Clinical Medicine Experimental Medicine Management

WWW.MEDICALPROBLEMS.EU VOLUME 50, NR 3-4/ DECEMBER 2014 MedicalPROBLEMS JOURNAL OF EXPERIMENTAL AND CLINICAL MEDICINE ISSN 0478-3824 What do Hollywood and Pancreatic Cancer have in common? JUBILEE 2014 Clinical Medicine Experimental Medicine Management Peer-reviewed articles about the latest developments in medicine, healthcare, ethics and clinical leadership, released by the Central Clinical Hospital of the Ministry of the Interior in Warsaw. Academic biomedical research papers to support clinical practice and help develop diagnostic and therapeutic methods and techniques, released by the Polish Academy of Sciences. Public and private sector managers address today s challenges and offer insights into best practice and how to achieve effective governance and operational improvements in the healthcare sector. CENTRAL CLINICAL HOSPITAL OF THE MINISTRY OF THE INTERIOR, WARSAW

III Konferencja Naukowo-Szkoleniowa Fundacji przy Centralnym Szpitalu Klinicznym MSW NOWOTWORY GÓRNEGO ODCINKA UKŁADU POKARMOWEGO 16 kwietnia 2015 r. Sala wykładowa Szpitala MSW w Warszawie, ul. Wołoska 137 LECZENIE WIELOSPECJALISTYCZNE NOWOTWORÓW GÓRNEGO ODCINKA UKŁADU POKARMOWEGO Warunki uczestnictwa: Uczestnictwo bezpłatne Kierownictwo naukowe i prowadzenie: Prof. dr hab. med. Marek DURLIK Prof. dr hab. med. Andrzej W. SZAWŁOWSKI PROGRAM RAMOWY Godz. 09.00-09.45 Rejestracja uczestników Godz. 09.45-10.00 Powitanie uczestników: Prof. dr hab. med. Marek DURLIK Prof. dr hab. med. Andrzej W. SZAWŁOWSKI SESJA I Godz. 10.00-10.20 Wykład wprowadzający: Nowotwory górnego odcinka układu pokarmowego: Problem chirurgiczny czy onkologiczny? Prof. dr hab. med. Andrzej W. SZAWŁOWSKI (Centrum Onkologii, Warszawa) Godz. 10.20-10.40 Powikłania onkologiczne po chirurgicznym leczeniu nowotworów górnego odcinka układu pokarmowego uzasadnienie leczenia skojarzonego Dr hab. med. Zoran STOJCEV (Wojewódzki Szpital Specjalistyczny, Słupsk) Godz. 10.40-11.00 Rola i miejsce radioterapii w leczeniu skojarzonym nowotworów górnego odcinka układu pokarmowego Prof. dr hab. med. Lucyna KĘPKA (Warmińsko-Mazurski Uniwersytet Medyczny, Olsztyn) Godz. 11.00-11.20 Zastosowanie brachyterapii w leczeniu nowotworów górnego odcinka układu pokarmowego Dr med. Jarosław ŁYCZEK (Podkarpackie Centrum Onkologii, Brzozów)

Godz. 11.20-11.40 Rola i miejsce chemioterapii w leczeniu skojarzonym nowotworów górnego odcinka układu pokarmowego Prof. dr hab. med. Andrzej DEPTAŁA (Szpital MSW, Warszawa) Godz. 11.40-12.00 PRZERWA NA KAWĘ SESJA II Godz. 12.00-12.20 Wyniki ogólnopolskiego programu skojarzonego leczenia płaskona błonkowego raka piersiowego odcinka przełyku Prof. dr hab. med. Grzegorz WALLNER (Lubelski Uniwersytet Medyczny, Lublin) Godz. 12.20-12.40 Spojrzenie z perspektywy czasu na wyniki ogólnopolskiego programu skojarzonego leczenia raka żoładka Prof. dr hab. med. Jan KULIG lub Tadeusz POPIELA (Uniwersytet Jagielloński, Kraków) Godz. 12.40-13.00 Jak zapewnić maksymalny chirurgiczny radykalizm w leczeniu raka trzustki Prof. dr hab. med. Marek DURLIK (Szpital MSW, Warszawa) Godz. 13.00-13.20 Możliwości chirurgii po skojarzonym leczeniu nowotworów wątroby Prof. dr hab. med. Krzysztof ZIENIEWICZ (Warszawski Uniwersytet Medyczny, Warszawa) godz. 13.20-14.00 PRZERWA NA LUNCH SESJA III Godz. 14.00-14.20 Monitorowanie leczenia skojarzonego nowotworów górnego odcinka układu pokarmowego rola endoskopii Prof. dr hab. med. Grażyna RYDZEWSKA (Szpital MSW, Warszawa) Godz. 14.20-14.40 Monitorowanie leczenia skojarzonego nowotworów górnego odcinka układu pokarmowego przy pomocy badan obrazowych Prof. dr hab. med. Jerzy WALECKI (Szpital MSW, Warszawa) Godz. 14.40-15.00 Ocena patomorfologiczna leczenia skojarzonego nowotworów górnego odcinka układu pokarmowego Prof. dr hab. med. Anna NASIEROWSKA-GUTTMEJER (Szpital MSW, Warszawa) Godz. 15.00 Zakończenie Sympozjum Losowanie wśród zarejestrowanych uczestników Sympozjum 5-ciu egzemplarzy podręcznika Powikłania chirurgii onkologicznej: Występowanie Leczenie pod redakcją Prof Andrzeja W. Szawłowskiego (Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa, 2014 r.) Zapisy: e-mail: dyrekcja@cskmswia.pl, fundacja@cskmswia.pl, tel. 22 508-10-29

prof. dr hab. n. med. Andrzej Lipkowski Ponieśliśmy wielką stratę. W dniu 27 listopada niespodziewanie, odszedł od nas prof. dr hab. n. med. Andrzej Lipkowski, Dyrektor Instytutu Medycyny Doświadczalnej i Klinicznej, im. M. Mossakowskiego, PAN. Był wyjątkowym człowiekiem i wielkim uczonym. Jednym z najwybitniejszych w świecie autorytetów w dziedzinie chemii, biologii i farmakologii neuropeptydów i ich pochodnych. Poprzez pryzmat działania cząstek chemicznych widział całego człowieka. Jego naukowe pomysły, często genialne w swojej prostocie, powodowały, że śmiało można go nazwać Wielkim Wizjonerem. Jego dorobek wystarczyłby na kilka wyśmienitych życiorysów naukowych. Opublikował 225 prac oryginalnych oraz 32 monografii lub rozdziałów w podręcznikach, o łącznym współczynniku oddziaływania 360. Jego prace należą do najczęściej cytowanych polskich prac biomedycznych (tylko w latach 1994-2013 liczba cytowań wynosiła 2728). Jego nieprzeciętny dorobek zamyka się Indexem Hirsha = 27, co świadczy olbrzymim oddziaływaniu Jego działalności na społeczność naukową. Zainteresowania naukowe prof. Andrzeja Lipkowskiego koncentrowały się głównie na zależności aktywności biologicznej od struktury, zwłaszcza w przewodzeniu i percepcji bólu. Był pionierem poszukiwań nowych substancji i metod zwalczania przewlekłego bólu oraz wprowadzania nowoczesnych metod podawania leków do miejsca ich oczekiwanego działania. Do Jego największych sukcesów należało między innymi otrzymanie peptydu bifaliny, leku wielokrotnie silniejszego od morfiny, o znacznie ograniczonym efekcie wywoływania tolerancji. We współpracy z Kyoto University zidentyfikował i zbadał szereg fizjologicznie aktywnych peptydów białek roślinnych, w tym regulujących ciśnienie krwi. Jego prace nad białkami naturalnymi zaowocowały również opracowaniem oryginalnych białkowych szkieletów (scaffolds) do trójwymiarowej hodowli komórek, w tym komórek macierzystych. Współpracował między innymi z University of Minnesota, oraz Massachusetts General Hospital, Harvad Medical School. Był mistrzem w prowadzeniu badań interdyscyplinarnych i współpracy z lekarzami na oddziałach nowotworowych i leczenia oparzeń. Posiadał wyjątkową zdolność wyprowadzenia wyników prac podstawowych do etapu badań wdrożeniowych. Zaowocowało to opracowaniem ponad 50 wniosków patentowych, które mogą stać się podstawą do produkcji nowych leków. Równocześnie prof. Andrzej Lipkowski był wyśmienitym organizatorem nauki, posiadał unikalne zdolności współpracowania z licznymi ośrodkami badawczymi w kraju i za granicą, upowszechniania osiągnięć wśród firm biotechnologicznych oraz kierowania dużymi zespołami badawczymi. Aktywność Profesora Lipkowskiego na tym polu zaowocowała stworzeniem trzech tzw. klastrów powiązań kooperacyjnych (Mazowiecki Klaster Peptydowy, Klaster Leczenia Bólu oraz ALICE-MED ), na których tworzenie i rozwój uzyskał 4-krotnie finansowanie z Europejskiego Funduszu Rozwoju Regionalnego w ramach Regionalnego Programu Operacyjnego woj. Mazowieckiego. Profesor Andrzej Lipkowski był również kierownikiem wielu projektów badawczych przyznawanych przez KBN, a następnie MNiSzW i NCN oraz koordynatorem projektu integrującego prace jedenastu zespołów z sześciu krajów, tworzącego międzynarodowe konsorcjum badawcze realizujące grant europejski STREP w ramach 6 Programu Ramowego, mający na celu opracowanie nowych generacji leków przeciwbólowych w leczeniu bólów nowotworowych ( Development of new therapeutic substances and strategies for treatment of pain in patients with advanced stages of cancer ). W obrębie Instytutu Medycyny Doświadczalnej i Klinicznej im. M. Mossakowskiego PAN, utworzył Zakład Nauropeptydów. Od 2010 r był Dyrektorem tego Instytutu. Za swoją działalność uhonorowany został licznymi nagrodami naukowymi, w tym nagrody Prezesa Rady Ministrów oraz odznaczeniami państwowymi i międzynarodowymi. n Pozostawił nas w wielkim bólu. Zespół redakcji Medical Problems 4 VOLUME 50, NR 3-4

From the Editor JUBILEE 2014 Editor-in-chief Marek Durlik, Warsaw dr hab. n. med. Marek Durlik prof. PAN Director Central Clinical Hospital of the Ministry of the Interior, Warsaw Previously I reminisced about the changes that we ve witnessed during the 60-year history of our journal the conflicts and regime changes; medical breakthroughs and cultural revolutions; even sporting triumphs. And now change is in the air again. Since our last issue, Poland has gained a new Prime Minister, while her predecessor will become President of the European Council on the 1st of December. Indeed, I too have a new Minister now! Sadly, international conflict is too close for comfort once again, while on a brighter note; volleyball has become our national sport, with our men s team winning the world championship in September. But they weren t the only ones to take the world by storm. The world watched in amazement as a Polish team led by Dr Pawel Tabakow, from Wroclaw Medical University, gave paralysis victim, Darek Fidyka, the ability walk again. It was a great example of pan-european collaboration, using a technique discovered by Professor Geoffrey Raisman and his team, at the University College London s institute of neurology. Here at our own hospital in Warsaw, I am proud to say we also performed a couple of Polish firsts firstly, a pancreas transplantation in a patient, who had previously undergone a total pancreatectomy; and secondly, a minimally invasive laparoscopic live donor nephrectomy using 3D imaging. However, I am perhaps most excited by the prospect for change in the area of cancer treatment. The Polish Government has given priority to this perennial problem, and oncology appeared on the agenda at the annual Economic Forum in Krynica-Zdrój the so-called Polish Davos. Reason enough to celebrate, you might say. So imagine my joy at witnessing the first World Pancreatic Cancer Day last week (on the 13th of November to be precise)! Given my field of work, it should come as no surprise to learn that I am a great advocate for the need to increase awareness of what remains one of the most virulent cancers today. As I write this, I take great comfort in knowing that Pancreatic Cancer Awareness Month is continuing in the UK. I can only hope that this trend will extend across Europe and the rest of the world in years to come. Who knows? Perhaps our own modest contribution through this journal can help get the message across. n Deputy Editors Andrzej Lipkowski, Warsaw Irena Walecka, Warsaw Editor (English) Jansson Antmann Associate Editors Jarosław Buczek Magdalena Lewandowska Małgorzata Machaj Adam J. Sybilski Editorial board Piotr Andziak, Warsaw Maria Barcikowska, Warsaw Anna Czarnoba, Warsaw Andrzej Deptała, Warsaw Paweł Dobrzyński, Warsaw Marek Durlik, Warsaw Andrzej M. Fal, Warsaw Edward Franek, Warsaw Krzysztof Filczak, Warsaw Andrzej Gietka, Warsaw Robert Gil, Warsaw Stanisław Głuszek, Kielce Artur Jakimiuk, Warsaw Bogusław Kostkiewicz, Warsaw Dariusz Kosior, Warsaw Ireneusz Kotela, Warsaw Anna Nasierowska-Gutmajer, Warsaw Wojciech Rogowski, Warsaw Lidia Rudnicka, Warsaw Grażyna Rydzewska, Warsaw Andrzej Rydzewski, Warsaw Joanna Sempińska-Szewczyk, Warsaw Kazimierz Suwalski, Warsaw Piotr Suwalski, Warsaw Adam J. Sybilski, Warsaw Irena Walecka, Warsaw Jerzy Walecki, Warsaw Małgorzata Wisłowska, Warsaw Address CSK MSW 02-507 Warszawa, 137 Wołoska St. tel. +48 22 508 12 20; fax +48 22 845 14 68 E-mail: redakcja@problemylekarskie.pl www.medicalproblems.eu Publisher Central Clinical Hospital of the Ministry of the Interior Mossakowski Medical Research Centre, Polish Academy of Sciences VOLUME 50, NR 3-4 5

Clinical Medicine 8 HISTORIA I ASPEKTY TECHNICZNE ŁAŃCUCHOWEJ REAKCJI POLIMERAZY (PCR) Paulina Gil-Kulik, Agnieszka Wojcieszek, Mateusz Wiliński, Małgorzata Filas, Piotr Chomik, Marcin Czop, Natalia Bilska, Justyna Piróg, Jolanta Karwat, Lidia Kotuła, Alicja Niedojadło, Elżbieta Radzikowska, Irena Walecka, Justyna Łyczkowska-Piotrowska, Janusz Kocki 15 A NEW HOPE FOR PANCREATIC CANCER PATIENTS IN LARGE SURGICAL CRITERIA (BORDERLINE PANCREATIC TUMORS) Marek Durlik, Magdalena Derejska 18 PLOIDY AND DNA INDEX AS PROGNOSTIC FACTORS IN RESECTED PANCREATIC DUCTAL ADENOCARCINOMA A REVIEW OF THE LITERATURE Julia Tuchalska-Czuroń, Marek Durlik 22 ACUTE LARYNGITIS IN CHILDREN A RISK OF ACUTE UPPER AIRWAY OBSTRUCTION Krzysztof Ślączka, Lidia Zawadzka-Głos, Paweł Dobrzyński Diagnostyka dysfunkcji stawów krzyżowo- -biodrowych 27 BRODAWCZAKI KRTANI U DZIECI MOŻLIWOŚCI LECZENIA Magdalena Frąckiewicz, Paweł Dobrzyński 30 DIAGNOSTYKA DYSFUNKCJI STAWÓW KRZYŻOWO-BIODROWYCH Danuta Kolońska, Paweł Ruszczuk, Zbigniew Czernicki, Mariusz Głowacki 35 THE COEXISTENCE OF CELIAC DISEASE AND RHEUMATIC DISEASES IN THE EXAMPLE OF CASES HOSPITALIZED IN THE DEPARTMENT OF INTERNAL MEDICINE AND RHEUMATOLOGY AT THE CENTRAL CLINICAL HOSPITAL MINISTRY OF INTERIOR AFFAIRS Justyna Łyczkowska-Piotrowska, Małgorzata Wisłowska, Krzysztof Kanecki 6 VOLUME 50, NR 3-4

39 WSPÓŁISTNIENIE CELIAKII I CHORÓB REUMATYCZNYCH NA PRZYKŁADZIE PRZYPADKÓW HOSPITALIZOWANYCH W KLINICE CHORÓB WEWNĘTRZNYCH I REUMATOLOGII CSK MSWIA Justyna Łyczkowska-Piotrowska, Małgorzata Wisłowska, Krzysztof Kanecki 43 WSTĘPNA ANALIZA OBRAZU KLINICZNEGO PACJENTÓW Z CHOROBĄ ZWYRODNIENIOWĄ STRUKTUR KRĘGOSŁUPA W ZALEŻNOŚCI OD RODZAJU ORAZ STOPNIA ZAAWANSOWANIA ZMIAN W OBRAZIE REZONANSU MAGNETYCZNEGO (MRI) Dariusz Lachman 50 ŚRÓDOPERACYJNIE STWIERDZONY GIGANTYCZNY ROPIEŃ OKOŁOZASTAWKOWY U PACJENTKI Z PODEJRZENIEM ŚLUZAKA LEWEGO PRZEDSIONKA LECZONEJ Z ZASTOSOWANIEM WEWNĄTRZSERCOWYM GĄBKI GERAMYCYNOWEJ. OPIS PRZYPADKU Jakub Staromłyński, Radosław Smoczyński, Anna Witkowska, Dariusz Wojciechowski, Piotr Suwalski 53 STAN OŚRODKÓW ONKOLOGICZNYCH W POLSCE Agnieszka Sopel 57 SYSTEMY ZARZĄDZANIA APARATURĄ MEDYCZNĄ Agnieszka Sopel Management The Stars Align In The Fight Against Pancreatic Cancer 62 THE STARS ALIGN IN THE FIGHT AGAINST PANCREATIC CANCER Jansson Antmann 66 PARALLEL TRADE IS THE ENGINE OF GROWTH OF THE PHARMACEUTICAL MARKET Jansson Antmann VOLUME 50, NR 3-4 7

Clinical Medicine HISTORIA I ASPEKTY TECHNICZNE ŁAŃCUCHOWEJ REAKCJI POLIMERAZY (PCR) PAULINA GIL-KULIK 1, AGNIESZKA WOJCIESZEK 1, MATEUSZ WILIŃSKI 1, MAŁGORZATA FILAS 1, PIOTR CHOMIK 1, MARCIN CZOP 1, NATALIA BILSKA 1, JUSTYNA PIRÓG 1, JOLANTA KARWAT 1, LIDIA KOTUŁA 1, ALICJA NIEDOJADŁO 1, ELŻBIETA RADZIKOWSKA 2, IRENA WALECKA3, JUSTYNA ŁYCZKOWSKA-PIOTROWSKA 4, JANUSZ KOCKI 1 1. Zakład Genetyki Klinicznej, Uniwersytet Medyczny w Lublinie 2. Oddział Chirurgii Plastycznej, Centralny Szpital Kliniczny Ministerstwa Spraw Wewnętrznych w Warszawie 3. Klinika Dermatologii, Centralny Szpital Kliniczny Ministerstwa Spraw Wewnętrznych w Warszawie 4. Oddział Obserwacyjny, Centralny Szpital Kliniczny Ministerstwa Spraw Wewnętrznych w Warszawie Zatwierdzono do druku 12 grudnia 2014 Medical Problems 2014, Vol.: 50, nr 3-4, s. 8-14 Adres do korespondencji: Janusz Kocki, Zakład Genetyki Klinicznej, Uniwersytet Medyczny w Lublinie ul. Radziwiłłowska 11, 20-080 Lublin, e-mail: janusz.kocki@tlen.pl tel: +48 81 5288408 Streszczenie: Łańcuchowa reakcja polimerazy polega na amplifikacji in vitro wybranych fragmentów kwasów nukleinowych, które można następnie poddać analizie. Została wynaleziona w 1983 roku przez Kary ego Mullisa, za co został uhonorowany Nagrodą Nobla. Od tego czasu obserwuje się ciągłe udoskonalanie tej techniki oraz poszukiwanie nowych rozwiązań technologicznych i diagnostycznych, co pozwala na dokonywanie nowych odkryć w naukach medycznych i biologicznych. Liczne jej modyfikacje takie jak RT-PCR, multiplex-pcr, real-time PCR czy MLPA znalazły szerokie zastosowanie m.in. w badaniach genetycznych, onkologii, mikrobiologii, wirusologii, kryminalistyce oraz w badaniach naukowych, umożliwiając przyspieszenie diagnostyki, a także ograniczenie kosztów i ilości materiału potrzebnego do przeprowadzenia badania. Słowa kluczowe: łańcuchowa reakcja polimerazy, RT-PCR, multiplex-pcr, real-time PCR, MLPA czyli łańcuchowa reakcja polimerazy (ang. polymerase chain reaction) to najpopularniej- PCR sza metoda analizy kwasów nukleinowych wykorzystywana w diagnostyce. Technika ta umożliwia szybką amplifikację badanego odcinka DNA i określenie jego długości. Znalazła również zastosowanie w poszukiwaniu określonej sekwencji w badanym materiale, a także w sekwencjonowaniu i klonowaniu materiału genetycznego. W metodzie tej matrycą staje się materiał, który został powielony w poprzednim cyklu reakcyjnym, co skutkuje lawinowym tempem powstawania produktu. Do wykonania badania wykorzystuje się nawet pojedynczą cząsteczkę DNA. Łańcuchowa reakcja polimerazy jako podstawowe narzędzie biologii molekularnej wciąż ulega licznym modyfikacjom, co pozwala na dokonywanie nowych odkryć w naukach medycznych i biologicznych [1]. Powszechnie uważa się, że odkrywcą tej rewolucyjnej techniki jest Kary Mullis, jednak pierwsze enzymatyczne namnażanie krótkich fragmentów oligonukleotydowych zostało opisane i potwierdzone doświadczalnie na łamach czasopisma Journal of Molecular Biotechnology już w 1971 roku przez zespół składający się z Kleppe i jego współpracowników. Niestety wyniki ich badań nie zostały docenione przez środowisko naukowców. Do przełomu doszło w roku 1983, kiedy to Kary Mullis udowodnił, że poprzez użycie nieskomplikowanych substratów i polimerazy DNA możliwe jest uzyskanie milionów kopii DNA o pożądanej sekwencji w relatywnie krótkim czasie. Za swoje osiągnięcia został uhonorowany Nagrodą Nobla w dziedzinie chemii w roku 1993. Do historii również przeszła wysokość kwoty, którą zapłaciła za patent firma Hoffmann La Roche kalifornijskiej korporacji Cetus, wynosząca 300 mln dolarów [2]. Technika PCR zasada metody Technika PCR jest metodą pozwalającą na amplifikację In vitro wybranych cząsteczek DNA i RNA przepisanych na cdna poprzez zastosowanie dwóch par starterów komplementarnych do sekwencji docelowej. Użyta do reakcji matryca nie może być zdegradowana i zanieczyszczona białkami i inhibitorami enzymów Kluczowym elementem umożliwiającym namnażanie pożądanego odcinka DNA 8 VOLUME 50, NR 3-4

spośród miliardów par zasad jest dobór krótkich oligonukleotydowych odcinków ograniczających długość syntetyzowanego fragmentu DNA. Powinny się one charakteryzować wysoką specyficznością do analizowanej sekwencji oraz składać się z 18 do 28 par zasad, z czego 50% przypada na parę GC. W celu zapobiegania tworzenia struktur primer-dimer lub hairpin, niezmiernie ważne jest stosowanie starterów nie posiadających w 3 końcowej części fragmentów komplementarnych do siebie samych i do drugiego startera. Początkowo metoda ta nie była doskonała, ze względu na konieczność dodawania w każdym kolejnym cyklu porcji enzymu, jakim jest polimeraza pozyskiwana z E. coli, ulegającej zniszczeniu w trakcie denaturacji DNA. Problem ten został rozwiązany w 1987 roku, kiedy to po raz pierwszy użyto polimerazy termostabilnej wyizolowanej z bakterii żyjącej w gorących źródłach wulkanicznych Thermophilus aquaticus. Umożliwia to przeprowadzenia reakcji bez konieczności otwierania probówki w czasie 30-40 cykli, ponieważ polimeraza Taq jest odporna na ogrzewanie nawet do 96 C w trakcie rozplecenia helisy DNA. Prawidłowe jej działanie zapewnia przeprowadzenie reakcji w środowisku buforu o ph = 8.3-8.8 zawierającym jony magnezu. Zasadniczym elementem mieszaniny reakcyjnej są trifosforanydeoksyrybonukleozydów: datp, dctp,dttp, dgtp, dodawane w jednakowych stężeniach do roztworu. Brak jakiegokolwiek składnika sprawia, że przebieg reakcji jest niemożliwy [1]. W celu przeprowadzenia reakcji PCR niezbędnym narzędziem jest posiadanie termocyklera na wyposażeniu laboratorium badawczego. Termocykler zapewnia zmiany temperatury bloku grzejnego według zdefiniowanego programu, odpowiedniego do planowanej PCR. Blok grzejny wyposażony jest w tzw. moduł Peltiera co umożliwia szybkie zmiany temperatury środowiska reakcji. Niektóre termocyklery chłodzone były wodą lub powietrzem. Współczesne termocyklery posiadają ogrzewaną pokrywę, co zapobiega skraplaniu buforu reakcji i zmiany stężenia buforu w jej środowisku. Ta techniczna modyfikacja wyeliminowała historycznie stosowany olej mineralny, przykrywający bufor reakcji w probówce, który zmniejszał parowanie. Przebieg analizy należy rozpocząć od przygotowania mieszaniny reakcyjnej, którą następnie umieszcza się w wyżej wspomnianym urządzeniu, które umożliwia cykliczne zmiany temperatury w trakcie badania. Pierwszym etapem jest podgrzanie próbki do temperatury 95 C w celu rozplecenia dwuniciowej cząsteczki DNA poprzez pęknięcie wiązań wodorowych. Następnie dochodzi do hybrydyzacji odcinków starterowych, polegającej na utworzeniu odcinków dwuniciowych zbudowanych z wcześniej zaprojektowanych starterów i matrycowych cząsteczek DNA. Etap ten zwany z ang. Annealing, wymaga obniżenia temperatury reakcji charakterystycznej dla użytej pary starterów 50-65 C. W celu zapobiegania tworzenia się hybryd zbudowanych z połączonych ze sobą dwóch nici matrycy, primery są dodawane w nadmiarze w stosunku do matrycy. Właściwa synteza DNA zachodzi w fazie określanej jako elongacja, w czasie której dochodzi do podgrzania mieszaniny reakcyjnej do optymalnej temperatury, w której najlepiej działa użyta termostabilna polimeraza DNA. Powstające fragmenty są komplementarne do sekwencji badanego DNA. Cały cykl zmian temperatury powtarza się określoną ilość razy, zwykle jest to 30-40 cykli. W celu ustalenia długości otrzymanych produktów, stosuje się elektroforezę w żelu agarozowym lub poliakrylamidowym [1]. Technika RT-PCR RT-PCR (ang. Reverse transcriptase PCR) jest modyfikacją klasycznego PCR. Pierwszym etapem reakcji jest przeprowadzenie procesu odwrotnej transkrypcji mrna zawartego w badanej próbie do cdna. W metodzie tej zastosowanie znalazły dwa rodzaje odwrotnych transkryptaz: pochodząca z wirusa AMV lub z wirusa MMLV. Przebieg reakcji PCR po otrzymaniu cdna jest analogiczny do klasycznej reakcji PCR, w którym próbki zawierają DNA. Jako polimerazę stosuje się polimerazę Taq. RT-PCR jest jedną z najbardziej czułych metod służących do wykrywania niewielkich ilości cząsteczek mrna w próbce, co umożliwia wykorzystanie pojedynczej próbki do wielu eksperymentów. Metoda ta służy do określania ilości cząsteczek mrna pomiędzy próbkami, określania poziomu ekspresji, a także analizy struktury RNA. W praktyce metoda ta znalazła zastosowanie w wykrywaniu enterowirusów w kale i detekcji wirusa HIV. W 2009 roku na bazie RT-PCR opracowano metodę detekcji wirusa świńskiej grypy typu H1N1 [3, 1, 4]. Technika multipleks-pcr Jedną z najprostszych odmian techniki PCR jest multipleks PCR. W wyniku zastosowania kilku par swoistych starterów oraz zwiększonej ilości dntp oraz polimerazy możliwa jest równoczesna amplifikacja kilku odcinków DNA [5, 6]. Wykorzystanie jednocześnie różnych zestawów starterów zapewnia zaoszczędzenie czasu oraz zmniejszenie kosztów wykonywanych oznaczeń z równoczesnym zachowaniem wysokiej jakości otrzymanych wyników. Docelowe sekwencje poddawane amplifikacji mogą być fragmentami zawartymi wewnątrz pojedynczej matrycy (ang. Single Template PCR Reaction). Mieszanina reakcyjna może zawierać kilka próbek materiału genetycznego, które są powielane oddzielnie za sprawą użycia odpowiednich primerów (ang. Multiple Template PCR Reaction) [7]. Kluczowym etapem zapewniającym efektywność reakcji jest prawidłowe zaprojektowanie starterów, ze względu na duże prawdopodobieństwo wystąpienia reakcji krzyżowej pomiędzy nimi, a to z kolei przyczynia się do występowania nieprawidłowego łączenia się primerów z sekwencją docelową [8]. Zgodnie z zaleceniami stosowane startery powinny cechować się porównywalną kinetyką reakcji. Odpowiednia ich długość to 18-30 bp, a temperatura topnienia związana z procentową zawartością guaniny i cytozyny w łańcuchu waha się w granicach 55-60 C przy zawartości G/C 35-60%. Akceptowalna różnica w temperaturze topnienia starterów nie powinna przekraczać 3-5 C [9]. Specyficzność do powielanych sekwencji docelowych niweluje błędy powstające w wyniku występowania konkurencji pomiędzy primerami w jednej mieszaninie reakcyjnej. Zmniejszenie amplifikacji może zostać wywołane również nieprawidłowym doborem sekwencji startowych. Wprowadzenie do środowiska reakcji kolejnych par starterów powoduje wzrost ryzyka pojawienia się niespecyficznych połączeń. Istotne zatem jest ustalenie warunków reakcji indywidualnie dla każdej pary VOLUME 50, NR 3-4 9

primerów przed przystąpieniem do oznaczenia [10]. Należy także zwrócić uwagę na fakt, iż stworzone sekwencje startowe należy przetestować pod kątem powstawania dimerów. Możliwa jest jednak redukcja ich wpływu na efektywność reakcji poprzez odpowiednio dobrane warunki analizy [11]. Wykorzystanie hot-start PCR, detergentów jonowych, skrócenie czasu wydłużania oraz przeprowadzenie reakcji hybrydyzacji w możliwie najwyższej temperaturze również pozwala na zmniejszenie prawdopodobieństwa utworzenia niespecyficznych amplikonów [8]. W sytuacji gdy te metody okażą się nieskuteczne, należy powtórnie poddać analizie zastosowane startery. Przed przystąpieniem do badania należy prawidłowo sprecyzować powielane fragmenty. Ich dobór może być uzależniony od rodzaju przeprowadzanego doświadczenia, np. sekwencje specyficzne dla danego gatunku lub szczepu w czasie badań mikrobiologicznych, markery polimorficzne w badaniach kryminalistycznych lub eksony w trakcie poszukiwań delecji [7, 12]. Konieczny jest także projekt wewnętrznych fragmentów kontrolnych. Użyte mogą zostać sekwencje gospodarza, sekwencje zewnętrzne, inne eksony lub sekwencje konserwatywne dla każdego docelowego fragmentu. Powstałe amplifikowane odcinki powinny być odmienne pod kątem długości, jednak różnica ta nie może kolidować z rozdziałem elektroforetycznym otrzymanych fragmentów [7]. Niewątpliwą zaletą multipleks PCR jest możliwość kontroli jakości matrycy. Efektywność weryfikacji jakości otrzymanej sekwencji docelowej jest wyższa niż w przypadku innych odmian reakcji łańcuchowej polimerazy. Sygnał dla długich zdegradowanych połączeń jest silniejszy w porównaniu do połączeń krótkich. Zidentyfikowanie kontaminacji mieszaniny reakcyjnej przez inhibitory jest możliwe dzięki obserwacji obniżonej efektywności powielania sekwencji kontrolnej jak i badanej. Kontrola wewnętrzna oraz eliminacja powstawania błędów jest zapewniona poprzez równoczesną amplifikację kilku fragmentów tego samego genu. W czasie badania kilku podobnych genów analizie poddaje się charakterystyczne sekwencje, natomiast wspólny dla nich odcinek traktowany jest jako próba kontrolna. Multipleks PCR umożliwia także określenie ilości matrycy w próbce. W tym celu należy wziąć pod uwagę zmniejszenie podwajania się produktu na każdym etapie określonego teoretycznie, liczbę przeprowadzonych cykli oraz ilość sekwencji referencyjnej. Ustalenie względnej ilości produktu opierane na porównaniu nasilenia sygnału z próbą referencyjną w sposób bezpośredni lub z wykorzystaniem krzywych standardowych jest zapewnione poprzez użycie fluorescencji [13]. Na uwagę również zasługuje fakt, iż metoda multipleks PCR przyczynia się do zmniejszenia kosztów stosowanych odczynników oraz skraca czas wykonywanego doświadczenia. W celu maksymalizacji oszczędności czasu, możliwe jest przeprowadzenie kontroli jakości wielu próbek jednocześnie, które następnie poddaje się zamrożeniu, aż do momentu ich wykorzystania. Omawiana metoda jest niezastąpiona w przypadku gdy dysponuje się niewielką ilością materiału do badań, co także obniża koszty stosowanej polimerazy [7]. Multipleks PCR znalazła szerokie zastosowanie m.in. służy do wykrywania delecji lub innych mutacji w badanej próbce, bezpośrednio w czasie reakcji PCR lub podczas kolejnych analiz otrzymanego produktu np. przy użyciu restryktaz lub SSCP. Technika ta jest również wykorzystywana do rozpoznania poszczególnych osobników, czyli profilowania DNA. Wykorzystuje się obecność krótkich tandemowych powtórzeń STR, które charakteryzują się wysokim polimorfizmem oraz częstością występowania. Wraz ze wzrostem liczby przeanalizowanych polimorficznych loci, dochodzi do spadku możliwości wystąpienia dwóch identycznych alleli u różnych osobników. W ten sposób dokonuje się mapowania genów, analizy kryminalistycznej oraz wykrywanie chorób. Technika multipleks jest przydatna także w charakteryzowaniu i identyfikacji mikroorganizmów takich jak grzyby, bakterie, wirusy czy też pasożyty. Możliwość wykrycia kilku patogenów równocześnie przyśpiesza diagnostykę, ogranicza koszty i ilość materiału potrzebnego do przeprowadzenia badania [14]. Technika Real time PCR Real Time PCR czyli PCR w czasie rzeczywistym jest odmianą PCR. W biologii molekularnej metoda ta nazywana jest często kinetyczną bądź ilościową reakcją real- -time PCR. Umożliwia ona na jednoczesną amplifikację i monitorowanie ilości powstającego amplikonu. W trakcie reakcji produkt PCR jest oznaczany ilościowo po każdym cyklu namnażania [15]. Początek lat dziewięćdziesiątych ubiegłego wieku to czas, kiedy Higuchi wraz ze współpracownikami z firmy Roche Molecular Systems and Chiron po raz pierwszy zaprezentowali światu metodę real-time PCR. Jako cząsteczki detekcyjnej użyli fluorescencyjnego barwnika jakim był bromek etydyny, który po naświetleniu promieniowaniem ultrafioletowym wykazuje fluorescencję, co pozwala na obserwację amplikonu [16]. Kolejne badania dowiodły, że im mniejsza ilość cykli niezbędna do detekcji fluorescencji, tym większa jest ilość sekwencji amplifikowanej [17, 18]. Tradycyjne techniki detekcji produktu PCR oparte są na elektroforezie kwasów nukleinowych w obecności bromku etydyny i następowej analizie wizualnej bądź densytometrycznej prążków ukazujących się pod wpływem promieniowania UV. Alternatywnie do tego celu można stosować metody precyzyjne, ale bardzo czasochłonne, np. Southern Blott, PCR-ELISA [15]. Technika real-time PCR, dzięki zastosowaniu technik fluorescencyjnych, pozwala na monitorowanie ilości powstającego produktu reakcji podczas jej trwania i tym samym oznaczenie ilości produktu w fazie jego wykładniczego wzrostu. W ten sposób zostaje wyeliminowany etap szacowania produktu po zakończeniu procesu. Wartość bezwzględną określa na podstawie sporządzonej tzw. krzywej standardowej danego genu, czyli serii rozcieńczeń znanej ilości cząstek, które służą za matrycę w reakcji PCR. Wartość względna odnosi się do tzw. genów referencyjnych podstawowych (ang. house keeping genes, HKG), czyli genów zaangażowanych w najistotniejsze do przeżycia komórki procesy, ulegających ekspresji na stosunkowo stałym, niezmiennym poziomie we wszystkich tkankach organizmu. Przykładami genów referencyjnych człowieka są geny: ACTB, GAPDH, PGK1, PPIA, B2M, G6PD, TBP [19, 20, 18, 21]. Ilościowy PCR pozwala także na wgląd w kinetykę reakcji, a co za tym idzie, pozwala na oszacowanie ilości DNA 10 VOLUME 50, NR 3-4

Clinical Medicine na początku reakcji, co nie jest możliwe w klasycznej metodzie PCR. Liczbę kopii badanej sekwencji, jaka była obecna w próbce przed reakcją, wyznacza się na podstawie cyklu, podczas którego sygnał fluorescencji osiągnie wartość graniczną umożliwiającą jego wykrycie (ang. Treshold cycle Ct). Im wcześniej poziom fluorescencji barwnika osiągnie tą wartość, tym większa była początkowa ilość kopii badanego fragmentu DNA [19, 22, 20, 17, 21]. Do monitorowania ilości powstającego amplikonu w czasie rzeczywistym stosuje się różnorodne metody: znakowanie primerów, sond lub powstającego produktu za pomocą cząsteczek fluorescencyjnych [23, 17]. Na podstawie specyficzności znaczników metody detekcji dzieli się na: niespecyficzne wykorzystywane są barwniki interkalujące z DNA np. SYBRGreen I, specyficzne wykorzystywane barwniki specyficzne do amplifikowanej sekwencji, muszą być odpowiednio zaprojektowane i syntetyzowane. W metodach tych wykorzystuje się rezonansowy transfer energii fluorescencji (FRET) pomiędzy donorem a cząsteczką wygaszacza. Przykładem mogą być: liniowe sondy oligonukleotydowe, sondy typu TaqMan [23, 19, 17]. Barwnik SYBR Green I, przyłączając się do małego rowka podwójnej helisy dsdna, emituje 1000 razy większą fluorescencję niż wtedy, gdy jest zawieszony w roztworze. Im większa ilość związanego barwnika, tym silniejszy sygnał fluorescencji. Metoda ta nie wymaga kosztownego projektowania specyficznych starterów, jednak niesie ze sobą ryzyko, że barwniki połączą się np. ze sparowanymi primerami. Wraz z liczbą przeprowadzonych cykli zagrożenie to wzrasta. Dzięki analizie tzw. krzywej topnienia możliwe jest sprawdzenie specyficzności prób. W przypadku wystąpienia niespecyficznych połączeń obserwuje się większą niż jeden liczbę pików [15, 17]. Liniowe sondy oligonukleotydowe/sondy sąsiadujące (ang. dual hybridisation probes/adjacent probes) są fluorescencyjnymi sondami oligonukleotydowymi, które zostały po raz pierwszy opisane w latach 80. ubiegłego wieku. Znane są pod nazwą HybProbes lub adjacentprobes. Emitują sygnał fluorescencji jedynie wtedy, gdy znajdują się blisko siebie w wyniku przyłączania się do matrycy DNA. Na końcu 3 sondy poprzedzającej sekwencję (ang. upstream) znajduje się donorowy fluorochrom, zaś na końcu 5 drugiej sondy (ang. downstream) akceptorowy fluorochrom. Energia wzbudzenia donora jest przekazywana na cząsteczkę akceptora, która dzięki temu emituje sygnał fluorescencji. Jednoczesne wykorzystanie dwóch sond warunkuje wysoką specyficzność [23, 19, 15, 17]. Wraz z rozwojem nauki, sondy wykorzystujące zjawisko hybrydyzacji do matrycy i emisji fluorescencji zostały zastąpione przez nową generację sond, które wykorzystują aktywność 5 nukleazową polimerazy DNA. Po raz pierwszy takich sond użyto do reakcji real-time PCR w 1993 roku. W obecnej chwili jest to jedna z najpopularniejszych metod detekcji. Przykładem mogą być sondy TaqMan. Są fluorescencyjnie wyznakowane oligonukleotydy o specyficznej sekwencji. Jeden z fluoroforów nazywany jest wygaszaczem, drugi zaś reporterem. Jeśli obie sondy znajdują się zbyt blisko siebie, wygaszacz pochłania sygnał emitowany przez reporter. W czasie amplifikacji, dzięki aktywności 5 egzonukleazowej polimerazy DNA, reporter i wygaszacz zostają rozdzielone i w ten sposób zostaje uwolniony sygnał fluorescencji. Najpopularniej stosowanymi wygaszaczami są: TAMRA, DABCYL, BHQ, natomiast wśród reporterów najczęściej stosuje się: FAM, VIC, NED oraz pochodne fluoresceiny (np. izotiocjanian fluoresceiny, 6-karboksyfluoresceina). Sondy typu TaqMan są równie precyzyjne co barwnik SYBR Green I, ale cechuje je większa specyficzność. Dzięki nim możliwe jest wykrywanie mutacji punktowych zachodzących podczas powielania prób. Gdy w miejscu hybrydyzacji na produktach reakcji występują niepożądane zmiany, wtedy sondy wiążą się słabiej do cząsteczki DNA i oddysocjowują w niższej temperaturze. Dzięki analizie tzw. krzywej dysocjacji możliwa jest obserwacja tych zmian [24, 15, 17]. Sondy molekularne typu MolecularBeacons to sondy DNA posiadające strukturę typu spinki. Sekwencja pętli jest komplementarna do specyficznej matrycy, zaś sekwencje pnia są komplementarne do samych siebie. Na końcu 5 znajduje się fluorochrom, zaś na drugim końcu wygaszacz. Gdy struktura szpilki jest zamknięta, wygaszasz i fluorofor znajdują się zbyt blisko siebie by emitować fluorescencję, gdyż wygaszasz absorbuje wszelkie emitowane przez fluorofor fotony. W obecności komplementarnej matrycy, sonda rozwija się i hybrydyzuje. Fluorofor zostaje oddzielony od wygaszacza, a sonda zaczyna fluoryzować [19, 15, 17]. Metoda real-time PCR wyróżnia się szybkością, czułością, swoistością, powtarzalnością oraz szerokim zakresem detekcji. Wśród licznych zalet można też znaleźć wady. Głównym minusem tej techniki jest to, że nawet minimalne zanieczyszczenie materiałem genetycznym analizowanej próbki skutkuje otrzymaniem błędnego wyniku [20]. Opisana metoda zrewolucjonizowała diagnostykę mikrobiologiczną. Wykorzystywana jest m. in. do wykrywania np. Mycobacteriumtuberculosis, Legionellapneumophila, Listeriamonocytogenes i Neisseriagonorrhoeae, monitorowania antybiotykooporności np. Staphylococcusaureus, Staphylococcusepidermidis, Helicobacterpylori, Enterococcusfaecalis i Enterococcusfaecium, szybkiego wykrywania spor Bacillusanthracis. Znalazła również zastosowanie w badaniu ekspresji genów i diagnostyce chorób uwarunkowanych genetycznie [21]. Dzięki jej zastosowaniu do analizy ekspresji genów, możliwe stało się diagnozowanie chorób nowotworowych, wybieranie odpowiedniej terapii oraz monitorowanie odpowiedzi organizmu na leczenie. W onkologii wykorzystywana jest do określania zmian na poziomie chromosomów (wykrywanie translokacji, genów fuzyjnych), a także do szacowania zaawansowania choroby [19, 20, 25]. W obecnej chwili na rynku światowym obecnych jest wiele firm, które w swojej ofercie posiadają aparaturę oraz odczynniki niezbędne do przeprowadzenia reakcji real-time PCR, np. Life Technologies, BioGene, Bioneer, Bio-Rad, Cepheid, Corbett Research, Idaho Technology, MJ Research, Roche Applied Science czy Stratagene [15, 21]. Technika real-time RT-PCR. Technika real-time RT-PCR jest modyfikacją real-time PCR. W przebiegu reakcji można wyróżnić 3 etapy: VOLUME 50, NR 3-4 11

Clinical MANAGEMENT Medicine izolacja mrna, odwrotna transkrypcja, amplifikacja cdna z jednoczesną analizą ilości powstającego produktu. Na rynku światowym dostępne są systemy jedno- oraz dwustopniowej techniki real-time RT-PCR. Jednostopniowa (one-step lub one tube real-time PCR) pozwala na przeprowadzenie odwrotnej transkrypcji i amplifikacji w jednej probówce, co zmniejsza liczbę wykonywanych czynności, a co za tym idzie ryzyko dekontaminacji próby lub utraty materiału jest mniejsze. W dwustopniowej reakcji (two-step lub two-tube real time PCR) najpierw jest przeprowadzana odwrotna transkrypcja, a otrzymana próba jest następnie przenoszona do kolejnych probówek w celu wykonania PCR. Odseparowanie tych dwóch procesów umożliwia łatwiejszą optymalizację reakcji i uzyskanie lepszych rezultatów w przypadku analizowania kilku różnych transkryptów dla jednej próby. Dodatkowo możliwe jest wielokrotne przeprowadzenie analiz poszczególnych transkryptów w tej samej próbce, po procesie odwrotnej transkrypcji [22]. Technika MLPA (ang. Multiplex Ligation dependent Probe Amplification) Jedną z najnowszych metod biologii molekularnej jest MPLA, która została opracowana w 2002 roku przez firmę MRC Holland. Nowo powstała technika opiera się na reakcji PCR oraz połączenia fragmentów (tzw. ligacji) [26, 27]. Działanie polega na hybrydyzacji specyficznej sondy, która zawiera dwa wyznakowane za pomocą fluorochromu nukleotydy, które ulegają przyłączeniu do dwóch zbliżonych miejsc w sekwencji analizowanego DNA, która jest specyficzna dla zastosowanej sondy. W technice MLPA sondy są amplifikowane metodą PCR (a nie sekwencja próbki DNA jak w klasycznej technice PCR). Przyłączona sonda pełni funkcję matrycy. Produkty amplifikacji są określane ilościowo najczęściej metodą elektroforezy kapilarnej [28]. W czasie reakcji wykorzystywane są startery wspólne dla wszystkich zastosowanych sond [29]. Wykonanie analizy z zastosowaniem MPLA wymaga czasu około 2 dni. W pierwszym etapie dokonuje się denaturacji genomowego DNA, który następnie poddaje się hybrydyzacji z sondami. Jest to najdłuższy etap i trwa 16 godzin, dlatego jest przeprowadzany najczęściej przez noc. Kolejnym krokiem jest dodatek enzymu (ligazy), w trakcie którego dochodzi do ligacji użytych sond, po czym wykonuje się reakcję PCR z zastosowaniem wspólnych primerów (jeden z nich jest wyznakowany fluorescencyjnie, co umożliwia identyfikację produktu w czasie elektroforezy). Pozwala to na powielenie sond, które uległy ligacji. Ostatnim etapem jest rozdzielenie powstałych produktów np. za pomocą elektroforezy kapilarnej [26, 30, 27]. Stosowane są sondy specyficznie łączące się z komplementarnych fragmentami analizowanego DNA. Złożone są one z dwóch odcinków i nazywane są sondami połówkowymi (ang. half-probes). Po etapie ich hybrydyzacji do odpowiadającej im sekwencji docelowej, ulegają połączeniu czyli ligacji. Zligowane sondy stają się substratami dla polimerazy w przeprowadzanej następnie reakcji PCR. Planując analizę DNA z wykorzystaniem techniki MLPA, należy wziąć pod uwagę fakt, że sekwencja badana, docelowa dla sondy, musi być unikalna w genomie. W przeciwnym wypadku istnieje prawdopodobieństwo połączenia się sondy z innymi odcinkami w genomie). Konieczne jest także, dobranie odcinka badanego DNA tak, aby nie zawierał on zmiennych sekwencji DNA, tzw. SNP (ang. Single Nucleotide Polymorphism) oraz powtórzeń. W sytuacji, gdy w sekwencji docelowej zaszła mutacja (np. delecja całego bądź części analizowanego fragmentu), nie dochodzi do połączenia jednego lub dwóch odcinków sondy, nie zachodzi również ligacja i nie możliwe jest otrzymanie ograniczonego sekwencjami komplementarnymi dla starterów produktu. Brak produktu oznacza brak matrycy, która zostałaby powielona w trakcie reakcji PCR [31, 27]. Ze względu na występowanie większości mutacji w układzie heterozygotycznym, brak ligacji na jednym alellu nie powoduje jej braku na drugim. Dochodzi jednak do zmniejszenia ilości otrzymanego produktu reakcji PCR, która jest zależna od ilości wprowadzonej matrycy. Skutkuje to obniżeniem nasilenia fluorescencji w czasie wykonywania rozdziału elektroforetycznego w odniesieniu do próbek kontrolnych, które traktowane są jako punkt odniesienia i normę dla analizowanych próbek [26, 27]. Zestawy do MPLA zawierają syntetyczne sondy, które stanowią odcinki referencyjne. Ich zastosowanie ma na celu sprawdzenie, czy dodano odpowiednią ilość badanego DNA i czy zaszła całkowita denaturacja i ligacja (ang. DNA Denaturation control fragments, D-fragments). Poza tym wykorzystuje się także DNA Quantity fragments, aby skontrolować intensywność fluorescencji zależnej od ilości matrycy a niezależnej od ligacji [27]. W celu identyfikacji występującej delecji bądź amplifikacji badanego DNA, należy dokonać porównania pola powierzchni lub wysokości piku uzyskanego dla sondy analizowanego DNA z danymi otrzymanymi dla próby kontrolnej tej samej sondy. Jest to możliwe dzięki użyciu programu komputerowego do analizy MLPA. Uzyskany wynik stosunku wysokości danego piku badanej próbki do próbki kontrolnej powinien wynosić 1 +/- 0,3. W przypadku delecji otrzymany wynik jest poniżej tej wartości, w sytuacji amplifikacji powyżej [31, 26]. Oprócz korzystania z podstawowej metody MLPA, możliwe jest również zastosowanie jej odmian jakimi są RT-ML- PA oraz MS-MLPA. RT-MLPA (ang. Reverse Transcriptase MLPA) jest modyfikacją, która została opracowana w celu badania poziomu ekspresji na poziomie mrna. Analiza licznych próbek jest szybka i prosta, a ilość potrzebnego materiału niewielka ok. 5-10 ng. Metoda ta wymaga przeprowadzenie przez właściwą analizą reakcji odwrotnej transkrypcji, ze względu na fakt, iż enzym jakim jest ligaza nie posiada zdolności łączenia sondy hybrydyzującej z RNA [26]. Druga z modyfikacji MS-MLPA (ang. Methylation-specific MLPA) służy do analizy profilu metylacji. Jej przebieg jest zbliżony do tradycyjnej MLPA, z tą różnicą, że otrzymywane są dwie próbki. Do badania metylacji wykorzystywana jest próbka, która uległa hydrolizie, drugą zaś stosuje się do badania liczby kopii. Sekwencja, do której przyłącza się sonda, posiada region dla metylo-opornej endonukleazy HhaI (enzym restrykcyjny wrażliwy na metylację). Produkty powstałe w czasie hybrydyzacji rozdzielane są do oddzielnych probówek. W pierwszej wykonuje się standardową 12 VOLUME 50, NR 3-4

reakcję MLPA, a drugą z nich inkubuje się z endonukleazą HhaI, w trakcie której sondy hybrydyzujące ulegają ligacji. Połączenie, jakim jest sonda i niemetylowane DNA, jest trawione przez HhaI, co sprawia, że nie dochodzi do ich powielenia podczas reakcji PCR i obserwuje się brak sygnału w czasie elektroforezy. W sytuacji, gdy DNA uległo metylacji, nie dochodzi do hydrolizy przez HhaI, w wyniku czego, obserwuje się powstający pik [27]. Technika MLPA nie jest pozbawiona wad. Szczególnie należy wspomnieć, że ilość produktu reakcji PCR zależy od czystości i stężenia DNA, metody jego izolacji, czasu przechowywania i stopnia degradacji, a także od roztworu, w którym zostało rozpuszczone. Istotna jest także obecność białek, soli oraz RNA. Niewątpliwą wadą metody jest konieczność stosowania zestawów komercyjnych, których wyniki nie są diagnostyczne i należy je potwierdzić innymi metodami. Nie bez znaczenia jest również doświadczenie personelu. Jednak, pomimo tych ograniczeń, technika znalazła zastosowanie w diagnostyce niepełnosprawności intelektualnej o nieustalonej przyczynie, badaniach nowotworów, poziomu metylacji oraz w diagnostyce aneuploidii [26, 27]. Technika PCR i jej liczne modyfikacje obecnie cieszą się dużym zainteresowaniem naukowców. Stale pracuje się nad udoskonaleniem i eliminacją czynników, które mogą wpływać na zmniejszenie efektywności i wiarygodności metody. W artykule zawarte zostały najważniejsze informacje, które mamy nadzieję ułatwią zrozumienie reakcji PCR. Ze względu na obszerność zagadnienia pominięte zostały niektóre odmiany reakcji, a opisane te z nich, które wydają się dla nas najciekawsze. n Piśmiennictwo: 1. Barylski J (2009) PCR najpopularniejsza metoda badania DNA. IGM Internetowa Gazeta Medyczna Nr 3. 2. Bartlett JMS, Stirling D (2003) A Short History of the Polymerase Chain Reaction. PCR Protocols Second Edition 226:3 6. 3. Abbasian F, Tabatabaie H, Sarijloo M, Shahmahmoodi S, Yousefi A, Saberbaghi T, Mokhtari Azad T, Nategh R (2011) A comparative analysis of routine techniques: Reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) and five cell lines for detection of enteroviruses in stool specimens. Iranian Jurnall of Microbiology 3(2):75-79. 4. Brown T (2009) Genomy, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa, str. 671 5. Bartkowiak J (2003) Badania molekularne w rozpoznawaniu i różnicowaniu chorób zakaźnych. Przegląd Epidemiologiczny 57:381-389. 6. Liczbańska A, Woźniak A, Wawrocka A and Krawczyński MR (2006) Techniki wykorzystywane w diagnostyce molekularnej chorób jednogenowych. Nowiny Lekarskie 75:486-490. 7. Edwards M, Gibbs R (1994) Multipleks PCR: Advantages. Development and Applications. Genome Res 3:65-75. 8. Chamberlain JS, Gibbs RA, Ranier JE, Caskey CT (1992) Detection of gene deletions using multiplex polymerase chain reactions. In Methods in molecularbiology 9: Protocols in humanmoleculargenetics (ed. C. Mathew), pp. 299-312. The Humana Press. Clifton. NJ. 9. Gibbs R, Chamberlain JS, Caskey CT (1989) Diagnosis of new mutation diseases using the polymerase chain reaction. In The polymerase chain reaction: Principles and Applications (ed. H. Erlich). Stockton Press. New York. 10. Beggs AH, Koenig M, Boyce FM, Kunkel LM (1990) Detection of 98% DMD/BMD genedeletions by PCR. Hum Genet 86: 45-48. 11. Vandenvelde C, Verstraete M, Van Beers D (1990) Fast multiplex polymerase chain reaction on boiled clinical samples for rapid viral diagnosis. J Virol Methods 30:215-227. 12. Fortina P, Conant R, Monokian G, Dotti G, Parrella I, Hitchcock W, Kant J, Scanlin T, Rappaport E, Schwartz E (1992) Non-radioactive detection of the most common mutation in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator gene by multiplex polymerase chain reaction. Hum Genet 90: 375-378. 13. Chamberlain JS, Gibbs R, Ranier JE, Nguyen PN, Caskey CT (1988) Deletion screening of the Duchenne muscular dystrophylocus via multiplex DNA amplification. Nucleic Acids Res 16: 11141-11156. 14. Elnifro E, Ashshi A, Cooper R, Klapper P (2000) Multiplex PCR: Optimization and Application in DiagnosticVirology. Clinical Microbiology Review 13(4):559-570. 15. Radwan M, Jonszta D, Kosz-Vnenchak M (2008) Metoda PCR w czasie rzeczywistym (real-time PCR) wyzwania i perspektywy. Diagnosta laboratoryjny 17 (2):10-18. 16. Higuchi R, Dollinger G, Walsh PS, Griffith R (1992) Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences. Biotechnology 10:413-417. 17. Widero K, Stachowska E, Chlubek D (2007) Łańcuchowa reakcja polimerazy z analizą w czasie rzeczywistym (RT-PCR). Roczniki Pomorskiej Akademii Medycznej w Szczecinie 53(3):5-9. 18. Winter PC, Hickey GI, Fletcher HL (2004) Krótkie wykłady, Genetyka, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa. 19. Mackay IM (2004) Real-time PCR in the microbiology laboratory. Clinical Microbiology and Infection 10:190 212. 20. Romanowski T, Markiewicz A, Bednarz N, Bielawski KP (2007) Geny metabolizmu podstawowego jako geny referencyjne w ilościowym oznaczaniu ekspresji genów metodą real-time PCR. Postępy Hig Med Dosw 61: 500-510. 21. Valasek MA, Repa JJ (2005) The power of real-time PCR. Advan Physiol Educ 29:151-159. 22. Marisa L, Medrano (2005) WJ Real-time PCR for mrna quantitation. BioTechniques 39(1)75-85. 23. Mackay IM, Arden KE, Nitsche A (2002) Real-time PCR in virology. Nucleic Acids Research 30(6):1292-1305. 24. Langmann T, Mauerer R, Zahn A, Moehle C, Probst M, Stremmel W, Schmitz G (2003) Real-time reverse transcription PCR expression profiling of the complete human ATP binding cassette transpor- VOLUME 50, NR 3-4 13

ter superfamily in various tissues. Clinical Chemistry 49(2):230 238. 25. Szatkowska K (2009) Zastosowania real-time PCR. IGM Internetowa Gazeta Medyczna Nr 5. 26. Łaczmańska I, Łaczmański Ł (2009) Metoda MPLA oraz jej zastosowanie w diagnostyce chorób uwarunkowanych genetycznie, Postępy Biologii Komórki, Tom 36, Nr 4, str. 559-563. 27. Strona internetowa http://www.mlpa.com: 31.01.2014. 28. Bocian E, Kasprzycka J, Jakubów-Durska K, Łuszczek A, Bernaciak J (2011) Przydatność metody MLPA do szybkiej prenatalnej identyfikacji aneuploidii. Wyniki 409 badań diagnostycznych. Ginekol Pol 82:680-684. 29. Jóźwiak A, Bijok J, Massalska D, Pawłowska B, Ilnicka A, Bogdanowicz J, Masternak-Wasiuk K, Jakiel G, Roszkowski G (2013) Analiza efektywności techniki MPLA w inwazyjnej diagnostyce prenatalnej najczęstszych aneuploidii. Ginekol Pol 84:682-690. 30. Łaczmańska I, Łaczmański Ł, Pesz K (2009) Application of Selected Method Based on Polymerase Chain Reaction in MedicalMolekular Diagnostics. Adv Clin Exp Med 18:85-92. 31. Kozłowski P, Jasińska AJ, Kwiatkowski DJ (2003) New applications and developments in the use of multiplex ligation dependent probe amplification. Electrophoresis 29(23):4627-4636. 14 VOLUME 50, NR 3-4

Clinical Medicine A NEW HOPE FOR PANCREATIC CANCER PATIENTS IN LARGE SURGICAL CRITERIA (BORDERLINE PANCREATIC TUMORS) MAREK DURLIK, MAGDALENA DEREJSKA Clinical Department of Internal Medicine, Nephrology and Transplantlogy of the Central Clinical Hospital of the Ministry of the Interior, Warsaw Central Clinical Hospital of the Ministry of the Interior, Warsaw Adopted and approved for print December 12, 2014 Medical Problems 2014; Vol.: 50, nr 3-4, s. 15-17 Corresponding author: lek. med. Magdalena Derejewska, Clinical Department of Internal Medicine, Nephrology and Transplantlogy, Central Clinical Hospital of the Ministry of the Interior, Warsaw, Woloska 137, 02-507 Warszawa; tel. +48 22 508 12 17 Abstract: Borderline resectable pancreatic cancer is a challenging disease for high volume centers. Although there are no randomized trials, more and more publications have proved that in the case of locally advanced pancreatic cancers, with portal vein or superior mesenteric vein invasion, surgical treatment can significantly improve 5-year survival, in cases where radical resection is possible. Portal vein resection with pancreatoduodenectomy is safe and has become a standard surgical procedure for borderline pancreatic tumors. Keywords: Pancreatic adenocarcinoma, Borderline resectable, Vein resection, Portal vein reconstuction Introduction Despite advances in cancer treatment, pancreatic adenocarcinoma still has the worst prognosis of all gastrointestinal malignancies and is one of the most frequent causes of tumor-related deaths in the European Union and the USA. Radical surgical resection with negative margins remains the most important factor in achieving long-term survival. Early-stage pancreatic cancer is usually clinically silent and the disease becomes apparent after the tumor invades surrounding tissue or metastases to distant organs. At the moment of diagnosis, only 10-20% of tumors are considered to be potentially resectable. Because of the aggressive biology of pancreatic adenocarcinoma, survival rates are low even for patients at the early stages of disease. These kinds of malignancies have a high rate of local recurrence and metastases after surgical treatment. The average survival time is poor, at only 15-19 months, with a 5-year survival rate of approximately 20% [1]. There are a few important factors that correlate with survival time. They are: tumor size, resection margin status, nodal metastases and the tumor DNA content [3]. The borderline resectable pancreatic adenocarcinoma (BRPC) is a tumor with very high risk of margin-positive resection, and early treatment failure. Therefore it is a challenging disease that requires a high level of specialization. Definitions Pancreatic tumors are divided into four groups: resectable, borderline resectable, locally advanced unresectable and metastatic cancer. Currently two primary definitions of borderline resectable pancreatic tumors are commonly used in the literature. The first is the definition of The University of Texas MD Anderson Cancer Center (MDACC) Group and the second is that of the Americas Hepato-Pancreato-Biliary Association (APHBA)/Society of Surgical Oncology (SSO), Society for Surgery of the Alimentary Tract (SSAT) in their Consensus Guidelines, which have been incorporated into the National Comprehensive Cancer Network (NCCN). Both of these definitions are similar and based on a radiographic interface between the tumor and vessels: portal vein (PV), superior mesenteric vein (SMV), superior mesenteric artery (SMA), hepatic artery and celiac trunk. (Figure 1) Therefore, imaging diagnostics plays a critical role in planning the multimodality treatment of pancreatic tumors. Treatment The borderline resectable pancreatic adenocarcinoma (BRPC) is a tumor with a very high risk of margin-positive resection, and early treatment failure. It is a challenging disease for high volume centers. The development of surgical technique and progress in medical technology has led to more radical approaches to surgery in patients with locally advanced pancreatic tumors. Many surgical teams perform a portal vein resection during pancreaticoduodenectomy. Such a procedure is now considered safe and without the negative impact of post-operative complications. Furthermore, the long-term oncologic results are similar to patients without vein involvement. Portal vein resection has now become a standard surgical procedure for this kind of tumor. Arterial involvement has much more negative impact upon the patient s prospects. During a pancreatoduodenectomy, it negatively affects patient survival and thus is not widely accepted. This kind of surgical treatment should be performed in centers with a lot of experience in vascular surgery [2]. Unfortunately the onset of margin-positive resection is high even after vessel resection. Therefore neoadjuvant chemotherapy needs to be considered in parallel with VOLUME 50, NR 3-4 15

Clinical MANAGEMENT Medicine venous involvement of the SMV or PV with distortion or narrowing of the vein or occlusion of the vein with suitable vessel proximal and distal, allowing safe resection or replacement gastroduodenal artery encasement up to the hepatic artery with either short segment encasement or direct abutment of the hepatic artery, without extenstion of the celiac trunk tumor abutment of the SMA not to exceed moregreater than 180 degrees of the circumference of the vessel wall. an interface exists between the tumor and the SMV/portal vein measuring 180 degrees or more of the vessel wall circumference, and/or reconstructable venous occlusion an interface exists between tumor and the SMA measuring less than 180 degrees of the vessel wall circumference a reconstructable, short-segment interface of any degree exists between the tumor and the common hepatic artery an interface exists between the tumor and the celiac trunk measuring less than 180 degrees of the vessel wall circumference Figure 1. The definition of borderline resectable tumors meet any one or more of the followong radigrafic criteria an optimal surgical approach. The new consensus statement of the ISGPS (International Study Group of Pancreatic Surgery) published in 2014 does not support neoadjuvant therapy in patients with portal or superior mesenteric vein involvement if resection is possible. According to currently available data, there is a similar survival rate after radical resection in BRPC, in comparison with resectable patients. There are many different approaches to vein reconstruction such as partial vein resection with plastic surgery of the vessel wall, or with the use of a patch [4, 6]. We also perform a segmental resection with end to end anasthomosis, or reconstruction with the use of a venous conduit, such as a PTFE graft or left renal vein (Figures 2 and 3). The conservative surgical treatment of BRPC with invasion into the portomesenteric veins is often only adopted in surgical bypass procedures because of the presumed high risk of complications. The recently published large multicenter retrospective cohort study shows that aggressive surgical procedures with vein reconstructions are safe with no evidence of a higher onset of comorbidity. A significant improvement is observed in the overall survival of patients after undergoing a pancreatoduodenectomy with vein resection compared to those who underwent a surgical bypass [7, 9]. Conclusions The prognosis for Pancreatic cancer is very bleak, with only 20% of patients qualifying for surgical resection, which offers the only real hope to patients. There is no doubt that surgical skill alone will not be the only requirement for the successful treatment of pancreatic cancer in the future. Individualized care, including chemotherapy/radio-chemotherapy and immunologically-based new drugs to target cancer cells will play a vital role [8]. n References: 1. Diagnosis and management of pancreatic cancer. De La Cruz MS, Young AP, Ruffin MT. Am Fam Physician. 2014 Apr 15; 89 (8): 626-32. 2. Pancreatic Cancer: Advances In Treatment, Results and Limitations Thilo Hackert, Markus W. Büchler Dig Dis. 2013; 31 (1): 51-6. doi: 10.1159/000347178. Epub 2013 Jun 17. Review. 3. Redefining the R1 resection for pancreatic ductal adenocarcinoma: tumour lymph nodal burden and lymph node ratio are the only prognostic factors associated with survival. John BJ, Naik P, Ironside A, Davidson BR, Fusai G, Gillmore R, Watkins J, Rahman SH. Figure 2. Portal vein reconstruction with using the left renal grafting Figure 3. Portal vein reconstruction with using Gore-Tex graft 16 VOLUME 50, NR 3-4

HPB (Oxford). 2013 Sep; 15 (9): 674-80. doi: 10.1111/ hpb.12019. Epub 2013 Jan 14. 4. Pancreatic surgery with vascular reconstruction in patients with locally advanced pancreatic neuroendocrine tumors. Haugvik SP, Labori KJ, Waage A, Line PD, Mathisen Ø, Gladhaug IP. J Gastrointest Surg. 2013 Jul; 17 (7): 1224-32. doi: 10.1007/s11605-013- 2221-6. Epub 2013 May 14. Review. 5. Patency rates of portal vein/superior mesenteric vein reconstruction after pancreatectomy for pancreatic cancer. Krepline AN, Christians KK, Duelge K, Mahmoud A, Ritch P, George B, Erickson BA, Foley WD, Quebbeman EJ, Turaga KK, Johnston FM, Gamblin TC, Evans DB, Tsai S. J Gastrointest Surg. 2014 Nov; 18 (11): 2016-25. doi: 10.1007/s11605-014-2635-9. Epub 2014 Sep 17. 6. Portal vein resection during pancreatectomy for pancreatic head adenocarcinoma. Scope of current opinions and own experiences. Laski D, Hać S, Sledziński Z. Pol Przegl Chir. 2014 Jul; 86 (7): 345-9. doi: 10.2478/pjs-2014-0061. No abstract available. 7. Lessons learned from a complete remission of advanced metastatic pancreatic ductal adenocarcinoma. Mathew BM, Daas AY, Centeno BA, Hoffe S, Valone T, Patel M, Springett GM. Clin Adv Hematol Oncol. 2012 May; 10 (5): 340-3. No abstract available. 8. Therapeutic advances in pancreatic cancer. Paulson AS, Tran Cao HS, Tempero MA, Lowy AM. Gastroenterology. 2013 Jun; 144 (6): 1316-26. doi: 10.1053/j.gastro.2013.01.078. Review. Erratum in: Gastroenterology. 2013 Sep; 145 (3): 694. 9. Pancreatic cancer in the general population: Improvements in survival over the last decade. Riall TS, Nealon WH, Goodwin JS, Zhang D, Kuo YF, Townsend CM Jr, Freeman JL. J Gastrointest Surg. 2006 Nov; 10 (9): 1212-23; discussion 1223-4. VOLUME 50, NR 3-4 17

PLOIDY AND DNA INDEX AS PROGNOSTIC FACTORS IN RESECTED PANCREATIC DUCTAL ADENOCARCINOMA A REVIEW OF THE LITERATURE JULIA TUCHALSKA-CZUROŃ 1, 3, MAREK DURLIK 1, 2 1. Mossakowski Medical Research Centre, Polish Academy of Sciences; 2. Clinical Department of Gastroenterologic Surgery and Transplantation of the Central Clinical Hospital of the Ministry of the Interior in Warsaw; 3. Diagnostic Radiology Department of the Central Clinical Hospital of the Ministry of the Interior in Warsaw. Adopted and approved for print December 12, 2014 Medical Problems 2014; Vol.: 50, nr 3-4, s. 18-21 Corresponding author: Julia Tuchalska-Czuroń, MD. 02-106 Warsaw, 5 Pawinskiego Street Phone: 22 608 65 21 e-mail: jczuron@imdik.pan.pl Abstract: In Poland, pancreatic cancer is the seventh most common cause of cancer- -related deaths amongst men and sixth amongst women. Pancreatic cancer has an extremely poor prognosis. Radical surgery still remains the only way of curing pancreatic cancer and it is possible to perform in 20% of cases, which present localised disease upon diagnosis. An average survival of ~20 months post-resection and adjuvant chemotherapy has been observed for 10-15% of patients with tumours limited to the pancreas at the time of presentation. It is necessary to define strong prognostic factors to determine individual treatment and prognosis. In this paper we submit a review of the literature concerning the prognostic impact of the ploidy and the DNA index on the survival of patients who underwent resection of pancreatic ductal adenocarcinoma. However presented studies have produced conflicting results. Pancreatic cancer still remains a great challenge in medicine. Keywords: Pancreatic cancer, Ploidy, DNA index Introduction According to the National Cancer Registry, in Poland there are over 3000 new cases of pancreatic cancer per year. Pancreatic cancer (PC) is the seventh most common cause of cancer-related deaths amongst men and sixth amongst women. 90% of pancreatic cancers are ductal adenocarcinomas (PDAC), which are known for their extremely poor prognosis. In most cases, at the time of diagnosis this malignant neoplasm is unresectable because of distant metastases. 74% of patients die within the first year of diagnosis. Only about 20% of pancreatic cancer patients qualify for surgery, which is the only widely accepted curative treatment method. An average survival of ~20 months post-resection and adjuvant chemotherapy has been observed in 10-15% of patients with tumours limited to the pancreas at the time of presentation [1]. Gemcitabine is the standard chemotherapeutic agent in pancreatic cancer. Unfortunately, two-thirds of pancreatic tumours display low expression of human equilibrative nucleoside transporter 1 (hent1), which mediates cellular entry of the drug, and do not respond to gemcitabine therapy. Other mechanisms of resistance to gemcitabine are: deficient deoxycytidine kinase activity (these kinase phosphorylates gemcitabine to active metabolites) and overexpression of ribonucleotide reductase (one of the active metabolites of gemcitabine works by blocking these enzyme) [2]. Prognostic factors in pancreatic cancer Many studies into the prognostic factors in pancreatic cancer have been conducted for a number of years. Prognostic factors allow clinicians to select the individual treatment strategy and they can be divided into several groups, for example widely available blood tests, tumour markers, immunohistochemical markers, histological staging and grading, the influence of administered therapy, clinical condition of the patient, demographic factors, etc. It is a broad subject, so we decided to highlight the most interesting data. Chiang et al. reported that patients with a better nutritional status (measured as having an albumin level greater than 3.5 g/dl), radical resection, early tumour stage and better-differentiated tumours were associated with favorable survival [3]. Of great interest is a study carried out in 2012 by Sanjay et al. which showed that a pre-operative elevated serum CRP level and raised post-operative lymph node ratio (ratio of positive over excised lymph nodes) represent significant independent prognostic factors that predict poor prognosis in patients undergoing curative resection for pancreatic ductal adenocarcinoma [4]. The results of the study conducted in 2011 by de Jong et al. are quite remarkable. Authors analyzed 1697 cases of patients who underwent curative pancreaticoduodenectomy because of pancreatic adenocarcinoma in terms of tumour size and they concluded that the cut-off value of 2 cm is not independently associated with the outcome, however, tumour size is strongly associated with the risk of other adverse prognostic factors. The effect of size on prognosis is largely attributable to these other biological factors rather than the size of the tumour itself [5]. Smith et al. did a meta-analysis of immunohistochemical prognostic markers in resected pancreatic cancer. In this meta-analysis vascular endothelial growth factor (VEGF) emerged as the most potentially informative prognostic marker; Bcl-2, bax and p16 also returned sig- 18 VOLUME 50, NR 3-4

Clinical Medicine Table I. STUDIES ON THE RELATIONSHIP BETWEEN PLOIDY/DNA INDEX AND SURVIVAL OF PATIENTS OPERATED UPON BECAUSE OF PANCREATIC DUCTAL ADENOCARCINOMA Authors Design of study No. of pa-tients Diploid Non-diploid Survival in diploid group Survival in non-diploid group p DNA index p Kamphues et al. prospect. 61 24,6% 75,6% 29,2 mth 13,5 mth 0,252 1,9 0,026 Yeo et al. retrosp. 119 43% 57% 24 mth 11,5 mth 0,0002 - - Berczi et al. retrosp. 22 63,6% 36,4% 10 mth 8 mth >0,05 - - Bui et al. retrosp. 20 35% 65% 17 mth 7,5 mth <0,03 - - Hyoty et al. retrosp. 53 79% 21% 14 mth 9 mth 0,11 1,0-3.21 - Allison et al. retrosp. 47 40% 60% 25 mth 10,5 mth 0,003 - - nificant overall survival differences, but in smaller patient series due to a lack of evaluable literature [6]. Boyd et al. reported that depression was a significant predictor of survival in patients with pancreatic cancer who underwent surgical resection (hazard ratio, 1.34; 95% confidence interval, 1.04-1.73) [7]. Wang et al. showed that patients with metabolic syndrome and pancreatic cancer had later disease staging and a poorer histological grade. They also demonstrated significantly poorer survival [8]. Genetic background of pancreatic cancer A number of studies on the molecular level have been conducted to gain deeper insight into cancer biology. Analyses have shown that the most common genetic alterations identified to date in pancreatic cancer are activation of the KRAS oncogene and inactivation of the CDKN2/p16, TP53 and DPC4 tumour suppressor genes. Mutation of KRAS occurs in 80-95% of cases and mutation of CDKN2 in 75-95%. The association of these two mutations is not frequent in other cancers and that s why it is called the molecular fingerprint of pancreatic cancer. Mutation of the TP53 suppressor gene affects more than half of PC tumours. Another suppressor gene DPC4 (deleted in pancreatic cancer 4) is mutated in 50-55% [9,10]. Oshima et al. retrospectively analysed the relationship between selected clinical parameters and immunohistochemically detected expression of CDKN2A/p16, TP53, and DPC4. Abnormal immunolabeling of p53 was significantly associated with tumour dedifferentiation (P = 0.022) and the presence of locoregional recurrence (P = 0.020). Loss of CDKN2/p16 immunolabeling was associated with lymphatic invasion (P = 0.012) and postoperative widespread metastases (P < 0.001). A significant correlation was found between DPC4 immunolabeling and tumour size (P = 0.006), lymphatic invasion (P = 0.033), and lymph node metastasis (P = 0.006). Smith et al. conducted a meta-analysis related to resected PC, which confirmed a prognostic value for CDKN2/p16, but neither TP53 nor DPC4/smad4 was found to represent significant prognostic factors [6]. In studies of the molecular background of PC, authors have also described mutations of SWI/SNF (35% of cases), APC, MCC, DCC, BRCA2, RB1[9-12]. Ploidy and dna index as prognostic factors in pancreatic cancer Ploidy is the number of sets of chromosomes in the nucleus of a biological cell. A typical human somatic cell contains 46 chromosomes (2n=46). This applies to somatic cells in the G0/G1 phase of mitotic cell cycle. Cells are described according to the number of sets present: haploid (1 set), diploid (2 sets), triploid (3 sets), tetraploid (4 sets), pentaploid (5 sets), hexaploid (6 sets), heptaploid or septaploid (7 sets), etc. The generic term polyploid is frequently used to describe cells with three or more sets of chromosomes (triploid or higher ploidy). Euploidy is the state of a cell or organism having an integral multiple of the monoploid number. For example, a human cell has 46 chromosomes, which is an integer multiple of the monoploid number, 23. A human with abnormal, but integral, multiples of this full set (e.g. 69 chromosomes) would also be considered as euploid. Aneuploidy is the state of not having euploidy. The DNA index is the mean nuclear DNA content of the G0/G1 compartment of the neoplastic cells population divided by the DNA content of the G0/G1 compartment of the known diploid reference cells. Of interest to this paper is the relationship between the survival of patients operated upon because of pancreatic ductal adenocarcinoma and cancer cell ploidy (DNA index). Here, we can ask if there is any relationship between resectability of pancreatic cancer and DNA content. In the prospective study He et al. showed that there is a high correlation between resectability of pancreatic cancers and their DNA ploidy status. In this study, a total of 36 patients with pancreatic adenocarcinoma were divided into resectable and unresectable groups. Statistical significance was found in DNA ploidy in both groups (p<0.05). The rates of diploid/tetraploid and aneuploid were 66.7% and 33.3% in the resectable group respectively, and 38.9% and 62.1% in the unresectable group, respectively (P<0.05) [13]. The following is a presentation of studies on the relationship between the survival of patients with resectable pancreatic ductal adenocarcinoma and their ploidy /DNA index. The results of similar studies are summarized in Table I. Kamphues et al. reported that the DNA index represents an independent predictive marker in patients with pancreatic head cancer. In this prospective study, the DNA ploidy and the DNA index of 61 patients operated upon because of pancreatic head cancer were evaluated by DNA image cytometry. Of these, 15 tumours (24.6%) were identified as diploid and 46 (75.6%) as nondiploid. The median DNA index in the entire cohort was 1.9 (range, 1.0-2.5). The average survival of the study cohort was 17.5 months. VOLUME 50, NR 3-4 19

Clinical MANAGEMENT Medicine In the multivariate survival analysis, DNA index (p = 0.026) and lymph node status (p = 0.007) were identified as independent prognostic factors predicting the survival of the study cohort [14]. Yeo et al. showed that DNA content is one of the strongest predictors of outcome after pancreaticoduodenectomy in patients with adenocarcinoma of the head of the pancreas. Of the 119 patients whose tumours were analyzed for DNA content, 51 (43%) had diploid tumours and 68 (57%) had aneuploid tumours. Patients with diploid tumours had a median survival of 24 months and a 5-year survival of 39%, significantly better than the average survival of 11,5 months and 5-year survival of 8% observed in patients with aneuploid tumours (p=0,0002) [15]. Hyoty et al. reported that there is no correlation between ploidy/dna index and survival in patients who had undergone resection of pancreatic cancer. Authors analyzed 53 cases of resected pancreatic ductal adenocarcinoma. The DNA index ranged from 1,00 to 3,21. Aneuploidy was detected in 11 (21%). After excluding 8 patients, who did not die from cancer, average survival was 13 months. The survival of the patients with DNA-aneuploid tumours (median 9 months) did not differ significantly from that of the patients with diploid tumours (median 14 months), p=0,11 [16]. In contrast to this study, Allison et al. obtained totally different results. In this study the DNA content of 47 adenocarcinomas arising in the head of the pancreas from patients who had undergone successful pancreatoduodenectomy was measured. Of the 47 tumours, 19 (40%) were diploid and 28 (60%) were aneuploid cancers. The 19 patients with diploid cancers had an average survival time of 25 months. Average survival of the 28 patients with aneuploid cancers was 10.5 months. This difference was statistically significant (p = 0.003). A multivariate life table regression analysis demonstrated that the ploidy is an independent prognostic factor for patients with adenocarcinoma of the head of the pancreas who have successfully undergone a pancreaticoduodenectomy [17]. The study conducted by Herrera et al. was slightly different. The authors hypothesized that if the ploidy pattern correlated to survival, recognition of this pattern should be more apparent in long-term survivors in a population of patients undergoing resection for pancreatic ductal adenocarcinoma. In this retrospective study, 72 patients were divided into two groups according to the length of survival: the long-term survivors-group I (19 patients who survived 3 or more years after operation) and the shortterm survivors- group II (43 patients who died within 12 months after resection). All hospital deaths (within 30 days of operation) and patients who survived for at least 1 but less than 3 years after operation were excluded from this study. Because of poor-quality histograms, the authors were unable to interpret 10 of 72 samples evaluated. These patients were excluded from analysis. In 30 specimens (48%), the nuclear DNA pattern was diploid, whereas 32 were nondiploid (two tetraploid and 30 aneuploid). In group I, 12 patients (63%) had DNA diploid tumours and 7 (37%) had a nondiploid DNA pattern, compared with 18 (42%) and 25 (58%), respectively, in group II. The DNA index of the 19 patients with long-term survival ranged from 1 to 1,86 (mean 1,1) and that of the 43 patients with shortterm survival ranged from 1 to 2 (mean 1,2). There were no significant differences in the number of diploid/nondiploid patterns or DNA indeces between the two groups [18]. Conclusion Despite significant advances in the surgical and chemotherapeutic management of patients with pancreatic cancer in recent years, prognosis is extremely poor. That is why many studies have focused on the reasons for aggressive biology of pancreatic cancer and the prognostic values of different factors. Studies evaluating the prognostic impact of the ploidy and the DNA index have produced conflicting results. However, most of these studies were retrospective and based on the analysis of paraffin embedded archival material and therefore provided only limited evidence. Further, large and prospective studies are needed and pancreatic cancer still remains a great challenge in medicine. n References: 1. Kaur S, Baine MJ, Jain M, et al. Early diagnosis of pancreatic cancer: challenges and new developments. Biomark Med. 2012 Oct; 6 (5): 597-612. doi: 10.2217/bmm.12.69. Review. 2. Ansari D, Tingstedt B, Andersson R. Pancreatic cancer cost for overtreatment with gemcitabine. Acta Oncol. 2013 Aug; 52 (6): 1146-51. doi: 10.3109/0284186X.2012.744140. Epub 2012 Dec 17. 3. Chiang KC, Yeh CN, Ueng SH, et al. Clinicodemographic aspect of resectable pancreatic cancer and prognostic factors for resectable cancer. World J Surg Oncol. 2012 May 4; 10: 77. doi: 10.1186/1477-7819-10-77. 4. Sanjay P, de Figueiredo RS, Leaver H, et al. Preoperative serum C-reactive protein levels and post-operative lymph node ratio are important predictors of survival after pancreaticoduodenectomy for pancreatic ductal adenocarcinoma. JOP. 2012 Mar 10; 13 (2): 199-204. 5. De Jong MC, Li F, Cameron JL, et al. Re-evaluating the impact of tumour size on survival following pancreaticoduodenectomy for pancreatic adenocarcinoma. J Surg Oncol. 2011 Jun 1;103 (7): 656-62. doi: 10.1002/jso.21883. Epub 2011 Jan 31. 6. Smith RA, Tang J, Tudur-Smith C, et al. Meta-analysis of immunohistochemical prognostic markers in resected pancreatic cancer. Br J Cancer. 2011 Apr 26; 104 (9): 1440-51. doi: 10.1038/bjc.2011.110. Epub 2011 Mar 29. 7. Boyd CA, Benarroch-Gampel J, Sheffield KM, et al. The effect of depression on stage at diagnosis, treatment, and survival in pancreatic adenocarcinoma. Surgery. 2012 Sep; 152 (3): 403-13. doi: 10.1016/j.surg.2012.06.010. 8. Wang DS, Wang ZQ, Zhang L, et al. Are risk factors associated with outcomes in pancreatic cancer? PLoS One. 2012; 7 (7): e41984. doi: 10.1371/journal.pone.0041984. Epub 2012 Jul 24. 20 VOLUME 50, NR 3-4