Mechanizmy regulacji białek

Transkrypt

1 Mechanizmy regulacji białek

2 Funkcja białka jest kontrolowana na wielu poziomach: -lokalizacja produktu genu i/lub jego partnerów -kowalencyjne i niekowalencyjne wiązanie efektorów -ilość i czas życia aktywnego białka

3 Funkcja białka jest kontrolowana na wielu poziomach: -lokalizacja produktu genu i/lub jego partnerów -- sekwencje sygnalne -- dołączenie ogona lipidowego/modyfikacje potranslacyjne -- kierowanie poprzez strukturalną domenę oddziałującą -kowalencyjne i niekowalencyjne wiązanie efektorów -ilość i czas życia aktywnego białka

4 Funkcja białka jest kontrolowana na wielu poziomach: -lokalizacja produktu genu i/lub jego partnerów -kowalencyjne i niekowalencyjne wiązanie efektorów -- efektory, od protonu do wielodomenowego białka -- odwracalne bądź nieodwracalne -- allosteria (kooperatywność pozytywna i negatywna) -- inhibicja (substrat, produkt) -ilość i czas życia aktywnego białka

5 Funkcja białka jest kontrolowana na wielu poziomach: -lokalizacja produktu genu i/lub jego partnerów -kowalencyjne i niekowalencyjne wiązanie efektorów -ilość i czas życia aktywnego białka -- na różnych etapach w drodze od genu do białka -- poziom transkrypcji (represor, aktywator, trna) -- poziom degradacji mrna -- poziom degradacji białka Aktywność pojedynczego białka może być regulowana na wielu różnych poziomach

6 Kinaza białkowa zależna od cykliny, kontrolująca cykl komórkowy, jest regulowana przez wiele mechanizmów ściśle kontrolowana ilość białka Aktywacja Cdk we właściwym czasie cyklu komórkowego wymaga: - związania cykliny (co powoduje zmiany konformacyjne w Cdk), Cdk-activating kinase - fosforylacji Cdk (możliwej tylko w kompleksie z cykliną) oraz defosforylacji 1-2 reszt tyrozyny - fosforylacji tyrozyn inhibitorowych na Cdk (odwracalna, kontrolowana przez kinazę i fosfatazę o regulowanej aktywności) finely tuned steps

7 Domeny odpowiedzialne za oddziaływanie (rozpoznanie) (interaction domains, recognition module) -lokalizacja, prezentacja substratu, funkcja autoinhibitorowa -niezależnie zwinięte, reszt aa -koniec C i N przestrzenne zbliżone inkorporacja w rejony pętli, kombinatoryjna organizacja w białkach wielodomenowych -różnice w obrębie rodziny odpowiadają za specyficzność -przykłady: -- rozpoznanie sekwencji bogatych w Pro SH3, WW, EVH1 -- rozpoznanie fosfotyrozyny SH2, PTB -- rozpoznanie fosfoseryny i fosfothreoniny , FHA, PBD, WD40 -- rozpoznanie fosfolipidów PH, FYVE wielodomenowość, oligomeryzacja, różna orientacja domen kolejny poziom regulatorowej specyficzności i wszechstronności

8 Interaction domains

9 Interaction domains

10 -analiza produktów genów biorących udział w ścieżkach sygnalizacyjnych czy metabolicznych pokazuje, że nie ma tylu różnych białek by zadowolić wszystkie oddziaływania, które muszą być utworzone -nie ma tyle genów aby zaspokoić wszystkie funkcje komórkowe wiele białek uczestniczy w więcej niż jednym procesie -precyzyjna lokalizacja jest głównym mechanizmem regulującym funkcję białek (kinazy) -u eukariontów praktycznie nie ma białek wolno pływających w komórce. Każde białko jest uwięzione w kompleksie białkowym, organellum, pęcherzyku transportowym, błonie lub jest pasażerem na aktynowych szlakach cytoszkieletu -zwiększona organizacja a nie liczba genów jest cechą wyróżniającą komórkę eukariotyczną Komórka Schizosaccharomyces pombe ma mniej genów niż Pseudomonas aeruginosa

11 Mechanizmy kierowania białek - odpowiednia sekwencja w samym białku (kierowane kotranslacyjnie lub później) --KDEL ER, KRKR jądro, sekwencja hydrofobowa sekrecja - modyfikacja potranslacyjna (możliwa regulacja) --fosforylacja Tyr, Ser, Thr przez kinazy kierowanie do kompleksów rozpoznających te modyfikacje; różne kotwice lipidowe zakotwiczenie w konkretnym fragmencie dwuwarstwy lipidowej - wiązanie do białek rusztowaniowych (scaffold proteins) -- wiążą kilka białek jednocześnie promując ich wzajemne oddziaływanie (obecność kombinacji domen pośredniczących oddziaływaniom białkobiałko, np. SH2, SH3, PH, PDZ)

12 - funkcja białka jest regulowana przez środowisko w którym ono działa -- lepkość, stężenie makrocząstek, jonów, elementów kwaśnych i zasadowych - zmiany potencjału redoks mają duży wpływ na strukturę i funkcję białka -- wnętrze redukujące, na zewnątrz warunki utleniające (oligomeryzacja przez S-S dopiero po sekrecji, np. esteraza acetylocholinowa) - zmiany ph drastycznie zmieniają strukturę i funkcję białka -- siła wiązania liganda (oddziaływania elektrostatyczne) oraz stopień jonizacji grup katalitycznych zmienia się znacząco ze zmianą ph i stężeniem jonów Endosomalna hydrolaza - katepsyna D obniżenie ph odsłania centrum aktywne i poprzez odpowiednią protonację reszt katalitycznych aktywuje enzym

13 Sprytny sposób na zabicie komórki - toksyna błonicza B odpowiedzialna za mediowaną przez receptor endocytozę A związana z B poprzez S-S, enzym ADP-rybozylujący EF2 blok syntezy białka T duża zmiana konformacyjna pod wpływem obniżenia ph, ekspozycja powierzchni hydrofobowej i utworzenie kanału przez który A wydostaje się do cytoplazmy warunki redukujące pęknięcie mostka S-S w A obniżenie ph zmiana konformacyjna w T

14 Synteza glutationu (GSH) kontrola negatywna poprzez wiązanie liganda sprzężenie zwrotne ujemne inhibicja kompetycyjna

15 Kooperatywne wiązanie liganda wzmacnia jego efekt

16 Regulacja allosteryczna

17 - ATCaza dostarcza kluczowego substratu w syntezie pirymidyn, ma sześć podjednostek regulatorowych i sześć katalitycznych - enzym jest aktywowany alosterycznie przez ATP (końcowy produkt syntezy puryn) - ATCaza jest hamowana przez CTP (końcowy produkt syntezy pirymidyn) CTP Ten sam efekt wywołuje mutacja Tyr77Phe w podjednostce regulatorowej Indukowana ligandem zmiana konformacyjna aktywuje transkarbamylazę asparaginianu (ATCazę)

18 Wiązanie Fe 2+ (korepresora) aktywuje represor genu toksyny dyfterytu (położenie helis rozpoznających X i końców N) - co-repressor, co-activator

19 Kontrola funkcji białka poprzez modyfikacje kowalencyjne - ocenia się, że 50-90% ludzkich białek jest modyfikowane potranslacyjnie. Pozwala to komórce poszerzyć strukturalny i funkcjonalny repertuar ponad ograniczony zestaw 20 naturalnie występujących w białkach aminokwasów; - odkryto ponad 40 różnych modyfikacji kowalencyjnych białek; - najważniejsze z nich to: fosforylacja, glikozylacja, lipidacja, metylacja, N-acetylacja, S-nitrozylacja, przyłączenie SUMO i ograniczona proteoliza - modyfikacje mogą zmieniać lokalizację białka, jego aktywność oraz oddziaływania

20 /mitogen Fosforylacja -najbardziej powszechną kowalencyjną modyfikacją jest odwracalna fosforylacja Ser, Thr i Tyr (u prokariontów His i Asp). Grupy fosforanowe przenoszone są za pomocą oddzielnych enzymów: kinaz i fosfataz, co wprowadza precyzyjny mechanizm regulacyjny. -u człowieka zidentyfikowano 575 kinaz białkowych. Stanowią więc one trzecią co do liczności grupę domen (2% genomu) -fosforylacja białka sprawia, że zyskuje ono naładowaną grupę zdolną do tworzenia wielu HB zarówno z amidami łańcucha głównego, jak i poprzez mostki solne z argininami Aktywacja kaskady kinaz MAP fosforylacja przejściowo wprowadza nowe miejsca oddziaływania białko-białko (!)

21 Zmiana konformcyjna indukowana fosforylacją fosforylazy glikogenu - przyłączenie fosforanu do Ser14 powoduje rearanżacje reszt z końca N tak, że łańcuch boczny seryny przesuwa się o 50 Å zmieniając powierzchnię kontaktu monomerów w dimerze. Wynikające z tego zmiany konformacyjne w centrum katalitycznym aktywują całe białko.

22 -inaktywacja dehydrogenazy przez fosforylację następuje bez zmian konformacyjnych -przyłączenie fosforanu, do obecnej w centrum aktywnym Ser113, hamuje wiązanie negatywnie naładowanego substratu zarówno poprzez zawadę steryczną, jak i odpychanie elektrostatyczne izocytrynian kolor żółty fosforan na Ser113 kolor czerwony centrum aktywne kolor zielony Inaktywacja centrum aktywnego dehydrogenazy izocytrynianiu z E. coli przez fosforylację

23 Aktywacja kinaz przez fosforylację. Grupa kinaz Src.

24 Kinazy zależne od cyklin (Cdk)

25 Glikozylacja nowe miejsca rozpoznania (bardzo duże zróżnicowanie), ochrona przed proteolizą (immunoglobuliny), wpływ na aktywność enzymatyczną, ułatwianie zwijania białek, zwiększanie rozpuszczalności, zapobieganie agregacji, blokowanie fosforylacji (odwracalna monoglikozylacja Ser/Thr), immunogeniczność Schemat rdzeni oligosacharydowych

26 Struktura Glc3Man9GlcNAc2

27 Wielostopniowe procesowanie oligosacharydów

28 Glikozylacja Ochrona immunoglobuliny A przed organizmami patogennymi

29 Metylacja - nieodwracalna - głównie białka jądrowe - donorem grup metylowych jest S-adenozylometionina - w obrębie sekwencji RGG, RXR i GRG - zaburza oddziaływania białko-białko (sterycznie) - metylacja Arg ważna w regulacji rybonukleoprotein procesujących mrna - metylacja Lys, poprzez modyfikację histonów, zmienia stan funkcjonalny chromatyny Wzory strukturalne metylowanych reszt Arg i Lys

30 N-acetylacja -głównie dotyczy końca N, donorem jest acetylo-coa -ponad 1/3 białek drożdżowych jest N-acetylowana -jedną z funkcji regulacyjnych jest wpływ na czas życia białka w komórce poprzez zablokowanie działania aminopeptydaz -acetylacja końca N jest praktycznie nieodwracalna, ale modyfikacje epsilon-aminowej grupy lizyny bywają odwracalne (np. w histonach) -w porównaniu z metylacją, znosi ładunek modyfikowanej reszty lizyny -zabezpiecza przed działaniem aminopeptydaz

31 Nitrozylacja cysteiny -odwracalna modyfikacja -SH przez NO -ponad 100 białek jest regulowanych przez odwracalną S-nitrozylację krytycznych reszt cysteiny, które sąsiadują z resztami kwaśnymi i zasadowymi oraz cystein będących w otoczeniu hydrofobowym -reszty Cys są kluczowe w koordynacji metalu, centrach katalitycznych, dla struktury białka poprzez tworzenie mostków S-S -NO jest gazem i może modyfikować grupy -SH tylko w pobliżu miejsca syntezy katalizowanej przez NOS

32 S-nitrozylacja w krótkodystansowej sygnalizacji nerwy-mięśnie fosfodiesteraza

33 Lipidacja - Myristoilacja, 14C kwas tłuszczowy dołączony poprzez stabilny amid do N- końcowej Gly - kotranslacyjna - Palmitoilacja, 16C kwas tłuszczowy dołączony poprzez labilny tioester do Cys (S-acylacja) potranslacyjna, odwracalna Kierowanie do błon przez lipidację - Prenylacja, dołączenie farnezylu bądź geranylogeranylu poprzez tioeter do Cys będącej początkowo 4-tą resztą od końca N. Staje się ona resztą C-końcową po proteolitycznym przycięciu i metylacji nowego końca C potranslacyjna, nieodwracalna. Inhibitory farnezylotransferaz są atrakcyjne biomedycznie (Rab)

34 Zakotwiczenie poprzez glikozylofosfatydyloinozytol - Odwracalna modyfikacja polegająca na dołączeniu poprzez łącznik węglowodanowy kotwicy glikozylofosfatydyloinozytolu (GPI) - Regulacja funkcji - enzym nieaktywny w formie z GPI jest aktywowany przez działanie fosfolipazy (pasożyty).

35 GTPazy kierujące wewnątrzkomórkowym ruchem pęcherzyków odwracalnie wiążą się z błonami -ARF (ADP-ribosylation factor), w formie z GDP, jest rozpuszczalna a myristoilowy ogon ukryty jest w hydrofobowej kieszeni białka -GDP/GTP aktywacja ARF, poprzez specyficzny GEF w błonie aparatu Golgiego, powoduje rearanżacje N- końcowego regionu ARF, uwolnienie lipidowego ogona i zakotwiczenie GTPazy w błonie -związany do błony ARF-GTP rekrutuje białka płaszcza niezbędne do utworzenia i transportu pęcherzyka -jedno z białek płaszcza ma aktywność typu GAP i w odpowiednim momencie powoduje powrót układ do stanu wyjściowego

36 Sumoilacja - dołączenie białka SUMO (small ubiquitinrelated modifier) do sekwencji KXE - SUMO powoduje zmianę lokalizacji komórkowej białka do którego zostaje dołączone - wpływa na stabilność i aktywność transkrypcyjną

37 Ścieżka degradacji ubikitynowanych białek

38 Funkcja aktywnego białka kontrolowana czasem jego życia w komórce -czasy życia białek zawierają się w przedziale od kilku minut do kilku dni i zależą nie tylko od stabilności samego białka, ale również od komórkowej maszynerii degradującej -najkrócej żyjące białka to te zaangażowane w kontrolę procesów komórkowych. Degradacja zapewnia szybką zmianę ich efektywnego stężenia pod wpływem czynników środowiskowych -proteasom zbudowany jest z tunelu degradującego złożonego z czterech pierścieni -czapki (fioletowe) rozpoznają i wiążą kierowane do degradacji białko -przy wejściu, białka są rozwijane z użyciem ATP i kierowane do rdzenia Eukariotyczny proteasom

39 Sygnały degradacyjne - ochronnie działają reszty Met, Ser, Thr, Ala, Val, Cys, Gly oraz Pro na początku łańcucha polipeptydowego, reszta umożliwia atak proteolityczny - sumoilacja może zapobiegać przyłączaniu ubikwityny - degradację mogą promować fosforylacja określonych reszt, denaturacja czy uszkodzenie w wyniku utlenienia - niektóre białka, np. cykliny, posiadają odrębne systemy przyłączania ubikwityny

40 Proteoliza -poza proteolityczną degradacją i inaktywacją, wiele białek jest proteolitycznie modyfikowanych w celu ich aktywacji z nieaktywnych, bądź tylko marginalnie aktywnych prekursorów -w chymotrypsynogenie obecność wiązania kowalencyjnego pomiędzy Arg15 a Ile16 oraz kilku niekowalentnych oddziaływań tworzonych pomiędzy nimi a ich sąsiadami uniemożliwia osiągnięcie właściwej dla katalizy konformacji centrum aktywnego Aktywacja chymotrypsynogenu

41 -Proteoliza Arg 15 /Ile 16 przez trypsynę powoduje, że N-końcowy peptyd pozostaje przy białku dzięki S-S. Nowy koniec N przyjmuje konformację, w której tworzy oddziaływania z centrum aktywnym (Ile-Asp) prowadząc do pełnej aktywacji katalitycznej enzymu. -Dodatkowo następuje autokatalityczne odcięcie reszt 14, 15, 147 i 148 prowadzące do dojrzałej formy alfa-chymotrypsyny. Funkcja tych ostatnich modyfikacji nie jest znana. Aktywacja chymotrypsynogenu

42 Porównanie centrów aktywnych plazminogenu (kolor czerwony) i plazminy (kolor niebieski) Trp blokuje dostęp substratu i zniekształca konformację reszt katalitycznych

43 Wytwarzanie krótkich polipeptydowych hormonów -po sekrecji, odcięcie sekwencji sygnalnej przez peptydazę sygnałową -powstają białka o nowych funkcjach -kolejne etapy są tkankowo specyficzne, na przykład: -- w przysadce mózgowej hydroliza prowadzi do utworzenia ACTH i beta-lipotropiny -- w centralnym systemie nerwowym powstaje endorfina i enkefalina Diagram procesowania prepro-opiomelanokortyny

44 Kaskada krzepnięcia krwi wielokrotne wzmocnienie pierwotnego sygnału

45 splicing białek - składanie białek nie wymaga hydrolizy i religacji wiązania peptydowego - cały proces następuje poprzez rearanżację wiązania peptydowego - w wyniku wycięcia inteiny powstają dwa funkcjonalne białka - autokataliza

46 Schemat organizacji białka zawierającego inteinę -A, B i G, zachowywane miejsca niezbędne dla splicingu białka -odkryto ponad 100 różnych intein, 70% znajduje się w białkach zaangażowanych w replikację i naprawę DNA -poznane inteiny zawierają od około 100 do ponad 600 aminokwasów i zbudowane są z domeny odpowiedzialnej za splicing i domeny o aktywności endonukleazy

47 -inteiny są mobilnymi elementami genetycznymi bez innej znanej funkcji niż własna propagacja -domena endonukleazy wycina z genomu fragment DNA odpowiadający własnej sekwencji aminokwasowej i pośredniczy w jego umiejscowieniu w genach, które takiej sekwencji nie posiadają -nie jest jasne, dlaczego inteiny preferują istnienie w białkach związanych z replikacja i naprawą DNA. Struktura inteiny z podjednostki gyrazy A z Mycobacterium xenopi

48 Czterostopniowy mechanizm splicingu białek -1- tlen lub siarka (X) łańcucha bocznego pierwszej reszty inteiny atakuje karbonyl poprzedzającego wiązania peptydowego -2- karbonyl, teraz jako ester lub tioester, jest atakowany przez pierwszą resztę C-końcowej eksteiny (Cys, Ser, Thr) -3- ostatnia reszta inteiny (przeważnie Asn) cyklizuje poprzez własny karbonyl. Powoduje to uwolnienie inteiny (z cykliczną Asn na końcu C) i eksteiny, w której N- i C-koniec powiązane są przez łańcuch boczny pierwszej reszty C-końcowej eksteiny -4- spontaniczna rearanżacja tego estru (lub tioestru) do normalnego wiązania peptydowego kończy proces splicingu Inteiny mają praktyczne zastosowanie w inżynierii białka, biologii strukturalnej i biotechnologii