PRBLEMATYKA: Elektrochemiczne oznaczanie substancji organicznych TEMAT ĆWICZENIA: ZNACZANIE PARACETAMLU (N-ACETYL-4-AMINFENLU) W PREPARATACH FARMACEUTYCZNYCH METDA: Woltamperometria cykliczna WPRWADZENIE Wiele metod analitycznych opartych na elektrochemicznych właściwościach roztworów znalazło szerokie zastosowanie w analizach środowiskowych, toksykologicznych czy nawet przemysłowych. Powodem tak szerokiego ich zastosowania jest wiele zalet charakteryzujących techniki elektroanalityczne, m.in.: wysoka czułość, dokładność oraz precyzja poszczególnych serii pomiarowych, duża wygoda pomiaru zmiennych elektrycznych, niskie koszty aparatury, łatwość automatyzacji oraz komputeryzacji. Wśród technik elektroanalitycznych dokonano podziału ze względu na mierzone zależności i tak: Techniki potencjometryczne badanie potencjału elektrody, który jest funkcją aktywności analitu, Techniki elektrolityczne wydzielenie składnika na elektrodzie, Techniki kulometryczne pomiar ładunku niezbędnego do utlenienia bądź redukcji, Techniki woltamperometryczne pomiar prądu pomiędzy elektrodami w funkcji polaryzacji, Techniki konduktometryczne badanie przewodnictwa elektrycznego. Podstawy fizykochemiczne woltamperometrii Woltamperometrią nazywamy szereg metod elektrochemicznych polegających na pomiarze natężenia prądu płynącego przez stacjonarną elektrodę wskaźnikową w funkcji przyłożonego napięcia (potencjału elektrody) I = f(e). Istotnym jest, aby pomiar prowadzony był w tak dobranych warunkach, by mierzony prąd obrazował przebieg interesującego procesu, a nie procesów przeszkadzających. Pojęcie elektrody stacjonarnej obejmuje elektrody o stałej niezmiennej powierzchni, np. elektrody: platynową, złotą czy grafitową. Do elektrod tego typu zalicza się również elektrody rtęciowe w postaci wiszącej kropli lub cienkiej warstewki osadzonej na przewodzącym podłożu (tzw. elektrody błonkowe). W typowych pomiarach woltamperometrycznych naczyńko składa się z trzech elektrod: pracującej (W lub WE), odniesienia (REF) oraz pomocniczej (AUX, CE), Rys 1. Elektroda pracująca powinna charakteryzować się stosunkowo małą powierzchnią oraz dużą polaryzowalnością. Niewielka powierzchnia zapewnia, iż mierzone wartości prądów są małe, natomiast gęstości prądów duże, co skutkuje, iż ilości analitu biorącego udział w reakcji redoks, mimo wielokrotnego powtarzania pomiaru, nie ulegają znacznemu zmniejszeniu. Polaryzowalność elektrody pracującej oznacza, że w nieobecności depolaryzatora (substancji oznaczanej) nie przebiegają istotne reakcje i przyjmuje ona potencjał zewnętrznego źródła napięcia. Druga elektroda odniesienia, to odwracalna i niepolaryzowalna elektroda o stałym 1
potencjale. Zadaniem elektrody pomocniczej jest zamknięcie obwodu elektrycznego, a prąd przepływa pomiędzy elektrodą pracującą i pomocniczą. Rys. 1. Typowe naczyńko pomiarowe do oznaczeń woltamperometrycznych złożone z trzech elektrod: AUX elektroda pomocnicza, REF elektroda porównawcza, W elektroda pracująca (WE). Ważną rolę w pomiarach woltamperometrycznych odgrywa elektrolit podstawowy, którego stężenie powinno być zdecydowanie większe od stężenia depolaryzatora (stężenie badanego jonu wynosi zwykle mniej niż 1% stężenia elektrolitu podstawowego). Rola elektrolitu podstawowego powinna być ograniczona do transferu ładunku przez roztwór, nie może on natomiast uczestniczyć w reakcjach elektrodowych, powinien również umożliwić oznaczenie analitu w szerokim zakresie potencjałów, zapewnić stałą siłę jonową roztworu, nie może tworzyć z substancją oznaczaną nierozpuszczalnych soli, występuje w jasno zdefiniowanej i jednorodnej formie oraz nie powoduje kontaminacji badanej próbki. Wśród najczęściej stosowanych elektrolitów podstawowych znajdują się roztwory buforowe, roztwory kwasów (HCl, HN 3 ), zasad (NaH, NH 3aq ) i soli obojętnych (KCl, KN 3 ). Jako substancje dodatkowe zastosowanie znalazły również roztwory niektórych surfaktantów (substancji powierzchniowo czynnych) tłumiących maksima np. żelatyna. W związku z przyłożonym zewnętrznym napięciem, które wymusza przebieg reakcji utleniania lub redukcji substancji oznaczanej, podstawowym zjawiskiem wykorzystywanym w technikach woltamperometrycznych jest elektroliza w warstwach przyelektrodowych. W największym uproszczeniu proces ten można podzielić na trzy etapy, a najwolniejszy z nich decyduje o wielkości mierzonego prądu: 1. etap polegający na doprowadzeniu depolaryzatora do powierzchni elektrody, 2. etap reakcji elektrodowej, w czasie której następuje przeniesienie n elektronów od substancji elektrodowo aktywnej do elektrody (utlenianie), bądź od elektrody do depolaryzatora (redukcja), 3. w zależności od postaci chemicznej produkt reakcji może być transportowany do wnętrza roztworu lub pozostawać na powierzchni elektrody. 2
Transport depolaryzatora do powierzchni elektrody pracującej, w przypadku obecności elektrolitu podstawowego, odbywa się na drodze dyfuzji prąd dyfuzyjny to podstawowy prąd mierzony w technikach woltamperometrycznych. Z faktu homogeniczności badanego roztworu wynika, iż stężenie depolaryzatora jest jednakowe w całym naczynku pomiarowym. Spolaryzowanie elektrod powoduje, że w wyniku biegnącej reakcji elektrodowej, w pobliżu elektrody pracującej stężenie analitu zaczyna maleć, co powoduje wytworzenie się gradientu stężenia, ten z kolei wymusza ruch jonów. Dalszy wzrost potencjału elektrody powoduje przyspieszenie reakcji, co widoczne jest jako zwiększenie natężenie prądu płynącego pomiędzy WE a AUX i prowadzi do wyczerpania jonów depolaryzatora na elektrodzie oraz w jej pobliżu. W takiej sytuacji wszystkie jony analitu docierające na drodze dyfuzji do powierzchni elektrody ulegają natychmiast przekształceniu (graniczny prąd dyfuzyjny). pracowano wiele różnych technik woltamperometrycznych, różniących się przebiegiem zmian potencjału elektrody pracującej. Najbardziej popularne to: hydromechaniczna, różnicowa, różniczkowa, z liniową zmiana potencjału (LSV), cykliczna (CV) inwersyjna (stripingowa). Woltamperometria cykliczna Woltamperometria cykliczna to jedna z metod, która znalazła szczególne zastosowanie przy pomiarach termodynamicznych potencjałów redoks. kreślenie cykliczna wynika ze sposobu prowadzenia pomiaru: gdy w naczyniu zachodzi reakcja AB, która jest np. elektrolitycznym utlenianiem, to bezpośrednio po niej zachodzi proces odwrotny, czyli redukcja (BA). Pozwala to na badanie losów substancji B bezpośrednio po jej powstaniu, a zatem śledzić można zarówno przyłączanie, bądź utratę elektronów, jak również kinetykę reakcji elektrodowej. W podstawowej formie woltamperometria cykliczna opiera się na przykładaniu trójkątnego napięcia do dwóch elektrod zanurzonych w roztworze zawierającym badany analit oraz elektrolit podstawowy. Warto zastrzec, iż pomimo cykliczności obu reakcji redoks i ich bezpośrednim przechodzeniu jedna w drugą, zwykle warunki końcowe różnią się od początkowych kolejne krzywe woltamerometryczne (Rys. 2) nieznacznie różnią się od siebie. Związane jest to faktem, że produkt może ulegać dalszym przekształceniom chemicznym lub elektrochemicznym, czy też elektroaktywnością produktów ubocznych reakcji B. 3
Rys. 2. Woltamperogram sygnał analityczny uzyskany techniką woltamperometrii cyklicznej, Ep a, Ep k wartości potencjałów dla pików odpowiednio anodowego utleniania, oraz katodowej redukcji, Ip a, Ip k wartości prądów analogiczne jak dla potencjałów. Duża część reakcji elektrodowych nie jest natychmiast i całkowicie odwracalna miarą odwracalności procesu jest różnica między potencjałem piku anodowego a potencjałem piku katodowego. Dla układu całkowicie odwracalnego, w temperaturze 25 o C, różnica ta powinna wynosić: 0,058 E pa E pk [ V ] (1) n n - liczba elektronów biorących udział w reakcji elektrodowej. Z powyższego równania wynika, że różnica ta maleje wraz ze wzrostem liczby elektronów przenoszonych na rozważanym etapie reakcji elektrodowej. Dla procesów odwracalnych maksymalne natężenie prądu można wyrazić równaniem Randlesa - Ševčika: nvfd i p 0, 4463n F c A (2) RT gdzie: 0,4463 bezwymiarowy współczynnik liczbowy, n ilość elektronów biorących udział w reakcji elektrodowej, F stała Faraday a; F = 96485 [C/ mol], R stała gazowa; R = 8,3145 [J/ mol K], T temperatura [K], A pole powierzchni elektrody pracującej [cm 2 ], D współczynnik dyfuzji depolaryzatora [cm 2 /s], c stężenie depolaryzatora [mol/cm 3 ], v szybkość przemiatania potencjałem [V/s] W temperaturze pokojowej (T = 298K) równanie przyjmuje prostszą postać: 4
i p 2 2 2 1/ 26900n 3/ AD 1/ v c (3) Paracetamol Paracetamol (N-acetylo-4-aminofenol, 4-hydroksyacetanilid, acetaminofen) to aktywny metabolit fenacetyny charakteryzujący się działaniem przeciwgorączkowym oraz przeciwbólowym, jednakże w odróżnieniu od leków z grupy niesteroidowych leków przeciwzapalnych nie wykazuje właściwości przeciwzapalnych. Działanie paracetamolu związane jest z hamowaniem syntezy prostaglandyn w ośrodkowym układzie nerwowym poprzez blokowanie cyklooksygenazy kwasu arachidonowego. Po podaniu doustnym, szybko osiąga stężenie maksymalne (po ok. 1h) i w całości wchłaniany jest z przewodu pokarmowego. Mechanizm metaboliczny zachodzi w wątrobie, a jego produktami są: w wyniku sprzęgania glukoronid (ok. 55%) oraz siarczan (ok. 40%), w wyniku katalizowanej cytochromem P-450 N-oksydacji (przy nie dość wydajnej reakcji sprzęgania) p-n-acetyloimino-benzochinon (związek o wysokiej reaktywności, w wyniku jego dużego nagromadzenia może dojść do nekrozy komórek wątrobowych, stąd ostrzeżenia o hepatotoksycznym działaniu leku). H NH CH 3 Cytochrom P 450 Glukuronid Siarczan N CH 3 p-n-acetyloimino-benzochinon Zalecana pojedyncza dawka dla dorosłych wynosi 500-1000mg, z kolei dla dzieci dawka dobowa nie powinna być wyższa niż 50mg paracetamolu/kg masy ciała. Trzyczterokrotne przekroczenie dawki dobowej (ok. 10 g czystej substancji) może doprowadzić do nieodwracalnych zmian wątrobowych, a przy braku interwencji medycznej (podanie antidotum acetylocysteiny) nawet doprowadzić do zgonu. W przypadku osób z uszkodzoną wątrobą głodzonych lub nadużywających alkohol objawy silnego zatrucia mogą wystąpić już przy dawce 6 g! bjawami zatrucia paracetamolem są: biegunka, nudności, wymioty, bóle brzucha, nadmierna potliwość oraz żółtaczka. Mogą one wystąpić po 2-4 dni po spożyciu zwiększonej dawki leku. kres półtrwania w osoczu wynosi 2-4 godzin. Paracetamol jako lek przeciwgorączkowy występuje w wielu lekach stosowanych powszechnie w stanach grypowych i przeziębieniach: preparatach prostych Anadin, Apap, Benuron (syrop), Calpol, Efferalgan, Paracemol (syrop), Paracetamol (syrop), Scanol czy Tamazol, oraz złożonych Anticol, Coldrex, Fervex, Panadol Extra, Saridon. W trakcie ćwiczenia paracetamol oznaczany będzie w syropach. Syrop to płynna postać leku przeznaczona do podawania doustnego, w postaci przezroczystego, stężonego roztworu najczęściej sacharozy lub alkoholi wielowodorotlenowych, rozpuszczonych w wodzie, wyciągach roślinnych, sokach owoców. Bardzo często syropy zawierają substancje pomocnicze, takie jak: środki konserwujące, przeciwutleniacze, czy substancje poprawiające 5
smak, zapach i zabarwienie. Istotnym jest, aby substancje te w zastosowanych ilościach nie wykazywały własnego działania farmakologicznego, nie powodowały zmiany trwałości leku oraz dostępności biologicznej substancji leczniczej. Zasada oznaczenia acetaminofenu techniką woltamperometrii cyklicznej opiera się na utlenieniu leku do uwodnionej N-acetylo-4- benzoiminy (cały proces odbywa się w kilku etapach, w czasie których następuje m.in. utrata dwóch protonów oraz przyłączenie cząsteczki wody). paracetamol NH CH 3 + H 2 H NH CH 3 + 2H + + 2e - H Proces redukcji nie zachodzi w tak łatwy jak można by się spodziewać sposób, dlatego też dla stosowanych prędkości przemiatania nie obserwuje się piku redukcji. Sytuacja taka związana jest z nieaktywną elektrochemicznie uwodnioną benzoiminą. Kalibrację przeprowadza się na podstawie prądu piku anodowego, który jest wprost proporcjonalny do stężenia wzorca w roztworze. ZAGADNIENIA D KLKWIUM 1. Podaj główną różnicę pomiędzy polarografią a woltamperometrią. 2. do 4. Wymień techniki woltamperometryczne i krótko omów (wraz z krzywymi rejestrowanymi dla poszczególnych technik) dwie techniki podane przez prowadzącego. 5. Wytłumacz na czym opiera się wykorzystanie woltamperometrii cyklicznej w pomiarach analitycznych (analiza jakościowa oraz ilościowa). 6. mów konstrukcję typowego trójelektrodowego naczyńka pomiarowego służącego do oznaczeń woltamperometrycznych. 7. Wyjaśnij pojęcia: prąd dyfuzyjny, nadnapięcie, polaryzowalność elektrody, prąd migracyjny. 8. Wyjaśnij znaczenie równania Randlesa Ševčika wraz z omówieniem wielkości w nim występujących i ich jednostek. 9. Scharakteryzuj paracetamol jako lek powszechnie stosowany w życiu codziennym, jakie są jego zalety, oraz jakie są zagrożenia związane ze stosowaniem leku. 10. Przedstaw obliczenia pozwalające wyznaczyć objętość roztworu wzorcowego V 1 [ml] o zadanym stężeniu c 1 [g/l] jaką należy odpipetować do kolby miarowej à V 2 [ml], aby uzyskać stężenie c 2 [M] zadanie przykładowe, proszę zwrócić uwagę na jednostki! 11. Przedstaw niezbędne obliczenia pozwalające wyznaczyć stężenie roztworu roboczego, powstałego przez odpipetownie objętości V 1 [ml] roztworu wzorcowego o stężeniu c 1 [mol/dm 3 ] do kolby miarowej o objętości V 2 [L] zadanie przykładowe, proszę zwrócić uwagę na jednostki! 12. W temperaturze 25 o C przy prędkości przemiatania równej 100 mv/s zmierzono wysokość piku anodowego H 1 dla roztworu o stężeniu c 1. Następnie dokonano kolejnego pomiaru wysokości H 2 dla stężenia c 2 w tych samych warunkach 6
doświadczalnych co poprzednio. Wyznacz stężenie c 2 dla tak zarejestrowanego sygnału zadanie przykładowe. LITERATURA BWIĄZKWA 1. W. Kubiak, J. Gołaś, Instrumentalne metody analizy chemicznej, Wyd. Akapit, Kraków 2005, Skrypt AGH, rozdział: Woltamperometria, 139-158. 2. A. Cygański, Podstawy metod elektroanalitycznych, WNT, Warszawa 1999, rozdziały: Wiadomości podstawowe z polarografii (5.1, s.331-354), Woltamperometria (5.7, s.415-435). 3. G.W. Ewing, Metody instrumentalne w analizie chemicznej, PWN, Warszawa 1980, wybrane zagadnienia z rozdziałów 13 oraz 15 (str. 256-265, 283-289, 302-303). LITERATURA UZUPEŁNIAJĄCA 1. W. Szczepaniak, Metody instrumentalne w analizie chemicznej, PWN, Warszawa 2004, rozdział: Polarografia. Woltamperometria (11, s.211 238). 2. Z. Galus, Teoretyczne podstawy elektroanalizy chemiczne, PWN, Warszawa 1977, wybrane fragmenty dotyczące woltamperometrii (chronowoltamperometrii), (str. 41-46, 207-214, 373-378). 3. Materiały dydaktyczne Wydziału Chemii Politechniki Gdańskiej Elektrochemia: http://www.pg.gda.pl/chem/dydaktyka/analityczna/. CEL ĆWICZENIA CZĘŚĆ DŚWIADCZALNA Celem ćwiczenia jest zapoznanie się z techniką woltamperometrii cyklicznej oraz oznaczenie paracetamolu w wybranym preparacie farmaceutycznym PRZYRZĄDY, NACZYNIA I DCZYNNIKI roztwór wzorcowy paracetamolu 35 mmol/l, bufor cytrynianowy ph=2,2, preparat farmaceutyczny (syrop) Analizator Elektrochemiczny M161, (MTM ANK, Polska) kolbki miarowe o pojemności 50 ml naczyńka pomiarowe pipeta automatyczna o pojemności 5 ml pipeta szklana z podziałką o pojemności 5 ml SPSÓB WYKNANIA Przygotowanie roztworów i wykonanie pomiarów 1. Sporządzić serię roztworów roboczych w kolbkach o pojemności 50 ml poprzez odpipetowanie odpowiednich ilości wzorca o stężeniu 35 mmol/l i uzupełnienie buforem cytrynianowym do kreski. 7
Pipetowana objętość [ml] 5 10 15 20 25 Stężenie [mmol/l] 2. Przygotować badany roztwór syropu w kolbce miarowej o pojemności 50 ml poprzez odpipetowanie 5 ml preparatu wyjściowego (syropu) i uzupełnienie buforem do kreski. 3. Dokonać pomiaru linii bazowej dla buforu w warunkach podanych przez asystenta. 4. Wykonać pomiary wzorców w kolejności wzrastających stężeń (dla każdego wzorca wykonać trzy powtórzenia, pamiętając o wymieszaniu roztworu przed każdym pomiarem) w warunkach doświadczalnych podanych przez asystenta techniką woltamerometrii cyklicznej. 5. Przeprowadzić analizę przygotowanego roztworu syropu wykonując 10 powtórzeń. PRACWANIE WYNIKÓW pracowanie wyników należy przedstawić w formie raportu z uwzględnieniem: 1. Celu ćwiczenia, opisu wykonanych eksperymentów, 2. Wyznaczenia natężenia pików anodowych na podstawie zarejestrowanych krzywych dla poszczególnych wzorców oraz sygnału dla próbki, w tym celu należy: 2.1. Narysować styczną do prostoliniowego odcinka gałęzi utlenienia (prądu dyfuzyjnego), 2.2. Maksimum piku anodowego zrzutować na oś odciętych, 2.3. Różnica wartości prądów pomiędzy przecięciem się stycznej i zrzutowanej wartości maximum a wartością maksimum wyznacza wartość i p, 3. Zestawienia wyników doświadczalnych w postaci tabeli, 4. Wykreślenia krzywej kalibracyjnej wraz z wyznaczeniem błędów dopasowania krzywej (błędów oszacowania parametrów a i b), 5. Wyliczenia rzeczywistego stężenia acetaminofenu w próbce syropu, 6. Wyjaśnienia spadku stężenia paracetamolu w analizowanej próbce, 7. Dyskusji wyników i podsumowania zastosowanej techniki analitycznej, 8. pracowania zagadnienia naukowego. 8