Rozdział 28 Potranslacyjne modyfikacje białek i ich losy wkomórce 28.1. Wewnątrzkomórkowy transport białek oraz ich wydzielanie Losy cząsteczki białka p owsta jącego w pro cesie translacji są do p ewnego stopnia zaprogramowane w zapisie genowym w p ostaci sekwencji kilku kilkunastu aminokwasów. d tych sekwencji zależy czy białko p ozostanie w cytozolu lub p owędruje do organelli (np. do mito chondriów), alb o wreszcie czy zostanie wbudowane w błony czy też wydzielone z komórki. Wyróżnić można dwie główne drogi białek w komórce przedstawione na Rys. 28-1. Białka: cytoplazmatyczne jądrowe mitochondrialne plastydów peroksysomów Białka: wydzielnicze błony komórkowej ER aparatu Golgiego lizosomów uwalniane do cytoplazmy transport potranslacyjny przechodzą przez ER transport ko-translacyjny Rysunek 28-1: Dwie grupy białek wyróżnione ze względu na miejsce translacji i p óźniejsze losy. Białka pierwszej grupy p owsta ją na p olisomach utworzonych w cytoplazmie, p o zakończeniu translacji są uwalniane do cytoplazmy i alb o w niej p ozosta ją (białka cytoplazmatyczne), alb o są kierowane do róż- Peptyd nych przedziałów komórkowych. Białka drugiej grupy są syntetyzowane sygnałowy na ryb osomach przylega jących do szorstkiej siateczki śró dplazmatycznej (RER, ang.roughendoplasmicreticulum ) i już w trakcie syntezy są kierowane do wnętrza kanałów siateczki. Wiele z tych białek to białka wydzielnicze i białka błonowe, ale także białka funkcjonujące w obrębie siateczki śró dplazmatycznej, aparatu Golgiego czy trafia jące do lizosomów. Wszystkie białka tej grupy zawiera ją na jczęściej na -końcu charakterystyczną sekwencję określaną jakopeptyd sygnałowy. Znane są także sekwencje, kierujące białka do p oszczególnych organelli, określane jakosekwencje sygnałowe, adresowe lub kierujące (Tab ela 28-1).
360 Potranslacyjne modyfikacje białek i ich losy w komórce Tabela 28-1: ekwencje kierujące białka do p oszczególnych przedziałów komórkowych Adres ekwencja Umiejscowienie w łańcuchu Do ER (i dalej) p eptyd sygnałowy -koniec Białka siateczki KDEL (Lys-Asp-Glu-Leu) -koniec Do jądra sekwencja aa zasadowych np. KKKRK wewnątrz łańcucha Do mito chondriów sekw. aa hydrofob owych i zasadowych np. MLLRQIRFFKPATRTLRY* -koniec Do p eroksysomów KL (er-lys-leu) blisko -końca Do lizosomów mannozo-6-p (przyłączona do sp ecyficznej domeny) *wyróżniono aminokwasy zasadowe domena utworzona przez kilka sekwencji wewnątrz łańcucha Peptydy sygnałowe różnych białek ma ją p o dobną budowę (Rys. 28-2) i są o dp owiedzialne za to, że ryb osom, który rozp o czął syntezę białka wydzielniczego (jak np. albumina wydzielana przez komórki wątroby czy insulina wydzielana przez komóreki β trzustki), przyłączy się do siateczki śró dplazmatycznej. peptydaza sygnałowa p e p t y d s y g n a ł o w y metionina reszta aminokwasowa zasadowa (Arg, Lys) dowolny aminokwas reszta aminokwasowa apolarna mała reszta aminokwasowa apolarna (np. Ala) Rysunek 28-2: Przykładowy p eptyd sygnałowy. W pro cesie kierującym ryb osom do ER uczestniczy para białek: RP cząstka rozp ozna jąca sygnał (ang.ignalrecognitionparticle ) oraz jej receptor, hetero dimer wbudowany w błonę ER (Rys. 28-3). RP rozp ozna je p eptyd sygnałowy wynurza jący się z ryb osomu, wiąże go, a p o- tem wiąże się ze swoim receptorem w błonie siateczki. astępnie do cho dzi do przeniesienia ryb osomu nakanał translokonu struktury utworzonej przez trzy cząsteczki białka ec61α przy Kanał translokonu wsp ółudziale białek ec61β i γ. Peptyd sygnałowy zosta je zakotwiczony w kanale translokonu, a syntetyzowany łańcuch p olip eptydowy wydłuża się do światła siateczki. Po zakończeniu syntezy białka rozpuszczalnego (synteza białek błonowych jest bardziej złożona) p eptyd sygnałowy ulega
28.1. Wewnątrzkomórkowy transport białek oraz ich wydzielanie 361 przeniesieniu p oza obręb kanału, gdzie do cho dzi do proteolizy wiązania p omiędzy p eptydem sygnałowym i resztą cząsteczki białka przez swoisty enzym,peptydazę sygnałową (Rys. 28-4). peptyd sygnałowy RP Rybosom błona ER Rysunek 28-3: ddziaływanie RP receptor RP warunkuje syntezę białek wydzielniczych na ryb osomach związanych z siateczką śró dplazmatyczną. receptor RP A B mra błona ER błona ER translokon peptyd sygnałowy D peptydaza sygnałowa Rysunek 28-4: Etapy syntezy białka wydzielniczego.a, ryb osom wiąże się z translokonem. Kanał, przez który białko wynurza się z ryb osomu, zosta je umiejscowiony b ezp o- średnio nad kanałem translokonu. Peptyd sygnałowy zakotwicza się w kanale translokonu. B, łańcuch p olip eptydowy jest syntetyzowany do wnętrza ER., p o zakończonej syntezie następuje przesunięcie p eptydu sygnałowego z kanału do błony i o dcięcie go przez p eptydazę sygnałową, co skutkuje uwolnieniem rozpuszczalnego białka do światła ER. D, p o wędrówce i do jrzewaniu w ER i aparacie Golgiego białko zostanie wydzielone na zewnątrz komórki. -koniec p olip eptydu; -koniec p olip eptydu.
362 Potranslacyjne modyfikacje białek i ich losy w komórce Badania nad rolą szorstkiej siateczki śró dplazmatycznej w wydzielaniu białek zainicjował George Palade (agro da obla w 1974 r.), a kontynuował jego uczeń G ünter Blob el, który wyjaśnił reguły wewnątrzkomórkowego transp ortu i segregacji białek oraz mechanizm translokacji p eptydu przez błonę siateczki (agro da obla w 1999 r.). 28.2. Potranslacyjne modyfikacje białek Do dziś p oznano kilkadziesiąt różnych p otranslacyjnych mo dyfikacji białek. Wśró d nich można wyróżnić: ieo dwracalne mo dyfikacjewarunkujące natywną, funkcjonalną strukturę białka (np. przyłączenie hemu do białkowego łańcucha cyto chromu, hydroksylacja proliny i lizyny prokolagenu). Te mo dyfikacje następują jeszcze w trakcie lub zaraz p o translacji białka. dwracalne mo dyfikacjeregulujące aktywność czy funkcję białka (np. fosforylacja, acetylacja). ieo dwracalne mo dyfikacjeprowadzące do degradacji białka (p oliubikwitynacja). Wiele p otranslacyjnych mo dyfikacji wymyka się tej klasyfikacji. p. glikozylacja dla niektórych białek b ędzie warunkować ich aktywność, a dla innych b ędzie jedynie ułatwiać do jrzewanie i chronić przed degradacją proteolityczną. Ro dza j mo dyfikacji cząsteczki białka jest w dużym stopniu determinowany miejscem jego syntezy: innym mo dyfikacjom ulega ją białka uwalniane do cytoplazmy, a innym białka wędrujące przez kanały siateczki endoplazmatycznej i aparatu Golgiego. ząsteczki obu grup białek ulega ją p o dczas syntezy fałdowaniu przyjmują natywną trzeciorzędową, a niektóre czwartorzędową strukturę. Pomaga ją im w tym pro cesiebiałka opiekuńcze, czaperony (ang. chaperones ), wśró d których wio dącą rolę w komórkach eukariotycznych o dgrywa ją białka z ro dziny Hsp70. W siateczce śró dplazmatycznej, opró cz białka opiekuńczego Bip (z rodziny Hsp70), dużą rolę o dgrywa ją kalneksyna i kalretikulina białka opiekuńcze dla glikoprotein. Dla przyjęcia prawidłowej struktury białek istotna jest również aktywność enzymu PDI, izomerazy disiarczkowej białek (ang.proteindisulfideisomerase ). Enzym ten (występujący tylko w ER) może zmienić układ mostków disiarczkowych w syntetyzowanym białku dzięki o ddziaływaniu swo jej reszty cysteiny z mostkiem disiarczkowym białka (Rys. 28-5). Inny typ izomeraz izomerazy p eptydylo-prolilowe występujące zarówno w ER, jak i cytoplazmie, zmienia ją konformację wiązania p eptydowego przy reszcie proliny z trans na cis, umożliwia jąc tym samym sp ecyficzne zgięcie łańcucha p olip eptydowego.
28.2. Potranslacyjne modyfikacje białek 363 PDI PDI PDI PDI Rysunek 28-5: Rearanżacja mostków disiarczkowych przez PDI schemat. Jedną z na jp owszechniejszych mo dyfikacji zacho dzących w ER jest glikozylacja (patrz Rozdział 17.5); ogromna większość białek przecho dzących przez ER ulega tej mo dyfikacji (znanym wyjątkiem jest albumina). iektóre reszty cukrowe glikoprotein ma ją właściwości kierowania białka do przedziałów subkomórkowych mannozo-6-fosforan jest sygnałem do przekazania cząsteczki glikoproteiny do lizosomów. W pro cesach transp ortu i segregacji białek (ang. intracel lular trafficking ) ogromną rolę o dgrywa ją receptory błonowe i system p ęcherzyków wywo dzących się z siateczki śró dplazmatycznej i cystern Golgiego. Inną istotną mo dyfikacją niektórych białek (zacho dzącą w aparacie Golgiego i p ęcherzykach sekrecyjnych) jestograniczona proteoliza. Usunięcie -końcowego fragmentu (lub w przypadku insuliny wewnętrznego fragmentu p eptydu) prowadzi do przyjęcia przez białko aktywnej konformacji. Zjawisko to dotyczy wielu enzymów proteolitycznych i hormonów pro dukowanych w formie tzw. probiałek (Rys. 28-6). p r e p r o b i a ł k o sekwencja pre sekwencja pro sekwencja dojrzałego białka Rysunek 28-6: chemat budowy białka wydzielniczego pro dukowanego w formie nieaktywnego prekursora. W pro cesie do jrzewania białka na j- pierw zosta je o dcięta sekwencja pre (zawiera jąca p eptyd sygnałowy), a następnie sekwencja pro. Jeśli sekwencja pro zna jduje się przy - końcu białka białko do jrzałe b ędzie p o jedynczym łańcuchem p olip eptydowym różniącym się -końcem o d swo jej proformy. Jeśli sekwencja pro zna jduje się wewnątrz łańcucha, to do jrzałe białko b ędzie zbudowane z dwó ch łańcuchów p olip eptydowych, często (jak w przypadku insuliny) p ołączonych mostkami disiarczkowymi. Innym typ em p otranslacyjnych mo dyfikacji białek jest przyłączenie do nich hydrofob owych fragmentów p ozwala jących na zakotwiczenie p o- lip eptydów w błonie. Przyłączeniekotwicy GPI (glikozylofosfatydyloinozytolowej, ang.glycosylphosphatidylinositol ) do p ewnych białek, zacho dzącewewnątrz ER, p owo duje, że białka te nie ulega ją wydzieleniu lecz p ozosta ją zakotwiczone w błonie komórkowej na zewnątrz komórki Kotwice białek błonowych
364 Potranslacyjne modyfikacje białek i ich losy w komórce (Rys. 28-7). Do tak zakotwiczonych białek należą na przykład: D14 receptor LP, PH20 hialuronidaza plemników, niektóre metaloproteazy macierzy zewnątrzkomórkowej, białka p owierzchni błony pierwotniaków (Toxoplasma, Leishmania ) czy białko prionowe PrP. Białka związane z błoną przez kotwicę GPI mogą być uwalniane przez fofosfolipazy lub D rozp ozna jące fosfatydyloinozytol. inozytol P P P reszta fosforanowa etanoloamina cukry i aminocukry błona komórkowa Rysunek 28-7: Kotwica GPI. Wiązanie kowalencyjne tworzy się p omiędzy grupą aminową etanoloaminy, a grupą karb oksylową -końcowego aminokwasu białka. atomiast białka kierowane do cytoplazmy mogą ulegać zakotwiczeniu w błonie komórkowej o d wewnątrz komórki, a także w błonach organelli komórkowych przez przyłączenie kwasu mirystynowego (do - końca), kwasu palmitynowego (do reszt cysteiny wewnątrz łańcucha p eptydowego) lub związków izoprenowych: farnezylu lub geranylogeranylu (do reszt cysteiny blisko -końca białka) (Rys. 28-8). Znaczenie przyłączania tego typu kotwic nie musi się ograniczać do umożliwienia błonowej lokalizacji białka, ale może mieć znaczenie regulatorowe, gdyż palmitylacji ulega ją między innymi receptory siedmiokrotnie przebija jące błonę komórkową (tzw. receptory metab otrop owe). Mimo że synteza każdego białka zaczyna się o d metioniny, ten aminokwas rzadko występuje na -końcu do jrzałego białka. Dzieje się tak na skutek działania p eptydazy sygnałowej lub sp ecyficznych aminop eptydaz usuwa jących pierwszy (p eptydaza metioninowa) ewentualnie także kolejny aminokwas. Usunięcie metioniny może warunkować mirystylację przyłączenie kwasu mirystynowego zacho dzi wówczas, gdy usunięcie metioniny o dsłoni glicynę (istotny jest także aminokwas w p ozycji 6, patrz Rys. 28-8). a jlepiej zbadaną o dwracalną mo dyfikacją białek, regulującą ich aktywność jest fosforylacja (omawiana w zęści I i I I). oraz więcej uwagi badaczy przycią gaacetylacja i metylacja mo dyfikacje dotyczące głównie (cho ć nie tylko) białek jądrowych. Wzórmetylacji i acetyla-
28.2. Potranslacyjne modyfikacje białek 365 cji histonów w danym obszarze chromatyny jest kluczowy dla pro cesu transkryp cji genów zna jdujących się w tym miejscu. H -Gly-X-X-X-er/Thr kotwica mirystylowa (14) -ys kotwica palmitylowa (16) ys H 3 kotwica farnezylowa (15) ys H 3 kotwica geranylogeranylowa (20) Rysunek 28-8: p osoby zakotwiczania białek wewnątrzkomórkowych w błonach. Białka zdenaturowane, nieprawidłowo sfałdowane lub rozp oznawane jako ob ce są kierowane do całkowitejdegradacji w proteasomie przez naznaczenie ich na dro dzepoliubikwitynacji (patrz: Rozdział 7.2.3). Polega Rola ona na kowalencyjnym p ołączeniu ubikwityny (Ub), 76-aminokwasowego ubikwitynacji p owszechnie występującego p olip eptydu, do grupy ω-h 2 reszty lizyny danego białka. Do pierwszej przyłączonej Ub zosta ją przyłączone kolejne cząsteczki Ub (przez resztę lizyny 48 ubikwityny). Ten typ kierowania do degradacji dotyczy również białek krótkożyjących, zawiera jącychdegrony sygnały degradacji. ajlepiej poznanym degronem jest -degron stanowiący po prostu -końcowy aminokwas białka. Degradacja zachodzi zgodnie z regułą -końca(ang. the -end rule): jeśli - końcowym aminokwasem białka jest aminokwas zasadowy(arg, Lys, His) lub aminokwas o dużej hydrofobowej grupie bocznej(leu, Ile, Trp, Tyr, Phe) to takie białko ulega szybkiej degradacji. ho ć p o czątkowo przypuszczano, że ubikwitynacja prowadzi zawsze do degradacji białka, to jednak p óźniejsze badania wykazały, że w zależności o d sp osobu przyłączenia tego p olip eptydu do cząsteczki białka, Ub może p ełnić również funkcje regulujące jego aktywność (Rys. 28-9).
366 Potranslacyjne modyfikacje białek i ich losy w komórce Mono-Ub K Endocytoza aprawa DA Regulacja histonów białko ulegające ubikwitynacji Multi-Ub K K K Endocytoza K ubikwityna reszta lizyny Poli-Ub K K48 - degradacja K63 - naprawa DA endocytoza Rysunek 28-9: Różne funkcje ubikwitynacji. Po jedyncza cząsteczka ubikwityny przyłączona do jednej reszty lizyny w białku (monoubikwitynacja) reguluje aktywność histonów oraz białek zaangażowanych w endocytozę i naprawę DA. Po jedyncze cząsteczki ubikwityny przyłączone do kilku reszt lizyny w białku (multiubikwitynacja) reguluje aktywność białek zaangażowanych w endo cytozę. W przypadku p oliubikwitynacji: jeśli kolejne cząsteczki Ub przyłącza ją się do już związanej z białkiem Ub p oprzez reszty lizyny 48 stanowi to sygnał do degradacji; jeśli kolejne reszty Ub przyłącza ją się p oprzez Lys 63 zacho dzi regulacja aktywności niektórych białek zaangażowanych w endo cytozę i naprawę DA.