Optymalizacja procesu jednoczesnej hydrolizy i fermentacji natywnej skrobi metod¹ powierzchni odpowiedzi

PRACE EKSPERYMENTALNE Optymalizacja procesu jednoczesnej hydrolizy i fermentacji natywnej skrobi metod¹ powierzchni odpowiedzi Wojciech Bia³as, Dorota Wojciechowska, Daria Szymanowska, W³odzimierz Grajek Katedra Biotechnologii i Mikrobiologii ywnoœci, Uniwersytet Przyrodniczy, Poznañ Optimization of simultaneous saccharification and fermentation of the native starch by using response surface method Summary Ethanol production, by a simultaneous saccharification and fermentation process (SSF) of native starch from corn flour, has been performed by Saccharomyces cerevisiae (Ethanol Red) and granular starch hydrolyzing enzyme (STARGEN 001). The quantitative effects of mash concentration, enzyme dose and ph were investigated by the use a Box Wilson central composite design protocol. It was found that for native corn starch, maximum ethanol concentration of 110,36 g/l was obtained using a mash concentration of 25%, which resulted in ethanol yield of 85,71%. The optimum conditions for the above yield were found for the enzyme dose of 2,05 ml/kg and ph of 5.0. These results indicated that by using the central composite design, it is possible to determine accurate values of the fermentation parameters for maximum ethanol production. Adres do korespondencji Wojciech Bia³as, Katedra Biotechnologii i Mikrobiologii ywnoœci, Uniwersytet Przyrodniczy, ul. Wojska Polskiego 48, 60-627 Poznañ. 4 (87) 183 199 2009 Key words: bioethanol, native starch, simultaneous saccharification and fermentation, response surface method. 1. Wprowadzenie Etanol uzyskiwany na drodze fermentacji biopolimerów takich jak skrobia i celuloza jest alternatyw¹ dla paliw pochodzenia kopalnego. G³ówne zalety jakie p³yn¹ z wykorzystania tego

Wojciech Bia³as i inni rodzaju substratów zwi¹zane s¹ z ograniczeniem emisji gazów cieplarnianych jak równie aktywacj¹ terenów wiejskich poprzez zwiêkszenie produkcji rolniczej na cele energetyczne oraz zwi¹zane z tym tworzenie nowych miejsc pracy (1). Fermentacja skrobi jest procesem znacznie bardziej z³o onym ani eli fermentacja cukrów takich jak glukoza czy sacharoza, bowiem skrobia musi zostaæ w pierwszym etapie przekszta³cona do cukrów fermentuj¹cych, które w kolejnych etapach s¹ przekszta³cane do etanolu. W celu uzyskania praktycznie ca³kowitej konwersji skrobi do cukrów fermentuj¹cych wymagane jest zastosowanie termostabilnej -amylazy oraz glukoamylazy (2). W przypadku technologii tradycyjnej surowiec skrobiowy jest na wstêpie mieszany z wod¹ oraz termostabiln¹ -amylaz¹ i podgrzewany do temp. 110 C. ród³em ciep³a jest para wodna wprowadzana bezpoœrednio do surowca za pomoc¹ strumienicy, co pozwala na jego dok³adne wymieszanie i równomierne podgrzanie. Po up³ywie oko³o 15 min mieszaninê ch³odzi siê do temp. 80-90 C i dodaje kolejn¹ porcjê -amylazy. Wysoka temperatura oraz obecny w mieszaninie enzym powoduj¹, e skrobia ulega jednoczeœnie procesowi kleikowania i up³ynniania, czemu towarzyszy wyraÿny spadek lepkoœci. Obserwowane zmiany s¹ rezultatem hydrolizy skrobi g³ownie do maltozy, maltotriozy oraz dekstryn. W kolejnej fazie procesu, po sch³odzeniu mieszaniny do temperatury oko³o 60 C dodaje siê glukoamylazê, co ma na celu konwersjê wymienionych zwi¹zków do glukozy i maltozy (3). W trzecim etapie do zacieru, po jego uprzednim sch³odzeniu do temperatury oko³o 30-32 C, wprowadza siê zawiesinê dro d y gorzelniczych stanowi¹cych tzw. matkê dro d ow¹. Istotn¹ wad¹ procesu prowadzonego zgodnie z technologi¹ tradycyjn¹ jest bardzo du e zu ycie energii podczas etapu zacierania, co powoduje, e ostateczne koszty wytwarzania etanolu s¹ znaczne. Wed³ug Lim i wsp., (4) zapotrzebowanie na energiê w procesie zacierana siêga 30-40% ca³kowitej wartoœci energii wymaganej do wyprodukowania etanolu. Aby zwi¹zek ten móg³ konkurowaæ z paliwami uzyskiwanymi na drodze przerobu surowców kopalnych wymagane jest znaczne obni enie kosztów jego wytwarzania. Istnieje kilka alternatywnych rozwi¹zañ pozwalaj¹cych na znaczne zmniejszenie zu ycia energii podczas produkcji etanolu. Jedn¹ z proponowanych metod jest zastosowanie enzymów amylolitycznych o ca³kowicie nowych w³aœciwoœciach, pozwalaj¹cych na hydrolizê natywnej skrobi, nie poddanej procesowi kleikowania. Stosowane dotychczas amylazy wykazywa³y wysok¹ aktywnoœæ hydrolityczn¹ wy³¹cznie w stosunku do skleikowanej skrobi, jednak ju w 1954 r. Sandsted i Gates (5) dowiedli, e istnieje mo liwoœæ hydrolizy natywnej skrobi, a stopieñ konwersji ziaren skrobiowych zale y zarówno od pochodzenia enzymu jaki i botanicznego pochodzenia samego substratu. W badaniach prowadzonych w kolejnych latach przez Ueda i wsp., (6), Miah i Ueda (7) oraz Mikami i wsp., (8) sugerowano, e Ÿród³em tego rodzaju enzymów mog¹ byæ m.in. Aspergillus awamori, Aspergillus oryzae oraz Aspergillus kawachi. Dziêki postêpowi jaki dokona³ siê w ostatnich latach w biologii molekularnej, na rynku pojawi³y siê dwa komercyjne preparaty enzymatyczne wykazuj¹ce aktywnoœæ amylolityczn¹ w stosunku do natywnej skrobi, STARGEN 001, 184 PRACE EKSPERYMENTALNE

Optymalizacja procesu jednoczesnej hydrolizy i fermentacji natywnej skrobi metod¹ powierzchni odpowiedzi opracowany przez firmê Genencor International oraz BPX opracowany przez firmê Nowozymes NA. Pierwszy z wymienionych preparatów stanowi kompleks dwóch enzymów: termostabilnej -amylazy pochodz¹cej z Aspergillus kawachi, a produkowanej przez Trichoderma reesei oraz glukoamylazy izolowanej z Aspergillus niger. Zastosowanie tego preparatu umo liwia pominiêcie energoch³onnego etapu kleikowania i up³ynniania skrobi prowadzonego na gor¹co, co tym samym znacznie zmniejsza ca³kowite koszty procesu. Poza tym preparat ten nie wymaga stosowania dodatku aktywatora, którym w przypadku wiêkszoœci amylaz s¹ jony wapnia. Warto dodaæ, e eliminacja procesu kleikowania pozwala ponadto na stosowanie zacierów o znacznie wy szych stê eniach, siêgaj¹cych nawet 40% (ww.), zaciery te maj¹ bowiem znacznie ni sz¹ lepkoœæ. Warto zauwa yæ, e eliminacja obróbki termicznej w pierwszej fazie procesu technologicznego mo e mieæ jednak negatywne skutki dla wydajnoœci fermentacji, zwiêksza siê bowiem ryzyko zaka enia mikrobiologicznego. Obróbka termiczna bowiem poza tym, e ma na celu skleikowanie surowca powoduje równie inaktywacjê niepo ¹danej mikroflory bytuj¹cej na przyk³ad na jego powierzchni. Wed³ug Nicols i wsp., (2006) wysoka temperatura sprzyja tak e uwalnianiu skrobi z jej po³¹czeñ z bia³kami oraz ca³kowicie eliminuje toksyczne dzia³anie niektórych substancji zawartych w ziarnie zbó, co tym samym pozwala na uzyskanie wiêkszej wydajnoœæ fermentacji. Poza badaniami, maj¹cymi na celu opracowanie nowych preparatów enzymatycznych du o uwagi poœwiêca siê tak e optymalizacji samego procesu fermentacji. Powszechnie wiadomo, e hydroliza skrobi katalizowana przez enzymy amylolityczne podlega silnej represji przez uwalniany w jej trakcie produkt. Jednym ze sposobów wyeliminowania tego zjawiska jest jednoczesna hydroliza i fermentacja (SSF, ang. Simultaneous Saccharification and Fermentation), podczas której glukoza jest na bie ¹co metabolizowana przez komórki dro d y. Utrzymanie stosunkowo niskiego stê enia glukozy w czasie fermentacji pozwala tak e znacznie ograniczyæ stres osmotyczny dzia³aj¹cy na komórki. W rezultacie wiêkszoœæ reakcji przebiega z prêdkoœci¹ zbli on¹ do maksymalnej, dziêki czemu mo liwe jest skrócenie czasu trwania fermentacji. Poza tym produkcja etanolu oparta na technologii SSF pozwala znacznie zredukowaæ koszty inwestycyjne, bowiem hydroliza i fermentacja prowadzone s¹ w jednym bioreaktorze, wyposa onym w mieszad³o oraz uk³ad regulacji temperatury (10). Mimo wielu niezaprzeczalnych zalet technologia ta posiada tak e pewne wady, zwi¹zane g³ównie z ró nicami pomiêdzy optymalnymi temperaturami dla dzia³ania enzymów i wzrostu komórek dro d y (11). W przypadku gluko- oraz -amylazy temperatura ta wynosi oko³o 60 C, podczas gdy dla wiêkszoœci ras dro - d y gorzelniczych optimum zawiera siê w zakresie 30-32 C. St¹d te temperatura tego procesu oscyluje zwykle w okolicach 35 C, co stanowi kompromis pomiêdzy optimum dla funkcjonowania enzymów i wzrostu dro d y. Wed³ug Philippidis i Smith (12) szybkoœæ z jak¹ przebiega hydroliza decyduje o ostatecznej szybkoœci wytwarzania etanolu w SSF, dlatego te jedyn¹ metod¹ utrzymania jej na odpowiednim poziomie jest podwy szenie temperatury dziêki zastosowaniu nowych ras dro d y BIOTECHNOLOGIA 4 (87) 183-199 2009 185

Wojciech Bia³as i inni oraz szczepów bakterii. Tego rodzaju rozwi¹zanie zaproponowa³ m.in. Ward i wsp., (13), który w procesie jednoczesnej hydrolizy i fermentacji skrobi prowadzonej w temperaturze 45 C wykorzysta³ mieszan¹ kulturê, w sk³ad której wchodzi³y termotolerancyjne dro d e Kluveromyces marxianus oraz termofilne grzyby strzêpkowe Taloromyces emersonii. Proces jednoczesnej hydrolizy i fermentacji, zastosowany na szerok¹ skalê po raz pierwszy w latach siedemdziesi¹tych ubieg³ego wieku jest stosunkowo dobrze poznany i opisany w literaturze przedmiotu, o czym œwiadcz¹ liczne prace naukowe (14,15). Brak jednak informacji na temat optymalizacji jednoczesnej hydrolizy i fermentacji substratu jakim jest m¹ka kukurydziana przy u yciu enzymów hydrolizuj¹cych natywn¹ skrobiê. Dlatego te prezentowane badania mia³y na celu okreœlenie optymalnych warunków jednoczesnej hydrolizy i fermentacji gêstych zacierów kukurydzianych nie poddanych wczeœniej procesowi kleikowania przy u yciu enzymów hydrolizuj¹cych natywn¹ skrobiê i dro d y Saccharomyces cerevisiae, rasy Ethanol Red. 2. Materia³y i metody 2.1. Surowiec Do badañ optymalizacyjnych stosowano m¹kê kukurydzian¹ (BIO CORN, Ziêbice, Polska). Surowiec zawiera³ 90,06% skrobi. Œrednia granulacja surowca wed³ug danych producenta wynosi³a 250 m. 2.2. Dro d e W badaniach stosowano liofilizowane dro d e gorzelnicze Saccharomyces cerevisiae, rasy Ethanol Red (Lesaffre, Francja), zawieraj¹ce wed³ug danych producenta 20 10 9 jtk/g. 2.3. Enzymy W badaniach wykorzystywano enzym STARGEN 001 zawieraj¹cy -amylazê pochodz¹ca z Aspergillus kawachi produkowan¹ przez zmodyfikowany szczep Trichoderma reesei oraz glukoamylazê izolowan¹ z Aspergillus niger (Genencore International, USA). Aktywnoœæ enzymatyczna preparatu wynosi³a 456 GSHU/g (ang. Granular Starch Hydrolyzing Units). Poza tym stosowano kwaœn¹ proteazê GC 106 z Aspergillus niger (Genencore International, USA), co mia³o na celu hydrolizê bia³ek obecnych 186 PRACE EKSPERYMENTALNE

α α

α

Wojciech Bia³as i inni 2.7. Eksperymenty walidacyjne W celu przeprowadzenia walidacji wyznaczonych modeli regresji wykonano trzy eksperymenty fermentacyjne o losowo wybranych wartoœciach zmiennych X 1,X 2 ix 3 (zawartych w badanym przedziale zmiennoœci) oraz jeden eksperyment o parametrach optymalnych wskazanych na podstawie wspomnianych kryteriów. Nastêpnie porównano uzyskane wyniki eksperymentalne z wartoœciami przewidywanymi przez modele regresji. 2.8. Analizy Próby przed oznaczeniem stê enia glukozy oraz etanolu wirowano przy 4000 g przez 10 min w temperaturze 4 C (Multifuge 3SR, Niemcy), a nastêpnie filtrowano przez filtry o porowatoœci 0,22 m (Millex GS, Millipore, USA). Oznaczenia wykonywano na chromatografie cieczowym (Merck Hitachi, Niemcy) wyposa onym w kolumnê Aminex HPX-87P (Bio-Rad, USA) oraz detektor refraktometryczny (Model L-7490, Merck Hitachi, Niemcy). Rozdzia³ prowadzono w temperaturze 30 C, stosuj¹c w charakterze eluentu 5 mm H 2 SO 4, przy przep³ywie 0,6 ml/min. Stê enie skrobi oznaczano korzystaj¹c z metody enzymatycznej opracowanej przez Holm i wsp. (16). Ponadto do oznaczenia stê enia cukrów redukuj¹cych wykorzystano metodê z kwasem 3,5-dinitrosalicylowym (DNS) opracowan¹ przez Millera (17). 3. Wyniki i dyskusja Proces jednoczesnej hydrolizy i fermentacji jest bardzo z³o ony, bowiem w tym samym czasie i œrodowisku maj¹ miejsce ró nego rodzaju wzajemnie ze sob¹ powi¹zane przemiany prowadz¹ce w rezultacie do powstania produktu koñcowego jakim jest etanol. O z³o onoœci tego uk³adu mo e œwiadczyæ to, e zmniejszenie szybkoœci jednej z przemian powoduje zazwyczaj hamowanie kolejnej w skutek niedoboru substratu lub nagromadzenia jednego z poœrednich produktów. Dlatego te poszukiwanie optymalnych warunków dla prowadzenia tego rodzaju procesów klasyczn¹, jednowymiarow¹ metod¹, gdzie modyfikacji podlega tylko jeden z czynników, podczas gdy pozosta³e przyjmuj¹ sta³e wartoœci jest bardzo czasoch³onne i kosztowne. Poza tym istotn¹ wad¹ tego rodzaju podejœcia do badañ jest brak mo - liwoœci wykrycia ewentualnych interakcji jakie mog¹ wystêpowaæ pomiêdzy poszczególnymi czynnikami. W takim przypadku alternatyw¹ dla podejœcia klasycznego jest metoda powierzchni odpowiedzi (ang. RSM, Response Surface Method) stanowi¹ca zestaw technik matematycznych i statystycznych szczególnie u ytecznych, wówczas gdy badane zjawisko podlega wp³ywowi wielu czynników i gdy celem jest okreœlenie optymalnych parametrów procesu spe³niaj¹cych za³o one na wstêpie 190 PRACE EKSPERYMENTALNE

Optymalizacja procesu jednoczesnej hydrolizy i fermentacji natywnej skrobi metod¹ powierzchni odpowiedzi kryteria (18). Z tego wzglêdu podjêto siê wykonania badañ z zastosowaniem tej metody, które mia³y na celu okreœlenie optymalnych warunków jednoczesnej hydrolizy i fermentacji gêstych zacierów kukurydzianych nie poddanych wczeœniej procesowi kleikowania przy u yciu enzymów hydrolizuj¹cych natywn¹ skrobiê i dro d y Saccharomyces cerevisiae, rasy Ethanol Red. W tabeli 3 zestawione zosta³y uœrednione wyniki z 3 powtórzeñ eksperymentu wykonanych wg centralnego planu kompozycyjnego, na podstawie których budowano modele regresji u yte nastêpnie do optymalizacji procesu. 3.1. Model powierzchni odpowiedzi dla stê enia etanolu (Y 1 ) Zgodnie z danymi zawartymi w tabeli 3 koñcowe stê enia etanolu w zacierach odfermentowanych zawiera³o siê w zakresie 79,09-120,02g/L. Maksymalne stê enie uzyskano w hodowli 10, w której stê enie zacieru wnosi³o 35%, podczas gdy dawka enzymu by³a równa 3 ml/kg s.m. m¹ki. Natomiast minimalne stê enie uzyskano w hodowli 13, o stê eniu zacieru równym 30% i dawce enzymu 0,3 ml/kg s.m. m¹ki. Na podstawie tych danych sugeruje siê, e najsilniejszy wp³yw na stê enie produktu mia³a dawka stosowanego preparatu enzymatycznego. W celu weryfikacji tej hipotezy wykonano analizê statystyczn¹ metod¹ regresji wielokrotnej. Na podstawie uzyskanych wyników stwierdzono, e modelem najlepiej dopasowanym do danych doœwiadczalnych by³ zredukowany model kwadratowy, dla którego p < 0,0001, a wielkoœæ poprawionego wspó³czynnika determinacji Adj. R 2 wynosi³a 0,841 (tab. 4). Ponadto wielkoœæ prawdopodobieñstwa wyznaczona dla testu braku dopasowania (ang. Lack-of-fit) by³a równa 0,117, co jednoznacznie potwierdzi³o, e przyjêty model regresji mo e byæ wykorzystany do predykcji badanej wielkoœci w przyjêtym na wstêpie zakresie zmiennoœci czynników wejœciowych. Wyniki doœwiadczeñ wykonanych wed³ug centralnego planu kompozycyjnego Tabela 3 Hodowla Blok Wartoœci rzeczywiste X i Zmienne zale ne Y i X 1 X 2 X 3 Y 1 Y 2 1 2 3 4 5 6 7 1 1 35,0 0,750 5,00 112,43 62,43 2 1 30,0 1,875 4,25 113,30 73,39 3 1 35,0 3,000 3,50 116,78 64,84 4 1 30,0 1,875 4,25 117,19 75,91 5 1 25,0 0,750 3,50 94,58 73,52 6 1 25,0 3,000 5,00 106,82 83,03 7 2 30,0 1,875 4,25 119,43 77,36 BIOTECHNOLOGIA 4 (87) 183-199 2009 191

Optymalizacja procesu jednoczesnej hydrolizy i fermentacji natywnej skrobi metod¹ powierzchni odpowiedzi Rys. 1. Zmiany stê enia etanolu po procesie fermentacji (Y 1 ) w zale noœci od: 1a stê enia zacieru (X 1 ) przy sta³ej dawce enzymu równej 1,875 ml/kg oraz 1b dawki preparatu enzymatycznego (X 2 ) przy sta³ym stê eniu zacieru równym 30%. W obu przypadkach ph wynosi³o 4,25. Symbole oznaczaj¹: œrednia, ----- 95% przedzia³ ufnoœci, 1 b³¹d standardowy œredniej. powinno wynosiæ 121,709 ± 1,52 g/l, przy stê eniu zacieru i dawce preparatu enzymatycznego wynosz¹cej odpowiednio 34,37% i 2,08 ml/kg. Podobne wyniki uzyskali Wang i wsp. (19), którzy porównywali iloœæ etanolu uzyskiwan¹ w technologii tradycyjnej z technologi¹ opart¹ na zastosowaniu preparatu STARGEN 001. Stwierdzili oni, e istotnie ró ni³ siê jedynie profil cukrów w trakcie fermentacji. W technologii wykorzystuj¹cej preparat STARGEN 001 blisko trzykrotnie mniejsza by³a bowiem zawartoœæ glukozy, maltozy i maltotriozy. Znacznie szybszy w porównaniu z technologi¹ tradycyjn¹ by³ tak e proces ich konwersji do etanolu, dziêki czemu jego maksy- Rys. 2. Wykres powierzchni odpowiedzi przedstawiaj¹cy wp³yw stê enia zacieru (X 1 ) i dawki preparatu enzymatycznego (X 2 )nastê- enie etanolu po procesie fermentacji (Y 1 )wyznaczony dla ph = 4,25. BIOTECHNOLOGIA 4 (87) 183-199 2009 193

Wojciech Bia³as i inni malny poziom uzyskiwano ju w 50. godzinie trwania fermentacji. Istotn¹ rolê preparatu enzymatycznego STARGEN 001 w procesie otrzymywania etanolu metod¹ SSF potwierdzaj¹ tak e wyniki badañ Suresh i wsp. (20). Jako substrat stosowali oni natywn¹ skrobiê pszeniczn¹ oraz skrobiê izolowan¹ z sorga. Enzymy amylolityczne pochodzi³y natomiast z Bacillus subtilis VB2. W rezultacie po 96 h fermentacji uzyskano oko³o 40 g/l etanolu, co stanowi blisko trzykrotnie ni sze stê enie w stosunku do wyników prezentowanych w tej pracy. Maj¹c na uwadze wspomnian¹ liniow¹ zale noœæ pomiêdzy wielkoœci¹ X 1 ay 1 mo na by s¹dziæ, e podobnie powinna siê kszta³towaæ zale noœæ pomiêdzy X 1 ay 2, czemu powinien towarzyszyæ wysoki wspó³czynnik korelacji r pomiêdzy tymi dwiema zmiennymi zale nymi (Y 1 iy 2 ). W praktyce okaza³o siê jednak, e wartoœæ liczbowa tego wspó³czynnika wynosi 0,22 (p = 0,35), co oznacza, e brak istotnego zwi¹zku pomiêdzy stê eniem etanolu i ca³kowit¹ wydajnoœci¹ procesu wyznaczon¹ w stosunku do wydajnoœci teoretycznej (Y 2 ). Dla wielu hodowli zaobserwowano ponadto, e zwiêkszaniu stê enia zacieru (X 1 ) towarzyszy wzrost koñcowego stê enia etanolu, przy jednoczesnym znacznym spadku wydajnoœci (tab. 3). W przypadku hodowli o optymalnych parametrach procesu, zapewniaj¹cych maksymalne przewidywane modelem regresji stê enie etanolu, prognozowana wydajnoœæ powinna wynosiæ oko³o 69,35%. Zak³adaj¹c, e wydajnoœæ technologii tradycyjnej oscyluje zwykle w granicach 90-95%, uzyskana wartoœæ jest stosunkowo niska i przyczynia siê do zwiêkszenia strat substratu i tym samym wzrostu ca³kowitych kosztów procesu SSF. Potwierdza to tak e, e optymalizacja tego rodzaju procesu technologicznego bezwzglêdnie wymaga nie tylko uwzglêdnienia stê enia etanolu w zacierze odfermentowanym, ale tak e wzajemnych relacji jakie wystêpuj¹ pomiêdzy badanymi zmiennymi niezale nymi (X 1,X 2,X 3 ) a wydajnoœci¹ (Y 2 ). 3.2. Model powierzchni odpowiedzi dla wydajnoœci etanolu (Y 2 ) Maksymaln¹ wydajnoœæ procesu fermentacji Y 2 wynosz¹c¹ 86,91% uzyskano w hodowli o stê eniu zacieru równym 23% i dawce enzymu 1,875 ml/kg s.m. m¹ki, natomiast najni sz¹ wydajnoœæ równ¹ 51,23% zanotowano, gdy stê enie zacieru wynosi³o 30%, a dawka enzymu by³a równa 0,3 ml/kg s.m. m¹ki. Na podstawie danych eksperymentalnych zawartych w tabeli 3 wyznaczono równanie regresji w postaci zredukowanego wielomianu drugiego stopnia (tab. 4). Wyznaczony model by³ wysoce istotny, o czym œwiadczy³a wartoœæ prawdopodobieñstwa (p < 0,0001) oraz poprawionego wspó³czynnika determinacji, Adj. R 2 równa 0,913. Wynik testu braku dopasowania, podobnie jak w przypadku modelu wyznaczonego dla zmiennej Y 1 by³ statystycznie nieistotny (p = 0,092), co potwierdza, e równanie regresji mo e byæ z powodzeniem wykorzystane do przewidywania wydajnoœci procesu jednoczesnej hydrolizy i fermentacji w badanym zakresie zmiennych niezale nych. Na podstawie danych przedstawionych w tabeli 4 wskazuje siê, e wydajnoœæ procesu fermentacji 194 PRACE EKSPERYMENTALNE

Optymalizacja procesu jednoczesnej hydrolizy i fermentacji natywnej skrobi metod¹ powierzchni odpowiedzi Rys. 3. Zmiany wydajnoœci procesu fermentacji (Y 2 ) w zale noœci od: 3a stê enia zacieru (X 1 ) przy sta³ej dawce enzymu równej 1,875 ml/kg oraz 3b dawki preparatu enzymatycznego (X 2 ) przy sta³ym stê eniu zacieru równym 30%. W obu przypadkach ph wynosi³o 4,25. Symbole oznaczaj¹: œrednia, ----- 95% przedzia³ ufnoœci, 1 b³¹d standardowy œredniej. (Y 2 ) by³a ujemnie skorelowana ze stê eniem zacieru X 1, co oznacza, e wraz ze wzrostem wartoœci liczbowej tego czynnika obni a³a siê koñcowa wydajnoœæ fermentacji (rys. 3a). Warto dodaæ, e poza wysoce istotnymi efektami liniowymi (p < 0,0001) wa ne by³y równie efekty kwadratowe (p = 0,038). Podobnie jak w przypadku zmiennej Y 1, wp³yw ph uznano za nieistotny statystycznie (p > 0,05) i dlatego te usuniêto ten czynnik z modelu regresji. W przypadku dawki enzymu (X 2 ) za istotne statystycznie uznano zarówno efekty liniowe jak i kwadratowe, przez co zale noœæ pomiêdzy tym czynnikiem a wydajnoœci¹ fermentacji mia³a kszta³t nieliniowy, z wyraÿnie zaznaczonym maksimum odpowiadaj¹cym dawce równej Rys. 4. Wykres powierzchni odpowiedzi przedstawiaj¹cy wp³yw stê enia zacieru (X 1 ) i dawki preparatu enzymatycznego (X 2 )nawydajnoœæ fermentacji (Y 2 ) wyznaczony dla ph = 4,25. BIOTECHNOLOGIA 4 (87) 183-199 2009 195

Wojciech Bia³as i inni 2,16 ml/kg s.m. m¹ki (rys. 3b). Warto zauwa yæ, e zgodnie z wartoœciami liczbowymi wspó³czynników regresji przedstawionymi w tabeli 4 zdecydowanie silniejszy wp³yw na wydajnoœæ mia³o stê enie zacieru ani eli dawka preparatu enzymatycznego. Jest to zatem odwrotna prawid³owoœæ do tej, jak¹ zanotowano w przypadku analizy zmian stê enia etanolu. Na podstawie uzyskanych wyników potwierdzono tym samym, e czynnikiem decyduj¹cym o osi¹gniêciu wysokiego stê enia etanolu Y 1 jest dostêpnoœæ cukrów fermentuj¹cych zwi¹zana z szybkoœci¹ hydrolizy skrobi, zale n¹ z kolei od zastosowanej dawki preparatu enzymatycznego. Zgodnie z wykresem powierzchni odpowiedzi wyznaczonej na podstawie przyjêtego modelu regresji (rys. 4) maksymalna przewidywana wydajnoœæ powinna wynosiæ 85,76 ± 1,19%, przy stê eniu zacieru i dawce preparatu enzymatycznego wynosz¹cej odpowiednio 25,0% i 2,18 ml/kg. Wskazana jako optymalna zawartoœæ skrobi w zacierze jest mniejsza od tej jak¹ wyznaczono bior¹c pod uwagê wy³¹cznie zawartoœæ etanolu po procesie fermentacji. Podobne rezultaty uzyskali Suresh i wsp. (20) we wspomnianym opracowaniu dotycz¹cym badañ nad fermentacj¹ zacierów zawieraj¹cych skrobiê z pszenicy i sorga o stê eniu 10-30%. Autorzy cytowanej pracy stwierdzili, e optymalny stopieñ konwersji cukrów do etanolu, przy jednoczesnym utrzymaniu wysokiej produkcji biomasy uzyskuje siê w przypadku zacierów o stê eniu 25%. Sugeruje to, e podczas optymalizacji nale y poszukiwaæ parametrów stanowi¹cych kompromis pozwalaj¹cy na uzyskanie wysokiej koncentracji etanolu w zacierze odfermentowanym oraz wysokiej wydajnoœci przy mo liwie minimalnej zawartoœci nieodfermentowanej skrobi oraz cukrów fermentuj¹cych. 4. Optymalizacja procesu jednoczesnej hydrolizy i fermentacji zacierów zawieraj¹cych natywn¹ skrobiê Celem prezentowanych badañ by³a optymalizacja procesu otrzymywania etanolu z zastosowaniem metody jednoczesnej hydrolizy i fermentacji prowadzonej za pomoc¹ enzymów hydrolizuj¹cych natywn¹ skrobiê i dro d y Saccharomyces cerevisiae, rasy Etanol Red. Zwykle procedura prowadz¹ca do rozwi¹zania tego problemu sk³ada siê z dwóch etapów: w pierwszym nastêpuje wyznaczenie wartoœci przewidywanych badanej zmiennej poprzez dopasowanie odpowiednich równañ regresji do uzyskanych w eksperymencie danych doœwiadczalnych. Nastêpnie poszukuje siê takich wartoœci zmiennych niezale nych, które pozwalaj¹ na mo liwie najdok³adniejsze spe³nienie kryteriów optymalizacyjnych. Zwi¹zek pomiêdzy przewidywanymi odpowiedziami wielkoœci wyjœciowej a u ytecznoœci¹ odpowiedzi, czyli stopniem spe³nienia przyjêtych kryteriów jest nazywany funkcj¹ u ytecznoœci (ang. desirability function). Procedurê s³u ¹c¹ do okreœlenia zwi¹zku pomiêdzy przewidywanymi odpowiedziami wielkoœci wyjœciowej i u ytecznoœci¹ odpowiedzi opracowali Derringer i Suich (21). Na podstawie prezentowanych w pracy wyników wskazuje siê, e stê enie etanolu (Y 1, g/l) oraz ca³kowita wydajnoœæ procesu (Y 2, % teoretycznej wydajnoœci eta- 196 PRACE EKSPERYMENTALNE

Optymalizacja procesu jednoczesnej hydrolizy i fermentacji natywnej skrobi metod¹ powierzchni odpowiedzi nolu) s¹ w g³ównej mierze funkcj¹ zmiennych X 1 ix 2. Dlatego te zastosowano nastêpuj¹ce kryteria optymalizacji: stê enie zacieru (X 1 ), dawka preparatu enzymatycznego (X 2 ) oraz ph (X 3 ) przyjmowa³y wartoœci kodowe z ca³ego badanego zakresu zmiennoœci (od -1,0 do +1,0), podczas gdy zmienne zale ne, stê enie etanolu i ca³kowita wydajnoœæ procesu powinny przyjmowaæ wartoœci najwiêksze spoœród przewidywanych. Nale y dodaæ, e zastosowana procedura zak³ada³a przekszta³cenie wartoœci ka dej z czterech wielkoœci wyjœciowych w wartoœci u ytecznoœci, które mog¹ siê zmieniaæ od 0,0 dla niepo ¹danych do 1,0 dla bardzo po ¹danych. Dziêki temu jednoczesna optymalizacja dwóch wielkoœci wyjœciowych uproœci³a siê do znalezienia wartoœci wielkoœci wejœciowych, które maksymalizuj¹ ca³kowit¹ u ytecznoœæ odpowiedzi wielkoœci wyjœciowych. W rezultacie wykonanych obliczeñ stwierdzono, e optymalne parametry prowadzenia SSF to stê enie zacieru (X 1 ), dawka enzymu (X 2 ) oraz ph (X 3 ) wynosz¹ce odpowiednio: 25%, 2,05 ml/kg s.m. m¹ki oraz ph równe 5,0. 5. Walidacja modeli regresji oraz wyników optymalizacji W celu ostatecznej weryfikacji poprawnoœci przyjêtych modeli regresji oraz wyznaczonych na ich podstawie optymalnych parametrów badanego procesu wykonano cztery dodatkowe hodowle. Parametry trzech pierwszych hodowli stanowi³y losowo wytypowane kombinacje wartoœci zmiennych niezale nych le ¹ce w badanym przedziale, podczas gdy ostatnia z hodowli mia³a parametry odpowiadaj¹ce optymalnym, przyjêtym na podstawie wspomnianych kryteriów optymalizacji. Dla ka - dego z eksperymentów wyznaczono, na bazie modu³u predykcji wystêpuj¹cego w stosowanym oprogramowaniu statystycznym, przewidywane wielkoœci zmiennych zale nych Y 1, Y 2 oraz 95% przedzia³y ufnoœci i b³êdy standardowe. Nastêpnie porównano wartoœci eksperymentalne z przewidywanymi (tab. 5). Stwierdzono, e uzyskane wyniki w wiêkszoœci przypadków mieszcz¹ siê w granicach wyznaczonych przez odpowiednie przedzia³y ufnoœci, co potwierdzi³o poprawnoœæ przyjêtych modeli regresji oraz wybór optymalnych parametrów procesu. Wyniki walidacji Tabela 5 Nr X 1 X 2 X 3 Przedzia³ ufnoœci Obs. Przew. Obs. Przew. Przedzia³ ufnoœci Y 1 stê enie etanolu Y 2 wydajnoœæ procesu -95% 95% -95% 95% 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 26,04 0,87 4,0 101,14 99,94 96,48 103,39 75,66 75,21 72,78 77,63 2 32,92 2,79 5,0 115,02 117,49 114,45 120,53 67,91 69,22 67,02 71,42 BIOTECHNOLOGIA 4 (87) 183-199 2009 197

Wojciech Bia³as i inni 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 3 33,66 1,95 3,6 115,18 120,7 117,61 123,78 66,46 69,88 67,72 72,05 4 25,00 2,05 5,0 110,36 110,79 107,31 114,26 85,71 85,72 83,13 88,31 Objaœnienie: Obs. dane eksperymentalne (obserwowane); Przew. dane przewidywane modelami regresji. 6. Podsumowanie i wnioski W przeprowadzonych badaniach udowodniono, e proces jednoczesnej hydrolizy i fermentacji mo e przebiegaæ wydajnie dla zacierów skrobiowych, bez stosowania wczeœniejszej obróbki termicznej, która mog³a zostaæ wyeliminowana dziêki zastosowaniu nowoczesnych preparatów enzymatycznych, scukrzaj¹cych skrobiê natywn¹. Zaobserwowano, e wzrost stê enia zacieru by³ dodatnio skorelowany z koñcow¹ zawartoœci¹ etanolu i niestety ujemnie skorelowany z wydajnoœci¹ procesu. Oznacza to, e stosuj¹c gêste zaciery o stê eniu przekraczaj¹cym 25% otrzymywano produkt odpadowy o stosunkowo wysokiej zawartoœci niewykorzystanego surowca. Jednak dziêki zastosowaniu procedur optymalizacyjnych uda³o siê otrzymaæ zadowalaj¹ce rezultaty. W wyznaczonym, optymalnym uk³adzie parametrów, po 72 godzinach procesu, uzyskano wydajnoœæ 85,7% (w odniesieniu do wydajnoœci teoretycznej fermentacji) oraz stê enie etanolu wynosz¹ce oko³o 14% v/v (110 g/l). Warto dodaæ, e zastosowanie gêstych zacierów o stê eniu przekraczaj¹cym 35% w procesie jednoczesnej hydrolizy i fermentacji prowadzonym przy u yciu preparatów enzymatycznych wykazuj¹cych aktywnoœæ w stosunku do natywnej skrobi, takich jak STARGEN 001 jest teoretycznie mo liwe pod warunkiem, e proces ten bêdzie przebiega³ w uk³adzie bioreaktora membranowego wyposa onego w modu³ do destylacji membranowej (22) lub perwaporacji (23). Powszechnie wiadomo, e etanol stanowi czynnik limituj¹cy i jego maksymalne stê enie mo e wynosiæ 18% v/v (24). Tego rodzaju rozwi¹zania mog¹ zatem do minimum ograniczyæ wp³yw etanolu, dziêki czemu poszczególne przemiany bêd¹ przebiega³y z prêdkoœci¹ oraz wydajnoœci¹ zbli on¹ do maksymalnej. Wymaga to jednak dalszych badañ zwi¹zanych przede wszystkim z zagadnieniami powiêkszenia skali tych procesów, bowiem w wiêkszoœci przypadków opisywane s¹ instalacje pracuj¹ce w skali laboratoryjnej. Badania zosta³y sfinansowane ze œrodków Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa Wy szego (grant nr 0619/P01/2007/02). Literatura 1. Wyman C. E., (2003), Applications of corn stover and fiber. Corn Chemistry and Technology, 2 nd ed. (Eds. White P. J., Johnson L. A.) American Association of Cereal Chemists, St. Paul MN. 2. Senn T., Pieper H. J., (2001), Classical Methods in the Biotechnology of Ethanol: Classical and Future Applications, Ed. M. Roehr, P 1, WILEY-VCH Verlag GmbH, Weinheim. 198 PRACE EKSPERYMENTALNE

Optymalizacja procesu jednoczesnej hydrolizy i fermentacji natywnej skrobi metod¹ powierzchni odpowiedzi 3. Power R. F., (2003), Enzymatic conversion of starch to fermentable sugars. The Alcohol Textbook,4 th, Eds. Jacques K. A., Lyons T. P., Kelsall D. R., Nottingham University Press, Nottingham, U.K., 23-32. 4. Lim L. H., Macdonald D. G., Hill G. A., (2003), Biochem. Eng. J., 13, 53-62. 5. Sandsted R. M., Gates R. L., (1954), Food Res., 19, 190-199. 6. Ueda S., Ohba R., Kano S., (1974), Starch/Starke, 26, 374-378. 7. Miah M. N., Ueda N. S., (1977), Starch/Starke 29, 235-239. 8. Mikami S., Iwano K., Shiinoki S., Shimada T., (1987), Agric. Biol. Chem., 51, 2495-2501. 9. Nichols N. N., Dien B. S., Bothast R. J., Cotta M. A., (2006), The Corn Ethanol Industry in Alcoholic Fuels, Ed. S. Minteer, CRC Press, Boca Raton, Fl. 2006. 10. Kobayashi F., Sawada T., Nakamura Y., Ohnaga M., Godliving M., Ushiyama T., (1998), Appl. Biochem. Biotechnol., 69, 177-189. 11. Öhgren K., Bura R., Lesnicki G., Saddler J., Zacchi G., (2007), Proc. Biochemistry, 42, 834-839. 12. Philippidis G. P., Smith T. K., (1995), Appl. Biochem. Biotechnol., 51/52, 117-124. 13. Ward C., Nolan A. M., O`Hanlon K., McAree T., Barron N., McHale L., McHale A. P., (1995), Appl. Microbiol. Biotechnol., 43, 408-411. 14. Verma G., Nigam P., Singh D., Chaudhary K., (2000), Bioresource Technol., 72, 261-266. 15. Öhgren K., Rudolf A., Galbe M., Zacchi G., (2006), Biomass and Bioenergy, 30, 863-869. 16. Holm J., Björck I., Drews A., (1986), Starch/Stärke 38, 7, 224-226. 17. Miller G. L., (1959), Anal. Chem., 31, 426-428. 18. Montgomery D. C., Runger G. C., (2003), Applied Statistics and Probability for Engineers, 3 rd ed., John Wiley & Sons Inc., Hoboken, New Jersey. 19. Wang P., Singh V., Hue X., Johnston D. B., Rausch K. D., Tumbleson M. E., (2007), Cereal Chem., 84, 1, 10-14. 20. Suresh K., Kiransree N., Venkateswar Rao L., (1999), Bioprocess Engineering, 21, 165-168. 21. Derringer G., Suich R., (1980), J. Qual. Technol., 12, 214-219. 22. Gryta M., Morawski A. W., Tomaszewska M., (2000), Catal. Today, 56, 159-165. 23. Kaseno, Miyazawa I., Kokugan T., (1989), J. Ferment. Bioeng., vol. 86, no 5, 488-493. 24. Lentini A., Rogers P., Higgins V., Dawes I., Chandler M., Stanley G., Chambers P., (2003), The Impact of Ethanol Stress on Yeast Physiology in Brewing Yeast Fermentation Performance, 2 nd ed., Ed. K. Smart, Blackwell Science. BIOTECHNOLOGIA 4 (87) 183-199 2009 199