SESJA 4 REGULACJA EKSPRESJI GENETYCZNEJ WYKŁADY

SESJA 4 REGULACJA EKSPRESJI GENETYCZNEJ WYKŁADY

60 SESJA 4 WYKŁADY W04-01 REGULACJA EKSPRESJI GENÓW ZWIĄZANYCH Z ASYMILACJĄ SIARKI U BAKTERII Monika Hryniewicz Instytut Biochemii i Biofizyki PAN, Warszawa Adaptacja bakterii do zmiennych warunków ich naturalnych środowisk wymaga precyzyjnych systemów regulacyjnych zapewniających najbardziej ekonomiczne wykorzystanie dostępnych źródeł makro- i mikroelementów. Asymilacja siarki ze źródeł nieorganicznych (siarczanu, tiosiarczanu, siarczku) przebiega drogą biosyntezy cysteiny zarówno u bakterii jelitowych jak i wolnożyjących. Ekspresja genów niezbędnych dla biosyntezy cysteiny (regulonu cys) jest kontrolowana przez regulator transkrypcyjny CysB. Badania mechanizmu oddziaływania białka CysB z regionami promotorowymi genów cys pozwoliły na wyjaśnienie obserwowanych in vivo zmian poziomu ekspresji tych genów w odpowiedzi na obecność induktora (acetyloseryny) oraz rodzaj źródła siarki w podłożu. Przeprowadzona ostatnio systematyczna analiza funkcjonalna zmutowanych form CysB dostarczyła nowych informacji o mechanizmach działania tego białka jako regulatora transkrypcyjnego: zidetyfikowano domeny CysB istotne dla wiązania białka z DNA, wiązania induktora oraz prawdopodobny region kontaktu z polimerazą RNA. E. coli a także bakterie wolnożyjące mają zdolność asymilacji siarki z różnych źródeł organicznych m. in. sulfonianów. Ostatnio zidentyfikowano (u E. coli, B. subtilis oraz Pseudomonas sp.) zespół genów ssi, indukowanych w warunkach braku siarczanu w środowisku i niezbędnych dla wykorzystania alternatywnych źródeł siarki. Geny te są regulowane odmiennie niż geny regulonu cys. W kontroli ekspresji genów ssi uczestniczy białko CysB, oraz dodatkowy, specyficzny regulator transkrypcyjny, białko Cbl. Badania oddziaływania regulatorów CysB i Cbl z regionami promotorowymi genów ssi in vitro wykazały różnorodność mechanizmów aktywacji transkrypcyjnej poszczególnych promotorów ssi.

REGULACJA EKSPRESJI GENETYCZNEJ 61 W04-02 MOLEKULARNE MECHANIZMY AKTYWACJI TRANSKRYPCJI U ESCHERICHIA COLI PRZEZ BIAŁKO AKTYWATOROWE CRP Zygmunt Wasylewski Uniwersytet Jagielloński, Zakład Biochemii Fizycznej, Kraków Proces regulacji ekspresji genów w komórkach prokariotycznych jak i eukariotycznych zachodzi zwykle poprzez kontrolęinicjacji transkrypcji. U bakterii proces ten kontrolowany jest zarówno przez białka represorowe jak i białka aktywatorowe. U Escherichia coli aktywacja transkrypcji przez białko receptorowe wiążące camp (CRP) stanowi prosty model opisujący mechanizm aktywacji transkrypcji. Proces aktywacji związany jest z oddziaływaniem allosterycznego efektora jakim jest camp z białkiem CRP. Białko CRP jest homologicznym dimerem o masie 45 kda. Każda z podjednostek zbudowana jest z dwóch strukturalnych domen połączonych giętkim odcinkiem łańcucha składającego sięz kilku reszt aminokwasowych. Domena N-końcowa wiąże camp, natomiast domena C-końcowa posiada element strukturalny helisa-skręt-helisa (HTH), odpowiadający za rozpoznawanie specyficznych sekwencji promotorowych. Szereg badań w roztworze, w tym także nasze badania szybkiej kinetyki i pomiary równowagowe z wykorzystaniem jednopunktowych mutein białka CRP, wskazują, iż mechanizm rozpoznawania sekwencji promotorowych DNA związany jest z kooperatywną komunikacją pomiędzy domenami białka CRP. Po związaniu do odpowiednich sekwencji promotorowych białko CRP może oddziaływać z podjednostką a polimerazy RNA (RNAP) aktywując proces inicjacji transkrypcji. Kompleks transkrypcyjny, w którego skład wchodzą tylko trzy makrocząsteczki jakimi są polimeraza RNA, CRP i promotor DNA jest, jak dotychczas, najlepiej poznanym i najprostszym kompleksem umożliwiającym proces aktywacji transkrypcji. W zależności od rodzaju aktywowanych promotorów CRP może oddziaływać poprzez kilka miejsc na swej powierzchni zarówno z domeną C-końcową jak i z domeną N-końcową podjednostki a polimerazy RNA. Oddziaływanie typu białko-białko, zachodzące pomiędzy domenami podjednostki a polimerazy RNA i białkiem CRP w istotny sposób wpływa na stan równowagi pomiędzy kompleksem zamkniętym i otwartym kompleksu RNAP-promotor DNA. Poznanie mechanizmów oddziaływania po między aktywatorem transkrypcji CRP, polimerazą RNA i promotorowym DNA pozwala na zrozumienie innych, bardziej strukturalnie skomplikowanych kompleksów umożliwiających aktywację procesu transkrypcji.

62 SESJA 4 WYKŁADY W04-03 MOLEKULARNA I FUNKCJONALNA CHARAKTERYSTYKA GENÓW KONTROLUJĄCYCH SYNTEZĘ EGZOPOLISACHARYDU RHIZOBIUM LEGUMINOSARUM Anna Skorupska Zakład Mikrobiologii Ogólnej, Uniwersytet M. Curie-Skłodowskiej, Lublin R. leguminosarum syntetyzuje kwaśny, zewnątrzkomórkowy polisacharyd (EPS), który odgrywa istotną rolęw tworzeniu efektywnych brodawek korzeniowych na koniczynie. Mutanty defektywne w syntezie EPS indukują niezakażone, lub częściowo zakażone brodawki, w których bakteroidy nie wiążą azotu atmosferycznego. EPS R. leguminosarum jest polimerem złożonym z ośmiocukrowych podjednostek, w skład których wchodzi galaktoza, pięć reszt glukozy i dwie reszty kwasu glukuronowego. Cukry są dodatkowo modyfikowane resztami niecukrowymi. Biosynteza powtarzającej siępodjednostki EPS odbywa siępoprzez kolejne przeniesienie nukleotydowych pochodnych cukrów na błonowy nośnik lipidowy, przez swoiste glikozylotransferazy. Skompletowane podjednostki są polimeryzowane i eksportowane na powierzchniękomórki bakteryjnej. Kompletowanie powtarzającej siępodjednostki EPS R. leguminosarum rozpoczyna sięod przeniesienia glukozo-1-fosforanu z UDP-glukozy na nośnik izoprenylowy przez glukozylotransferazękodowaną przez gen pssa. W następnych etapach, dwie reszty kwasu glukuronowego są przenoszone przez glukuronozylotransferazy kodowane przez geny pssc, pssd i psse [Król J., Wielbo J., Mazur A., Kopcińska J., Łotocka B., Golinowski W., Skorupska A. 1998. Mol Plant-Microbe Interact 11, 1142.]. Dalsze etapy biosyntezy EPS w R. leguminosarum nie zostały opisane. Zsyntetyzowane podjednostki są polimeryzowane i eksportowane przez białka tworzące system 1 transportu, kodowany przez geny pssn, psso i pssp. Wyeksportowany na powierzchniękomórki polimer EPS podlega dalszym modyfikacjom przez glikozylazy wyprowadzane z komórek Rhizobium przez system transportu zależny od ATP i kodowany przez geny prsd, prse i orf3 [Król J, Skorupska A. 1997. Microbiology 143, 1389.]. Funkcjęregulacyjną w syntezie EPS pełni przypuszczalnie gen pssb, którego białkowy produkt wykazuje istotną homologiędo eukariotycznej fosfatazy monofosforanu inozytolu [Janczarek M., Król J., Skorupska A. 1999 FEMS Microbiol Lett 173, 319.]. Białko PssB zarówno w E. coli jakiw R. leguminosarum funkcjonuje jako fosfataza monofosforanu inozytolu i wpływa na poziom syntezy EPS.

REGULACJA EKSPRESJI GENETYCZNEJ 63 W04-04 INICJATOROWE BIAŁKO DnaA: AKTYWATOR I REPRESOR TRANSKRYPCJI Jolanta Zakrzewska-Czerwińska, Jerzy Majka Instytut Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN, Wrocław Białko DnaA jest inicjatorem procesu replikacji DNA bakterii. DnaA wiąże sięz 9 nukleotydowymi niepalindromowymi sekwencjami zwanymi boksami DnaA. W regionie inicjacji replikacji chromosomu oric występuje od kilku do kilkunastu takich sekwencji. U modelowego organizmu Escherichia coli, związanie się10 do 20 cząsteczek białka DnaA z regionem oric powoduje rozplecenie DNA w obszarach bogatych w pary A-T. Tworzenie sięregionów DNA o strukturze jednoniciowej umożliwia wprowadzenie do kompleksu inicjacyjnego helikazy DnaB. Odbywa się to poprzez bezpośrednie oddziaływanie DnaA z kompleksem białkowym DnaB-DnaC. Białko DnaA wiąże nukleotydy adenylowe lecz tylko forma białka DnaA ze związanym ATP jest aktywna w procesie replikacji DNA. Postuluje się, że regulacja ekspresji genu dnaa łączy inicjacjęreplikacji DNA z cyklem komórkowym bakterii. Oprócz swej funkcji inicjatora replikacji chromosomu bakteryjnego białko DnaA wiążąc sięz boksami DnaA znajdującymi sięw regionach promotorowych lub sekwencjach kodujących jest również czynnikiem transkrypcyjnym. W zależności od usytuowania boksów DnaA w stosunku do promotora białko to może być aktywatorem bądź represorem transkrypcji genu. Mechanizm aktywacji nie jest znany, postuluje się, że o aktywacji mogą decydować oddziaływania między białkiem DnaA i polimerazą RNA. Nie wyklucza się również wpływu białka DnaA na wiązanie innych aktywatorów transkrypcyjnych. Oddziaływanie białka z boksami DnaA w sekwencjach kodujących może natomiast powodować terminacjętranskrypcji genów. Podobnie jak w przypadku procesu inicjacji replikacji DNA forma występowania białka DnaA (ze związanym ATP bądź ADP) może mieć wpływ na aktywność białka DnaA jako regulatora transkrypcji.

64 SESJA 4 WYKŁADY W04-05 KONTROLA DEGRADACJI RNA JAKO JEDEN Z MECHANIZMÓW REGULACJI GENETYCZNEJ Piotr Stępień Uniwersytet Warszawski i IBB PAN, Warszawa Stężenie poszczególnych mrna jest wypadkową dwóch procesów: transkrypcji oraz degradacji RNA. Dlatego też degradacja RNA jest istotnym procesem, w którym zaangażowanych jest wiele białek. Regulują one tempo degradacji transkryptów i w ten sposób posrednio wpływają na biosyntezębiałek. Przedmiotem wykładu będą badania nad prastarym ewolucyjnie białkiem SUV3. Należy ono do grupy zależych od ATP helikaz RNA i uczestniczy w procesach regulowanej degradacji RNA. Ortologi tego białka spotykane są w bakteriach purpurowych, oraz w mitochondriach u roślin, owadów, i ssaków włącznie z Homo sapiens.

REGULACJA EKSPRESJI GENETYCZNEJ 65 W04-06 TRANSLATIONAL REGULATION PLAYS A KEY ROLE IN DEVELOPMENT OF GERM CELLS Jadwiga Jaruzelska A,B, Frederick Moore B, Aleksandra Korcz A, Piotr Jedrzejczak C, Maciej Kotecki A, Renee Reijo B A: Instute of Human Genetics Polish Academy of Sciences, Poznań B: University of California San Francisco C: Institute of Obstetrics and Gynecology Medical Academy, Poznań The evolutionarily-conserved DAZ (Deleted in AZoospermia) gene is the first pure sterility gene identified so far. Deletions of this gene cause male infertility with no somatic consequences. Although essential for fertility in flies and mice, DAZ function in human spermatogenesis is poorly understood. In order to acquire insights into the functional role of DAZ protein in human germ cell development, a yeast two-hybrid system has been used to screen human testis cdna library for DAZ interacting proteins. Two clones encoding a protein that contains a predicted RNA-binding domain that is 80% identical to that in Drosophila Pumilio were identified. It is known that Pumilio is essential for translational repression in Drosophila and that this repression is necessary for maintenance of germline stem cells. This suggests that a similar function may be required in human adult testis and that DAZ may be required for translational repression. By generating a set of nine Pumilio truncated proteins and testing for interaction with DAZ, we found that DAZ binds to the Pumilio RNA-binding domain. Possible models explaining the role of this interaction will be presented. Immunostaining of testis tissue sections using DAZ and Pumilio specific antibodies combined with confocal microscopy indicates that both proteins are predominantly expressed in spermatogonia, the stem cells of the male germline. By northern analysis it was demonstrated that human Pumilio is overexpressed in the testis and ovary suggesting a role, in development of both the male and female germlines. This study indicates that translational regulation involving Pumilio and DAZ proteins may be a highly conserved mechanism for regulation of germ cells development in animals including humans.