QUANTA Lite RNP ELISA 708565 Do diagnostyki in vitro Złożoność CLIA: Wysoka Przeznaczenie Test QUANTA Lite TM RNP ELISA to test immunoenzymatyczny (ELISA) do półilościowego wykrywania przeciwciał przeciwko RNP w surowicy ludzkiej. Obecność przeciwciał przeciwko RNP może być stosowana w połączeniu z objawami klinicznymi i innymi badaniami laboratoryjnymi, aby wspomóc diagnostykę tocznia rumieniowatego układowego (SLE) i powiązanych chorób tkanki łącznej. Podsumowanie i wyjaśnienie testu Przeciwciała przeciwjądrowe (ANA) występują w wielu różnych chorobach tkanki łącznej i jako takie stanowią czuły cel badania przesiewowego. 1 Pomimo tego, że badanie ANA jest doskonałym badaniem przesiewowym dla SLE (wynik negatywny praktycznie wyklucza aktywne SLE) 2, w żadnym wypadku nie jest to badanie swoiste. Przeciwciała przeciwko antygenowi RNP występują nawet u 45% pacjentów z SLE i niektórymi innymi chorobami tkanki łącznej. 1,3 Obecność autoprzeciwciał przeciwko RNP wiąże się ze względnie łagodnym przebiegiem choroby z niższą częstością występowania chorób nerek i ośrodkowego układu nerwowego. 4 Antygen RNP zawiera epitopy lub miejsca wiążące przeciwciała, które są unikalne dla RNP oraz epitopy, które są pod względem immunologicznym identyczne z wolnym Sm. 1 Ponieważ antygen RNP powlekający fazę stałą w tym teście ma epitopy antygenowe Sm, podczas podawania wyników RNP należy uwzględnić odpowiedź pacjenta na przeciwciała przeciwko Sm. Do wykrywania przeciwciał przeciwko RNP stosowano wiele różnych metod, w tym podwójną dyfuzję Ouchterlony i test aglutynacji pasywnej. Opracowano także użyteczne klinicznie testy ELISA do wykrywania przeciwciał przeciwko RNP. Technika ELISA wykorzystywana w tych badaniach jest obiektywna, półilościowa i może być dogodnie wykorzystywana do badania dużej liczby pacjentów. Zasada badania Oczyszczony kompleks antygenowy RNP/Sm wiąże się z dołkami płytek polistyrenowych w warunkach, które zabezpieczają antygen w jego stanie natywnym. Wstępnie rozcieńczone kontrole i rozcieńczone surowice od pacjentów są dodawane do oddzielnych dołków, umożliwiając wszelkim obecnym przeciwciałom przeciwko RNP lub Sm związanie się z unieruchomionym antygenem. Niezwiązana próbka jest wypłukiwana i do każdego dołka dodawany jest koniugat znakowanego enzymem przeciwciała przeciw-ludzkiego IgG. Druga inkubacja umożliwia przeciwciałom przeciw-ludzkim IgG znakowanym enzymem związać się z dowolnymi przeciwciałami pacjenta, które zostały przytwierdzone do mikrodołków. Po wypłukaniu wszelkich niezwiązanych przeciwciał przeciw-ludzkich IgG znakowanych enzymem, aktywność pozostałego enzymu bada się dodając substrat chromogeniczny i mierząc intensywność powstałej barwy. Badanie może zostać ocenione spektrofotometrycznie, poprzez zmierzenie i porównanie intensywności barwy, która powstaje w dołkach z próbkami od pacjenta z barwą dołków kontrolnych. Podczas zgłaszania przeciwciał przeciwko RNP należy zawsze uwzględnić udział przeciwciał przeciwko Sm w ogólnej reaktywności układu testu. Wyniki tego testu wskazują na reaktywność z kompleksem RNP/Sm, a nie wyłącznie samym RNP. Odczynniki 1. Polistyrenowa płytka z mikrodołkami ELISA pokryta oczyszczonym metodą powinowactwa kompleksem antygenowym RNP/Sm (12-1 x 8 dołków), z uchwytem w torebce foliowej zawierającej osuszacze 2. Kontrola negatywna ELISA, 1 fiolka buforu zawiera konserwant i surowicę ludzką bez ludzkich przeciwciał przeciwko RNP, wstępnie rozcieńczona, 1,2 ml 3. Słabo pozytywna kontrola testu RNP ELISA, 1 fiolka buforu zawiera konserwant i przeciwciała surowicy ludzkiej przeciwko RNP, wstępnie rozcieńczona, 1,2 ml 4. Silnie pozytywna kontrola testu RNP ELISA, 1 fiolka buforu zawiera konserwant i przeciwciała surowicy ludzkiej przeciwko RNP, wstępnie rozcieńczona, 1,2 ml 5. Rozcieńczalnik do próbek HRP, 1 fiolka zabarwienie różowe, zawiera sól fizjologiczną buforowaną TRIS, Tween 20, stabilizatory białka i konserwant, 50 ml 6. Koncentrat do płukania HRP, 1 fiolka koncentratu 40x zabarwienie czerwone, zawiera sól fizjologiczną buforowaną TRIS i Tween 20, 25 ml. Instrukcje dotyczące rozcieńczania można znaleźć w sekcji Metody. 7. Koniugat HRP IgG, (kozi), przeciwciała przeciw-ludzkie IgG, 1 fiolka zabarwienie niebieskie, zawiera bufor, stabilizatory białka i konserwant, 10 ml 8. Chromogen TMB, 1 fiolka zawierająca stabilizatory, 10 ml 9. Roztwór zatrzymujący HRP, kwas siarkowy 0,344 M, 1 fiolka bezbarwny, 10 ml Ostrzeżenia 1. OSTRZEŻENIE: Ten produkt zawiera substancję chemiczną (0,02% chloramfenikol) w rozcieńczalniku do próbek, kontrolach i koniugacie, która według stanu Kalifornii wywołuje raka. 2. Wszystkie materiały pochodzenia ludzkiego używane w przygotowywaniu kontroli dla tego produktu zostały przetestowane i na podstawie metod zatwierdzonych przez FDA stwierdzono, że nie zawierają przeciwciał przeciwko HIV, HBsAg i HCV. Jednak żadna metoda testowania nie może całkowicie zagwarantować braku obecności HIV, HBV, HCV lub innych czynników zakaźnych. Z tego też względu słabo pozytywną kontrolę testu RNP ELISA, silnie pozytywną kontrolę testu RNP ELISA i kontrolę negatywną testu ELISA należy obsługiwać w ten sam sposób, jak materiał potencjalnie zakaźny. 5 1
3. Jako konserwant stosowany jest azydek sodu. Azydek sodu jest trucizną i może być toksyczny w przypadku połknięcia lub wchłonięcia przez skórę lub oczy. Azydek sodu może wchodzić w reakcję z ołowianą lub miedzianą instalacją wodociągową, tworząc potencjalnie wybuchowe azydki metali. Jeśli do usuwania odczynników używane są zlewy, należy przepłukiwać je dużą ilością wody, aby nie dopuścić do gromadzenia się azydku. 4. Koniugat HRP zawiera rozcieńczoną trującą/korozyjną substancję chemiczną, która może być toksyczna w przypadku spożycia w dużej ilości. Aby uniknąć potencjalnych oparzeń chemicznych, należy unikać kontaktu ze skórą i oczami. 5. Chromogen TMB zawiera środek drażniący, w który może być szkodliwy w przypadku wdychania, spożycia lub wchłonięcia przez skórę. Aby uniknąć urazów, należy unikać wdychania, spożycia lub kontaktu ze skórą i oczami. 6. Roztwór zatrzymujący HRP składa się z rozcieńczonego roztworu kwasu siarkowego. Unikać wystawienia na działanie zasad, metali lub innych związków, które mogą wchodzić w reakcje z kwasami. Kwas siarkowy jest trucizną i ma właściwości korozyjne. W razie połknięcia może być toksyczny. Aby uniknąć oparzeń chemicznych, należy unikać kontaktu ze skórą i oczami. 7. Podczas pracy z dostarczonymi odczynnikami należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej. 8. Rozlane odczynniki należy natychmiast usunąć. Należy przestrzegać wszystkich krajowych i lokalnych przepisów w zakresie utylizacji odpadów. Środki ostrożności 1. Ten produkt jest przeznaczony do zastosowań diagnostycznych in vitro. 2. Zastąpienie składników dostarczonych w tym systemie innymi składnikami może skutkować osiągnięciem niespójnych wyników. 3. Niepełne lub nieprawidłowe płukanie i niewystarczające usunięcie płynu z płytek z dołkami ELISA wpłynie negatywnie na precyzję badań i/lub spowoduje wysoki poziom tła. 4. Dostosowanie tego badania do stosowania ze zautomatyzowanymi analizatorami próbek oraz innymi urządzeniami do pracy z płynami, w całości lub w części, może skutkować rozbieżnością wyników w stosunku do badań przeprowadzanych ręcznie. Obowiązkiem każdego laboratorium jest potwierdzenie, że wyniki testów uzyskanych na podstawie zautomatyzowanych badań mieszczą się w akceptowalnych limitach. 5. Na wyniki analizy wpływa wiele różnych czynników. Obejmują one temperaturę początkową odczynników, temperaturę otoczenia, dokładność i powtarzalność techniki pipetowania, dokładność płukania i usuwania płynu z dołków płytek ELISA, fotometr użyty do analizy wyników oraz czasy trwania inkubacji podczas badania. Uzyskanie dokładnych i powtarzalnych wyników wymaga staranności i precyzji. 6. Zalecane jest ścisłe przestrzeganie procedury testowej. 7. Niedokładne zamknięcie torebki z zamknięciem strunowym, zawierającej płytki z mikrodołkami i osuszaczami, spowoduje degradację antygenu i brak precyzji badania. 8. Dwukrotne lub wielokrotne użycie koniugatu HRP z jednej butelki w pewnym okresie czasu może dać niedopuszczalnie niski poziom absorbancji. Aby nie dopuścić do takiej sytuacji istotne jest przestrzeganie wszystkich zaleceń dotyczących procedur pracy z koniugatem HRP. 9. Zanieczyszczenie chemiczne koniugatu HRP może być spowodowane nieprawidłowym czyszczeniem lub płukaniem sprzętu lub narzędzi. Pozostałości typowych laboratoryjnych substancji chemicznych, takich jak formalina, substancja wybielająca, etanol lub detergent, z czasem spowoduje degradację koniugatu HRP. Po użyciu chemicznych substancji czyszczących/dezynfekujących dokładnie wypłukać cały sprzęt i wszystkie narzędzia. Warunki przechowywania 1. Wszystkie odczynniki z zestawu przechowywać w temperaturze 2 8 C. Nie zamrażać. Odczynniki są trwałe do daty ważności, pod warunkiem, że są przechowywane i używane zgodnie z instrukcjami. 2. Nieużyte płytki z mikrodołkami pokrytymi antygenem powinny być starannie zamknięte w torebce foliowej z osuszaczami i przechowywane w temperaturze 2 8 C. 3. Rozcieńczony bufor do płukania zachowuje trwałość przez 1 tydzień w temperaturze 2 8 C. Pobieranie próbek Ta procedura powinna być wykonana z próbką surowicy. Dodanie azydku lub innych konserwantów do próbek analitycznych może mieć negatywny wpływ na wyniki. Nie używać próbek zawierających widoczne zanieczyszczenia, skażonych bakteryjnie lub podgrzanych. Należy unikać całkowicie zhemolizowanej lub lipemicznej surowicy albo próbek. Po pobraniu surowica powinna być oddzielona od skrzepu. Dokument NCCLS H18-A2 zaleca następujące warunki przechowywania próbek: 1) Przechowywać próbki w temperaturze pokojowej nie dłużej niż 8 godzin. 2) Jeśli badanie nie zostanie zakończone w ciągu 8 godzin, schłodzić próbkę do temperatury 2 8 C. 3 ) J e ś l i badanie nie zostanie ukończone w ciągu 48 godzin lub w przypadku transportu próbki, należy zamrozić ją w temperaturze -20 C lub niższej. Zamrożone próbki po rozmrożeniu i przed badaniem muszą zostać dobrze wymieszane. Badanie Dostarczone materiały 1 Płytka z mikrodołkami RNP ELISA (12-1 x 8 dołków), z uchwytem 1 1,2 ml wstępnie rozcieńczonej kontroli negatywnej testu ELISA 1 1,2 ml wstępnie rozcieńczonej słabo pozytywnej kontroli testu RNP ELISA 1 1,2 ml wstępnie rozcieńczonej silnie pozytywnej kontroli testu RNP ELISA 2
1 50 ml rozcieńczalnika do próbek HRP 1 25 ml koncentratu do płukania HRP, koncentrat 40x 1 10 ml koniugatu przeciwciała IgG HRP, (kozie), przeciw-ludzkie IgG 1 10 ml chromogenu TMB 1 10 ml roztworu zatrzymującego HRP, kwas siarkowy 0,344 M Wymagane materiały nie dołączone do zestawu Mikropipety na 5, 100, 200 300 i 500 µl Jednorazowe końcówki mikropipet Probówki do roztworów próbek pochodzących od pacjenta, 4 ml objętości Woda destylowana lub dejonizowana Naczynie o objętości 1 l do rozcieńczonego koncentratu HRP do płukania Czytnik płytek z mikrodołkami umożliwiający pomiar gęstości optycznej przy 450 nm (i przy 620 nm dla odczytów przy dwóch długościach fali) Sposób przygotowania Przed rozpoczęciem 1. Doprowadzić wszystkie odczynniki i próbki do temperatury pokojowej (20-26 o C) i dobrze wymieszać. 2. Rozcieńczyć koncentrat do płukania HRP w stosunku 1:40, dodając zawartość butelki koncentratu do płukania HRP do 975 ml wody destylowanej lub dejonizowanej. Jeśli cała płytka nie zostanie przetworzona w tym czasie, można przygotować mniejszą ilość. W tym celu należy dodać 2,0 ml koncentratu do 78 ml wody destylowanej lub dejonizowanej na każde 16 dołków, które będą użyte. Rozcieńczony bufor zachowuje trwałość przez 1 tydzień w temperaturze 2 8 o C. 3. Przygotować roztwór 1:101 każdej próbki pochodzącej od pacjenta, dodając 5 µl próbki do 500 µl rozcieńczalnika do próbek HRP. Rozcieńczone próbki muszą być użyte w ciągu 8 godzin od przygotowania. NIE ROZCIEŃCZAĆ słabo pozytywnej kontroli testu RNP ELISA, silnie pozytywnej kontroli testu RNP ELISA i kontroli negatywnej ELISA. 4. Ustalenie obecności lub nieobecności RNP z zastosowaniem arbitralnych jednostek wymaga dwóch dołków dla każdej z trzech kontroli oraz jednego lub dwóch dołków dla każdej próbki pacjenta. Zalecane jest wykonanie duplikatów próbek. Procedura badania 1. WSZYSTKIE ODCZYNNIKI PRZED ROZPOCZĘCIEM BADANIA MUSZĄ BYĆ DOPROWADZONE DO TEMPERATURY POKOJOWEJ (20 26 C). Umieścić wymaganą liczbę mikrodołków/pasków w uchwycie. Natychmiast umieścić nieużywane płytki w torebce foliowej zawierającej osuszacz i dobrze ją zamknąć, aby ograniczyć kontakt z parą wodną. 2. Do dołków dodać 100 µl wstępnie rozcieńczonej słabo pozytywnej kontroli testu RNP ELISA, silnie pozytywnej kontroli testu RNP ELISA, kontroli negatywnej testu ELISA i rozcieńczone próbki pochodzące od pacjentów. Przykryć dołki i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej na równej powierzchni. Czas inkubacji rozpoczyna się po dodaniu ostatniej próbki. 3. Etap płukania: Odessać całkowicie zawartość każdego dołka. Dodać 200 300 µl rozcieńczonego buforu do płukania HRP do wszystkich dołków, a następnie odessać. Powtórzyć tę sekwencję jeszcze dwukrotnie, aby łącznie przeprowadzić trzy płukania. Odwrócić płytkę i postukać w nią na materiale pochłaniającym w celu usunięcia pozostałości płynu po ostatnim płukaniu. Ważne jest, aby całkowicie opróżnić każdy dołek po każdym etapie płukania. Zachować tę samą sekwencję odsysania, jak w przypadku dodawania próbki. 4. Do każdego dołka dodać 100 µl koniugatu IgG HRP. Koniugat powinien być usunięty z butelek z zastosowaniem standardowych warunków aseptycznych oraz zalecanych technik laboratoryjnych. Pobrać z butelki jedynie wymaganą do analizy ilość koniugatu. ABY UNIKNĄĆ POTENCJALNEGO ZANIECZYSZCZENIA BAKTERYJNEGO I/LUB CHEMICZNEGO, NIE WOLNO WLEWAĆ NIEUŻYTEGO KONIUGATU Z POWROTEM DO BUTELKI. Inkubować dołki przez 30 minut jak w etapie 2. 5. Etap płukania: Powtórzyć etap 3. 6. Dodać 100 µl chromogenu TMB do każdego dołka i inkubować w ciemności przez 30 minut w temperaturze pokojowej. 7. Do każdego dołka dodać 100 µl roztworu zatrzymującego HRP. Zachować tę samą sekwencję i czas dodawania roztworu zatrzymującego HRP, jak w przypadku chromogenu TMB. Delikatnie postukać płytkę palcem, aby dokładnie wymieszać zawartość dołków. 8. Odczytać absorbancję (gęstość optyczną) każdego dołka przy długości fali 450 nm w ciągu jednej godziny od zatrzymania reakcji. Jeśli wymagane są pomiary bichromatyczne, referencyjną długością fali może być długość 620 nm. Kontrola jakości 1. Aby upewnić się, że wszystkie odczynniki i procedury funkcjonują prawidłowo, każdą serię próbek należy testować wraz ze słabo pozytywną kontrolą testu RNP ELISA, silnie pozytywną kontrolą testu RNP ELISA i kontrolą negatywną testu ELISA. 2. Należy zauważyć, że ponieważ słabo pozytywna kontrola testu RNP ELISA, wysoko pozytywna kontrola testu RNP ELISA i kontrola negatywna testu ELISA są już wstępnie rozcieńczone, to nie będą one stanowić kontroli w przypadku procedur związanych z rozcieńczaniem próbek. 3
3. Dodatkowe kontrole mogą być przebadane zgodnie z wytycznymi lub wymaganiami lokalnych i/lub krajowych przepisów lub organów normalizacyjnych. Dodatkowe odpowiednie surowice kontrolne można przygotować, dzieląc połączone próbki surowicy ludzkiej i przechowując je w temperaturze < - 20 C. 4. Aby wyniki badania mogły być uznane jako ważne, muszą zostać spełnione wszystkie poniższe kryteria. Jeśli jakiekolwiek kryterium nie będzie spełnione, badanie powinno być traktowane jako nieważne i powinno zostać powtórzone. a. Absorbancja wstępnie rozcieńczonej silnie pozytywnej kontroli testu RNP ELISA musi być większa niż absorbancja wstępnie rozcieńczonej słabo pozytywnej kontroli testu RNP ELISA, która z kolei musi być większa niż absorbancja wstępnie rozcieńczonej kontroli negatywnej ELISA. b. Absorbancja wstępnie rozcieńczonej silnie pozytywnej kontroli testu RNP ELISA musi być większa niż 1,0, natomiast absorbancja wstępnie rozcieńczonej kontroli negatywnej ELISA nie może przekroczyć 0,2. c. Absorbancja wstępnie rozcieńczonej słabo pozytywnej kontroli testu RNP ELISA musi być ponad dwukrotnie większa niż absorbancja kontroli negatywnej testu ELISA lub większa niż 0,25, lecz nie większa niż 0,6. d. Kontrola negatywna testu ELISA i silnie pozytywna kontrola testu RNP ELISA mają za zadanie wykazać ewentualne istotne nieprawidłowe działanie odczynnika. Silnie pozytywna kontrola testu RNP ELISA nie zapewni dokładności przy wartości granicznej badania. e. Dodatkowe wytyczne dotyczące odpowiednich praktyk QC można znaleźć w dokumencie NCCLS C24-A. Obliczanie wyników W pierwszej kolejności jest określana średnia gęstość optyczna każdego zestawu duplikatów. Reaktywność każdej próbki można następnie wyliczyć, dzieląc średnią gęstość optyczną próbki przez średnią gęstość optyczną słabo pozytywnej kontroli testu RNP ELISA. Otrzymany wynik mnoży się przez liczbę jednostek przypisanych do słabo pozytywnej kontroli testu RNP ELISA, którą można znaleźć na etykiecie. Gęstość optyczna próbki x słabo pozytywna Wartość próbki = kontrola testu RNP ELISA (jednostki) gęstość optyczna słabo pozytywnej kontroli testu RNP ELISA (jednostki) Reaktywność w sposób nieliniowy zależy od ilości obecnych przeciwciał. Wzrosty i spadki stężeń przeciwciał u pacjenta będą odzwierciedlone w analogicznym wzroście lub spadku reaktywności, jednak zmiana ta nie jest proporcjonalna (tzn. podwojenie stężenia przeciwciał nie oznacza podwojenia reaktywności). Jeśli wymagane jest dokładniejsze oszacowanie ilości przeciwciał pacjenta, należy przeprowadzić badanie seryjnych rozcieńczeń próbek pochodzących od pacjenta i ostatnie rozcieńczenie w ramach badania z wynikiem pozytywnym powinno być zaraportowane jako miano przeciwciał pacjenta. Interpretacja wyników Badanie ELISA jest bardzo wrażliwe na technikę i jest w stanie wychwycić nawet najdrobniejsze różnice w populacjach pacjentów. Poniższe wartości są jedynie wartościami sugerowanymi. Każde laboratorium powinno ustalić własny normalny zakres na podstawie własnych technik, kontroli, sprzętu i populacji pacjentów, zgodnie z własnymi ustalonymi procedurami. Próbka następnie może być sklasyfikowana jako negatywna, słabo pozytywna, średnio pozytywna lub silnie pozytywna, zgodnie z poniższą tabelą. Jednostki Negatywny <20 Słabo pozytywna 20 39 Średnio pozytywna 40 80 Silnie pozytywna >80 Wyniki tego testu przy braku jakichkolwiek innych danych powinny być zgłaszane raczej jako pozytywne (lub negatywne) względem kompleksu Sm/RNP niż samego RNP. (patrz omówienie porównania wartości Sm i RNP poniżej). 4
Porównanie wartości Sm i RNP Wynik pozytywny w teście QUANTA Lite RNP ELISA wskazuje na obecność przeciwciał reaktywnych z kompleksem RNP/Sm, ale nie pozwala rozróżnić aktywności anty-sm i anty-rnp. Firma INOVA sprzedaje test QUANTA Lite Sm ELISA przeznaczony do pomiaru aktywności przeciwciał Sm. Z tych dwóch przeciwciał Sm ma większe znaczenie kliniczne i jest uznawane za marker SLE. Obecność Sm jest użyteczną informacją dla lekarza niezależnie od tego czy, występuje samodzielnie lub w połączeniu z RNP. Jeżeli obecne są przeciwciała przeciwko Sm, występowanie przeciwciał przeciwko RNP może nie być dla lekarza kluczowe. W tych przypadkach wynik może być zgłaszany jako pozytywny dla przeciwciał Sm oraz kompleksu Sm/RNP. Jeżeli pacjent ma pozytywny wynik przeciwciał przeciwko Sm, bardzo prawdopodobne jest także występowanie przeciwciał przeciwko RNP i występowanie przeciwciał anty-sm przy braku anty- RNP jest rzadkie. W celu rozróżnienia ważne jest rozważenie reaktywności próbki w układzie w celu oznaczenia samych przeciwciał przeciwko Sm. Po oznaczeniu aktywności przeciwciał przeciwko Sm można wnioskować aktywność przeciwciał przeciwko RNP. Jeżeli próbka jest negatywna w teście Sm ELISA, ale pozytywna w teście RNP ELISA, wówczas jej reaktywność jest spowodowana głównie lub wyłącznie przeciwciałami przeciwko RNP i można ją zgłaszać bezpośrednio w jednostkach RNP. Jeżeli jednak reaktywność w teście Sm ELISA jest równa reaktywności RNP, wówczas próbka jest przede wszystkim anty- Sm. Pośrednia aktywność Sm większa od wartości granicznej, ale mniejsza niż 80% aktywności RNP wskazuje, że próbka stanowi mieszaninę przeciwciał przeciwko Sm i RNP i powinna być zgłaszana jako pozytywna dla obu przeciwciał. W każdym z tych przypadków aktywność RNP można oszacować odejmując aktywność Sm powyżej wartości granicznej (tj. powyżej 20 jednostek) od całkowitego wyniku testu ELISA RNP. Dla przykładu badanie próbki dające 35 jednostek w teście Sm ELISA i 115 jednostek w teście ELISA RNP należy zgłosić jako 35 jednostek aktywności Sm i 100 jednostek (tj. 115-15) RNP. Oszacowanie aktywności RNP w próbkach wykazujących wysoką aktywność w testach RNP i Sm może być trudne. Gdy próbka jest silnie pozytywna (tj. powyżej 100 jednostek lub absorbancja powyżej 1,0) zarówno dla Sm jak i RNP, odejmowanie aktywności Sm od RNP może fałszywie wskazywać wynik negatywny dla RNP. Próbki silnie pozytywne (>100 jednostek) zarówno pod względem RNP oraz Sm zaleca się zbadać ponownie w rozcieńczeniu 1/10 i 1/20 (w rozcieńczalniku do próbek) w celu ustalenia, czy aktywność RNP jest wyższa niż Sm. Obliczenia muszą zostać przeprowadzone na tym samym rozcieńczeniu próbki pacjenta. Alternatywnie próbkę można zbadać za pomocą innej techniki, takiej jak test podwójnej dyfuzji Ouchterlony. Ograniczenia badania 1. Obecność kompleksów immunologicznych lub innych agregatów immunoglobuliny w próbce pochodzącej od pacjenta może powodować podwyższony poziom nieswoistego wiązania i wytwarzać fałszywe pozytywne wyniki w tym badaniu. 2. Nie u wszystkich pacjentów z SLE występują przeciwciała przeciwko RNP. Badania metodą Ouchterlony wykazywały przeciwciała przeciwko RNP jedynie u 19% (20/105) pacjentów z SLE. 3. Wyniki tego badania powinny być użyte w powiązaniu z wynikami klinicznymi i innymi badaniami serologicznymi. 4. Charakterystyka wyników badania nie została ustanowiona dla podłoża innego niż surowica. Spodziewane wartości Zdolność testu QUANTA Lite RNP ELISA do wykrywania przeciwciał przeciwko RNP oceniano przez porównanie z dostępnymi w handlu testami podwójnej dyfuzji firmy INOVA Diagnostics, Inc. Wyniki testów Ouchterlony oznaczano jako pozytywne, jeżeli występowały linie precypitatu identyczności i jako negatywne jeżeli nie obserwowano żadnej linii lub obserwowano linię świadczącą o nieidentyczności. W teście ELISA udział przeciwciał przeciwko Sm w reaktywności testu RNP dostosowano przez porównanie reaktywności w teście QUANTA Lite RNP ELISA z reaktywnością tej samej próbki w teście QUANTA Lite Sm ELISA. Normalny zakres Wybrano sto jeden losowych próbek surowicy i zbadano je za pomocą testu RNP ELISA. Średnia populacji próbki wyniosła 4,7 jednostki ze standardowym odchyleniem 1,1 jednostki. Zakres populacji wyniósł od 1,4 do 10,1 jednostek. Ta próba wykazała, że normalna średnia wynosi ponad 13 standardowych odchyleń poniżej wartości granicznej. Swoistość i czułość względna W celu określenia względnej czułości i swoistości testu próbki od 223 pacjentów z dodatnim wynikiem ANA zawierające przeciwciała przeciwko wielu różnym antygenom jądrowym zbadano zarówno za pomocą metody Ouchterlony jak i ELISA. Zawsze w przypadku wystąpienia rozbieżności między wynikami testów Ouchterlony i ELISA próbki badano ponownie za pomocą zatwierdzonej metody ELISA do wykrywania swoistych przeciwciał przeciwko RNP, które mogą mieć miano poniżej granicy wykrywania techniki Ouchterlony. Spośród 223 przetestowanych próbek 71 były pozytywne a 146 negatywne wg obu metod. Jedna z próbek była pozytywna w teście Ouchterlony, ale negatywna w teście ELISA. Ta próbka była także negatywna w innej dostępnej w handlu metodzie ELISA dla RNP. Ostatnich 5 próbek było pozytywnych wg ELISA ale negatywnych wg badania Ouchterlony. Każda z tych próbek była także badana za pomocą innej dostępnej procedury ELISA i jedna z pięciu wykazywała pozytywną reakcję z RNP, natomiast pozostałe cztery próbki były negatywne. Wyniki testu RNP ELISA zebrano w tabeli poniżej i przyjęto, że jedna próbka pozytywna w obu metodach ELISA jest reakcją prawdziwie pozytywną. INOVA + - + 72 1 Wrażliwość względna 98,6% OT Swoistość względna 97,3% - 4 146 Skuteczność względna 97,8% 5
Precyzja i powtarzalność Precyzja i powtarzalność badania zostały przebadane przez przeprowadzenie sześciu powtórzeń każdej silnie pozytywnej i słabo pozytywnej próbki w sześciu oddzielnych badaniach. Średnia reakcyjność silnie pozytywnych wynosiła 110,2 jednostki, a wartość średnia słabo pozytywnych wynosiła 33,8. Poniżej znajduje się podsumowanie odchylenia standardowego oraz współczynnika zmienności dla każdej próbki. Silnie pozytywna Słabo pozytywna SD CV SD CV Łącznie 5,3 4,9% 1,9 5,6% W ramach serii 3,7 3,4% 1,6 4,9% Pomiędzy seriami 4,8 4,4% 1,2 3,6% 6
Piśmiennictwo 1. Tan EM: Autoantibodies to nuclear antigens(ana): Their immunobiology and medicine. Advances in Immunology 33: 167-239, 1982. 2. Tan EM, et al.: The 1982 Revised Criteria for the Classification of Systemic Lupus Erythematosus. Arthritis and Rheumatism 25: 1271-1277, 1982. 3. Reichlin M and Maddison PJ: Soluble tissue autoantibodies which precipitate with sera of patients with connective tissue diseases. In: Immunopathology of the skin, 2nd ed(eh Beutner,TP Chorzelski, SF Bean, eds)john Wiley and Sons, NY pp 351-362, 1979. 4. Reichlin M and Mattioli M.: Correlation of a precipitin reaction to an RNA protein antigen and a low prevalence of nephritis in patients with systemic lupus erythematosus. N Eng J Med 286:908-911, 1972. 5. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control/National Institute of Health, 2007, Fifth Edition 7
NOVA Lite jest zastrzeżonym znakiem handlowym firmy INOVA Diagnostics, Inc. Copyright 2011. Wszelkie prawa zastrzeżone Wyprodukowano przez: INOVA Diagnostics, Inc. 9900 Old Grove Road San Diego, CA 92131 Stany Zjednoczone Ameryki Pomoc techniczna (tylko na terenie Stanów Zjednoczonych i Kanady): 877-829-4745 Pomoc techniczna (poza terenem Stanów Zjednoczonych): 00+ 1 858-805-7950 support@inovadx.com Autoryzowani przedstawiciele na terenie Unii Europejskiej: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D-66386 St. Ingbert, Niemcy Tel.: +49-6894-581020 Faks.: +49-6894-581021 www.mt-procons.com 628565POL Luty 2011 Wersja 0 8