następnie płucze i inkubuje z surowicą antyglobulinową znakowaną enzymem. W miejscu zajścia reakcji pojawia się prążek. Zasada metody została opisana w ćwiczeniu 3. 44

CZĘŚĆ PRAKTYCZNA ĆWICZENIE 1 Badanie polimorfizmu insercyjno-delecyjnego genu enzymu konwertującego Występowanie pewnych polimorfizmów DNA w obrębie genów kodujących poszczególne elementy układu renina - angiotensyna (angiotensynogen, receptor AT1 i enzym konwertujący) jest czynnikiem predysponującym do wystąpienia chorób układu krążenia. Wiąże się to z istotną rolą nadmiernej aktywacji tkankowego układu RA w ścianie naczyniowej i sercu w patogenezie miażdżycy tętnic, zawału mięśnia sercowego oraz przerostu lewej komory serca. Polimorfizm genu kodującego enzym konwertujący (EK) polega na występowaniu (insercja I) lub braku (delecja D) fragmentu o długości 287 par zasad w obrębie intronu 16. Możliwe są więc trzy genotypy: homozygoty DD oraz II, a także heterozygota ID. Polimorfizm insercyjno-delecyjny dotyczy części niekodującej, brak zatem zmian w budowie białka enzymatycznego. Stwierdza się natomiast zwiększenie aktywności EK i wzrost stężenia tego białka we krwi nosicieli allelu D. Analiza polimorfizmu genu ACE przebiega w trzech etapach: 1. Izolowanie DNA z leukocytów krwi obwodowej. 2. Powielenie badanego fragmentu genu za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). 3. Rozdział elektroforetyczny produktu PCR na żelu agarozowym. DNA po wyizolowaniu może być przechowywane w temperaturze 4ºC lub zamrożone do czasu przeprowadzenia analizy. Za pomocą aparatu Gene Quant dokonuje się pomiaru stężenia i czystości uzyskanego DNA, a następnie rozcieńcza wodą dla uzyskania stężenia końcowego 100 ng/µl. Do amplifikacji należy przygotować mieszaninę reakcyjną o następującym składzie: bufor PCR, dntp, startery, woda, matryca DNA oraz polimeraza w ilościach i stężeniach przedstawionych w tabeli 5.1. 45

Tabela 5.1. Skład mieszaniny reakcyjnej używanej podczas badania polimorfizmu genu enzymu konwertującego. Odczynnik Ilość Objętość dla 1 próbki (µl) bufor PCR 10x (15 mm MgCl 2 ) 1X 5 2 mm dntp (2 nmol/µl) 10 nm 5 primer ACE F (10 pmol/µl) 50 pm 5 primer ACE R (10 pmol/µl) 50 pm 5 H 2 O - 25 polimeraza DNA (2 U/µl) 2 U 1 matryca DNA (100 ng/µl) 400 ng 4 Razem: 50 Mieszaninę reakcyjną przygotowuje się w łaźni lodowej. Szczególną uwagę należy zwrócić na polimerazę, którą trzeba przez cały czas przechowywać w zamrażarce i wyjmować tylko w momencie dodawania do mieszaniny reakcyjnej. Amplifikację przeprowadza się w termocyklerze UNO II po zaprogramowaniu następujących warunków reakcji PCR (Tabela 5.2). Tabela 5.2. Warunki prowadzenia reakcji PCR podczas badania polimorfizmu genu enzymu konwertującego. Etap Temperatura ( o C) Czas (min.) denaturacja wstępna 94 5 3 5 denaturacja 94 1 c y k l i wiązanie starterów 60 1 synteza 72 1 synteza końcowa 72 10 46

Ostatnim etapem jest rozdział elektroforetyczny produktu amplifikacji na 1% żelu agarozowym w aparacie SUBMINI przy napięciu 80V przez 30 min. Przygotowanie żelu agarozowego: odważyć 0,5 g agarozy i rozpuścić w 50 ml buforu TBE, podgrzać roztwór do wrzenia, po uzyskaniu klarownego roztworu odstawić z palnika i ostudzić do temp. 60 o C, wlać roztwór do komory aparatu, odczekać do momentu zastygnięcia żelu, a następnie wyciągnąć grzebień, wyciągnąć boczne ścianki komory żel powinien być zanurzony pod powierzchnią buforu. Elektroforeza produktu PCR: przenieść 10 µl produktu PCR do probówki Eppendorfa, dodać 3 µl buforu obciążającego i przepipetować, nanieść mieszaninę za pomocą pipety z długą końcówką do dołków w żelu agarozowym, podłączyć aparat SUBMINI do zasilacza, ustawić czas (30 min) i napięcie (80 V), do 50 ml buforu TBE dodać 5 µl barwnika SyberGreen (toksyczny, interkaluje z DNA), przelać do kuwety. Inkubować z żelem 20-30 minut, wyjąć żel z kuwety, położyć na płytce transiluminatora UV i ocenić wynik rozdziału (rys. 5.11). 47

START 487 pz 190 pz Marker masy II ID DD GENOTYP Rysunek 5.11. Analiza polimorfizmu genu enzymu konwertującego metodą PCR obraz elektroforezy produktu PCR rozdzielonego na żelu poliakrylamidowym. ĆWICZENIE 2 Analiza polimorfizmu T174M za pomocą metody RFLP Polimorfizm T174M polega na zamianie zasad (T C) w kodonie 174 genu angiotensynogenu. Jest to jeden z kilku polimorfizmów genu kodującego angiotensynogen, związanych ze zwiększonym ryzykiem chorób układu sercowo-naczyniowego. Do jego badań używa się enzymu restrykcyjnego (Nco I), wytwarzanego przez bakterie Nocardia corallina, hydrolizującego nić DNA w miejscu występowania następującej sekwencji 5 -C C-A-T-G-G-3 3 -G-G-T-A-C C-5 W przypadku występowania allelu T po trawieniu produktu reakcji PCR uzyskuje się fragment o długości 303 par zasad, natomiast u nosicieli allelu M pojawia się miejsce 48

restrykcyjne i powstają 2 fragmenty o długościach 210 i 93 par zasad. Fragmenty te posiadają lepkie końce, tak więc przed rozdziałem elektroforetycznym konieczne jest doprowadzenie do ich rozłączenia. Trawienie produktu PCR enzymem Nco I 1. Sporządzić mieszaninę reakcyjną według tabeli 5.3, 2. Umieścić mieszaninę w temp. 37 C na 10 godzin, 3. Przygotowując żel agarozowy odważyć 0,5 g agarozy i rozpuścić w 50 ml buforu TBE. Przygotować żel jak podczas analizy polimorfizmu genu ACE. 4. Elektroforeza produktu trawienia: przenieść 10 µl produktu trawienia RFLP do probówki Eppendorfa, dodać 3 µl buforu obciążającego i przepipetować, nanieść mieszaninę za pomocą pipety z długą końcówką do dołków w żelu agarozowym, podłączyć aparat SUBMINI do zasilacza, ustawić czas (40 min) i napięcie (80 V), do 50 ml buforu TBE dodać 5 µl barwnika SyberGreen (toksyczny, interkaluje z DNA), przelać do kuwety. Inkubować z żelem 20-30 minut, wyjąć żel z kuwety, położyć na płytce transiluminatora UV i ocenić wynik rozdziału (rys. 5.12). Tabela 5.3. Skład mieszaniny reakcyjnej używanej podczas trawienia produktu PCR enzymem Nco I. Odczynnik Ilość Ilość dla 1 próbki (µl) bufor 10X 1X 1,5 Nco I (10 U/µl) 2U 0,2 H 2 O - 3,3 produkt PCR - 10 Razem - 15 49

- START 303 pz 210 pz + Marker masy TM MM TM TT GENOTYP 93 pz Rysunek 5.12. Analiza polimorfizmu T174M genu kodującego angiotensynogen metodą RFLP - obraz elektroforezy produktu PCR po trawieniu enzymem restrykcyjnym Nco I, rozdzielonego na żelu poliakrylamidowym. ĆWICZENIE 3 DIAGNOSTYKA SEROLOGICZNA BORELIOZY METODĄ WESTERN BLOT (W OPARCIU O ZESTAW EUROLINE-WB FIRMY EUROIMMUN) Borelioza (choroba z Lyme) jest wielonarządową chorobą wywoływaną przez krętki z rodzaju Borrelia: B. burgdorferi, B. afzelii oraz B. garinii. Głównym rezerwuarem tych bakterii są ssaki oraz niektóre gatunki ptaków. Przenoszone są na człowieka za pośrednictwem kleszczy z rodzaju Ixodes. Objawy boreliozy są niespecyficzne i mogą być mylone z młodzieńczym reumatoidalnym zapaleniem stawów, toczniem rumieniowatym, stwardnieniem rozsianym, gorączką reumatyczną, zapaleniem mięśnia sercowego i wirusowym zapaleniem opon mózgowych. W przebiegu boreliozy można wyróżnić trzy stadia: wczesne, rozsiane oraz przewlekłe. Stadium wczesne charakteryzuje się przede wszystkim zmianami skórnymi, pojawiają się m.in: rumień wędrujący, rumień mnogi, niezłośliwy chłoniak skóry. W stadium rozsianym 50

dochodzi do dalszego rozwoju zmian skórnych, ponadto występują ostre stany zapalne ośrodkowego i obwodowego układu nerwowego, serca, stawów. Stadium przewlekłe choroby rozwija się nawet po wielu miesiącach bądź latach od ukąszenia i może występować jako postać skórna (czerwone przebarwienia skóry z obrzękiem naciekowym), postać stawowa (zesztywnienie stawów) lub postać neuroinfekcyjna (zapalenie nerwu wzrokowego, zapalenie rogówki, tęczówki lub naczyniówki). Diagnostykę boreliozy przeprowadza się dwuetapowo. W pierwszym etapie poszukuje się swoistych przeciwciał klasy IgG lub IgM metodą immunoenzymatyczną. U osób z wynikami dodatnimi lub wątpliwymi przechodzi się do drugiego etapu diagnostyki, który obejmuje wykonanie oznaczenia techniką western-blot. Przeciwciała klasy IgM mogą być wykrywane już w 2 tygodniu choroby, jednak u wielu chorych ich obecność ujawnia się znacznie później. Przeciwciała te mogą przetrwać przez wiele lat nawet po skutecznej eradykacji zakażenia. Późne stadium boreliozy charakteryzuje się obecnością przeciwciał klasy IgG. ZASADA METODY Białka antygenowe specyficzne dla B. afzelii uzyskiwane są poprzez klonowanie bądź też izolowane z bakterii i oczyszczane. Następnie rozdzielane elektroforetycznie na żelu poliakrylamidowym w obecności siarczanu dodecylu sodu i transferowane na membranę nitrocelulozową. Tak przygotowana membrana po wysuszeniu jest cięta na paski i pakowanaw takiej postaci dostarczana w gotowym do użycia zestawie. Jednocześnie, z każdej membrany nitrocelulozowej wybierane są dwa paski, które inkubowane są z dodatnią surowicą referencyjną- stanowią one kontrolę pozytywną. Pasek kontrolny dołączony jest do każdego zestawu. Podczas analizy paski testowe inkubuje się z rozcieńczoną surowicą pacjenta. W czasie inkubacji swoiste przeciwciała klasy IgG (jeśli występują) wiążą się z antygenami na pasku tworząc kompleksy immunologiczne. Następnie paski płucze się i inkubuje ze skoniugowanymi z fosfatazą alkaliczną przeciwciałami skierowanymi przeciw ludzkim immunoglobulinom klasy IgG. Niezwiązane koniugaty usuwa się poprzez dodatkowe płukanie. Związane z paskiem przeciwciała uwidacznia się poprzez dodanie substratu dla enzymu i powstanie barwnego produktu. 51

Tabela 5.4. Swoistość antygenów dla Borrelia na pasku testowym. Pasmo Antygen Swoistość markera VIsE Variable major protein-like sequence, expressed Lipoproteina ulegająca ekspresji tylko in vivo, wysoce swoisty 83 kda Membrane-vesical protein, p 83 Swoisty 41 kda Flagellina, p 41 Swoisty dla rodzaju, reakcje krzyżowe z innymi krętkami Spirochaetaceae 39 kda BmpA, p 39 Swoisty 31 kda OspA, p 31 Białko powierzchniowe A, swoisty 30 kda P 30 Swoisty 25 kda OspC, p 25 Białko powierzchniowe C, swoisty marker świeżej infekcji 21 kda P 21 Swoisty 19 kda P 19 Swoisty 17 kda P 17 Swoisty 52

Rysunek 5.13. Zasada diagnostyki boreliozy techniką western-blot. W metodzie tej materiałem badanym może być surowica bądź osocze pobrane na EDTA, heparynę bądź cytrynian. Przed wykonaniem oznaczenia próbki mogą być przechowywane do 14 dni w temperaturze 2-8 C. PRZYGOTOWANIE PRÓBEK Surowicę badaną rozcieńczyć w buforze uniwersalnym w stosunku 1:51 (np.: 30 µl surowicy i 1,5 ml buforu) i dobrze wymieszać. WYKONANIE OZNACZENIA 1. Przy pomocy pęsety ostrożnie wyjąć potrzebną ilość pasków z opakowania. UWAGA!!! Nie należy dotykać paska rękami. Umieścić paski we wcześniej przygotowanych kuwetach. 2. Do każdej kuwety wprowadzić po 1,5 ml buforu uniwersalnego. Upewnić się że wszystkie paski są zanurzone w roztworze. Inkubować 15 minut na kołysce laboratoryjnej w temperaturze pokojowej. 3. Całkowicie usunąć roztwór z kuwet. 4. Do każdej kuwety wprowadzić 1,5 ml rozcieńczonej surowicy badanej. Inkubować 30 minut na kołysce laboratoryjnej w temperaturze pokojowej. 5. Po zakończeniu inkubacji wylać roztwory z kuwet uważając aby nie uszkodzić membrany. 53

6. Do każdej kuwety wprowadzić po 1,5 ml buforu uniwersalnego. Inkubować 5 minut na kołysce laboratoryjnej. 7. Dokładnie usunąć roztwór płuczący z każdej kuwety. 8. Powtórzyć płukanie (punkt 6 i 7) jeszcze dwa razy. Po ostatnim płukaniu upewnić się czy w kuwecie nie pozostał roztwór płuczący. 9. Do każdej kuwety dodać 1,5 ml roztworu koniugatu (zawierającego przeciwciała przeciw ludzkim IgG sprzężone z fosfatazą alkaliczną) i inkubować 30 minut na kołysce laboratoryjnej. 10. Po zakończeniu inkubacji wylać roztwory z kuwet uważając aby nie uszkodzić membrany. 11. Trzykrotnie przepłukać membranę buforem uniwersalnym (punkt 6 i 7). 12. Po ostatnim płukaniu do każdej kuwety wprowadzić po 1,5 ml roztworu substratu i inkubować 10 minut na kołysce laboratoryjnej. 13. Po tym czasie wylać roztwory z kuwet i dodać 2 ml wody destylowanej. Przepłukać paski wodą trzykrotnie. 14. Za pomocą pęsety przenieść paski na ręcznik papierowy i pozostawić w ciemnym miejscu do wyschnięcia. 15. Analizę przeprowadzać po całkowitym wyschnięciu membrany wizualnie lub przy pomocy densytometru. ANALIZA WYNIKÓW Analizę przeprowadza się poprzez wizualną bądź densytometryczną ocenę intensywności zabarwienia poszczególnych prążków. Natężenie barwy określa się jako: Brak wybarwienia 0 Słabe wybarwienie (+) Silne wybarwienie + Ocenę testu przeprowadza się zgodnie ze schematem przedstawionym w tabeli 5.5. 54

Tabela 5.5. Schemat oceny testu EUROLINE-WB. Swoiste pasma antygenowe: p83, p39, p31, p30, p25, p21, p19 oraz p17 2 lub więcej pasm pozytywnych 1 pasmo pozytywne Brak pasma Pasmo pozytywne pozytywny pozytywny pozytywny VIsE Pasmo graniczne pozytywny pozytywny graniczny Pasmo negatywne pozytywny graniczny negatywny Rysunek 5.14. Schemat paska kontrolnego. 55

Rysunek 5.15. Wynik analizy surowicy pacjenta chorego na boreliozę. 56