α β α β Streszczenie Patomechanizm porodu przedwczesnego nie został do tej pory w pełni wyjaśniony, pomimo odkrycia szeregu przyczyn jego powstawania. Uważa się, że pewien udział w powstawaniu porodu przedwczesnego mogą odgrywać estrogeny. Synteza hormonów estrogenowych w jednostce płodowo-łożyskowej zachodzi przy udziale kompleksu aromatazy cytochromu P450. Łożysko jest bogatym źródłem zarówno aromatazy, jak i białkowych receptorów estrogenowych, dlatego istnieją przypuszczenia, że zmiany w ekspresji i/lub komórkowej lokalizacji tych białek mogą korelować z wystąpieniem porodu przedwczesnego. Celem pracy była ocena stopnia ekspresji i określenie immunolokalizacji aromatazy cytochromu P450 oraz receptorów estrogenowych α i β w łożyskach pochodzących z porodów terminowych i przedwczesnych. Badaniem objęto grupę 10 kobiet rodzących pomiędzy 26., a 32. tygodniem ciąży, u których poród przedwczesny indukowany był nadciśnieniem ciążowym oraz grupę 10 kobiet rodzących między 37 a 40 tygodniem ciąży, stanowiących kontrole. W celu oceny ekspresji i immunolokalizacji aromatazy cytochromu P450 oraz receptorów ER-α i ER-β w analizowanych skrawkach tkankowych przeprowadzono reakcje immunohistochemiczne wykorzystując metodę ABC. Poziom ekspresji aromatazy cytochromu P450 oraz receptorów estrogenowych ER-α i ER-β pochodzących z porodów przedwczesnych był wyższy w porównaniu z poziomem ekspresji badanych białek w łożyskach z porodów terminowych. Ponadto, nie wykazano różnic w komórkowej lokalizacji badanych białek w łożyskach pochodzących z porodów przedwczesnych i terminowych. Nie zaobserwowano związku pomiędzy stopniem ekspresji i immunolokalizacją aromatazy oraz receptorów ER-α i ER-β, a wystąpieniem porodu przedwczesnego. Wysoki poziom ekspresji omawianych białek w centralnej części łożyska w trzecim trymestrze ciąży może świadczyć o zwiększonym zapotrzebowaniu łożyska na estrogeny w związku z przebudową tej części narządu. Abstract There are many causes of preterm delivery, however, the main reasons of its occurrence are still unknown. It is thought that estrogens can play a significant role in preterm delivery formation. The production of estrogen involves sequential enzymatic reaction catalyzed by different specific forms of cytochrome P450 steroidogenic enzymes. The human placenta is a rich source of aromatase and estrogen receptors α and β. Therefore, it is assumed that some alterations of expression and immunolocalization of aromatase and estrogen receptors can correlate with preterm delivery. The aim of the study was the assessment of expression status and immunolocalization of aromatase and estrogen receptors α and β in normal and preterm placental tissues. Samples of normal and preterm placental tissues were obtained during deliveries from 10 healthy women and 10 women with diagnosed preeclampsia. Expression and immunolocalization of aromatase and estrogen receptors α and β were determined by immunohistochemical ABC technique. The expression status of aromatase and estrogen receptors α and β in preterm placental tissues were higher than in normal placental samples. Additionally, no differences in cellular localization of analyzed proteins between normal and preterm placental samples were detected. No correlation between expression and immunolocalization of aromatase and estrogen receptors α and β in the central part of placental tissues and preterm delivery formation was observed. Moreover, the high level of expression of analyzed proteins in placentas during third term of gestation may demonstrate the greater demand for estrogens in placentas. Key words: cytochrome P450 aromatase, estrogen receptor α, estrogen receptor β, preterm delivery Słowa kluczowe: aromataza, receptor estrogenowy ER-α, receptor estrogenowy ER-β, poród przedwczesny
Wstęp Według Światowej Organizacji Zdrowia prawidłowy czas trwania ciąży wynosi od 37 do 41 pełnych tygodni. Urodzenie dziecka pomiędzy 23, a 37 tygodniem ciąży uznawane jest za poród przedwczesny. Zaś ciąża trwająca powyżej 42 tygodni stanowi ciążę przeterminowaną [1]. Porody przedwczesne szacuje się na około 4-20 % wszystkich ciąż, w związku z tym stanowią one poważny problemem kliniczny [2]. Pomimo odkrycia szeregu przyczyn powstawania porodu przedwczesnego, jego patomechanizm nie został do tej pory w pełni wyjaśniony. Wśród medycznych czynników predysponujących do wystąpienia porodu przedwczesnego wyróżnia się między innymi nadciśnienie indukowane ciążą [3, 4]. Wystąpienie porodu przedwczesnego korelowane jest z wieloma jednostkami chorobowymi, które mogą dotykać zarówno kobietę ciężarną, jak i sam płód. Wykształcenie prawidłowej gospodarki hormonalnej pomiędzy płodem, a matką jest jednym z ważniejszych czynników warunkujących prawidłowy przebieg ciąży. Uważa się, że pewien udział w powstawaniu porodu przedwczesnego mogą posiadać estrogeny [5]. Te żeńskie hormony płciowe odgrywają decydującą rolę w dojrzewaniu tkanek płodu, pomimo że ich dokładny wpływ na stan płodu nie został do tej pory w pełni poznany [6]. Rola estrogenów w procesie porodowym, zarówno samoistnym jak i przedwczesnym, związana jest ze zwiększeniem kurczliwości macicy. Estrogeny pobudzają produkcję białek kurczliwych i enzymów, zwiększają zdolność komórek mięśniowych do wychwytywania i magazynowania jonów wapnia, a także modulują kanały wapniowe w obrębie komórek mięśniowych. Ponadto estrogeny wpływają pozytywnie na produkcję receptorów dla oksytocyny, wazopresyny i antagonistów α-adrenergicznych oraz zwiększają zdolność macicy do produkcji prostaglandyn [5]. Udowodniono, że produkcja estrogenów w trakcie ciąży rośnie [6, 7], w związku z czym można stwierdzić, że prawidłowy przebieg ciąży i jej zakończenie powodzeniem zależy od ilości hormonów estrogenowych wytwarzanych w jednostce płodowo-łożyskowej. Wysokie wartości stężeń tych hormonów świadczą o odpowiednim rozwoju płodu i przebiegu ciąży bez komplikacji. Z kolei obniżona ilość wytwarzanych estrogenów to czynnik sprawczy niektórych patologii ciąży. Synteza hormonów estrogenowych w jednostce płodowo-łożyskowej zachodzi przy udziale kompleksu aromatazy cytochromu P450 zlokalizowanego w komórkach trofoblastu łożyskowego [7-10]. Aromataza cytochromu P450 odpowiada za przyłączenie substratów i katalizowanie reakcji prowadzących do utworzenia charakterystycznego dla estrogenów pierścienia fenolowego A. Natomiast rolą reduktazy flawoproteinowej, również wchodzącej w skład kompleksu aromatazy, jest transport elektronów z NADPH na żelazo hemowe cytochromu P450 [9-11]. Obniżenie ilości estrogenów w jednostce płodowo-łożyskowej może być wynikiem zaburzonej ekspresji aromatazy cytochromu P450 w łożysku. Estrogeny wywierają biologiczne efekty w okresie ciąży na drodze interakcji z odpowiednimi receptorami estrogenowymi zlokalizowanymi w łożysku [6, 12-14]. Hormony oddziałują na organizm matki i płodu poprzez cytozolowe białka receptorowe pełniące funkcję czynników transkrypcyjnych. Ekspresja receptorów estrogenowych α i β w łożysku podczas ciąży na nieprawidłowym poziomie może stanowić kolejny czynnik sprawczy patologii ciąży. Zmniejszona ilość receptorów estrogenowych będzie wiązała się z zaburzeniem kaskady sygnałów, co w rezultacie doprowadzi do zminimalizowania korzystnych efektów biologicznych wywieranych przez te hormony. Łożysko jest bogatym źródłem zarówno aromatazy, jak i białkowych receptorów estrogenowych α i β [10, 12-14], dlatego istnieją przypuszczenia, że zmiany w ekspresji i/lub komórkowej lokalizacji tych białek mogą korelować z wystąpieniem porodu przedwczesnego. Celem pracy była ocena stopnia ekspresji i określenie immunolokalizacji aromatazy cytochromu P450 oraz receptorów estrogenowych α i β w łożyskach pochodzących z porodów terminowych i przedwczesnych. Materiał i metodyka Badaniem objęto grupę 10 kobiet rodzących pomiędzy 26 a 32 tygodniem ciąży, u których poród przedwczesny był konsekwencją nadciśnienia indukowanego ciążą. W grupie badanej wykluczono: wiek poniżej 18 lub powyżej 30 roku życia, wiek ciąży powyżej 33 tygodnia, ciąże powikłaną poronieniem (plamienia, krwawienia), ciąże mnogą, nieprawidłową lokalizację łożyska, istnienie chorób matki przed ciążą (nadciśnienie, cukrzyca), zaburzenia w rozwoju płodu oraz ciąże pochodzące z rozrodu wspomaganego. Grupę kontrolną stanowiło również 10 kobiet w wieku od 18 do 30 lat z prawidłowym przebiegiem ciąży, która trwała od 37 do 40 tygodni. Kobiety z grupy kontrolnej nie zażywały używek (nikotyna, alkohol), rodziły w terminie porodu, a poród został zakończony drogami rodnymi bez włączania amniotomii i farmakoterapii. Pacjentki tworzące grupę badaną i grupę kontrolną leczono w Katedrze i Klinice Endokrynologii Ginekologicznej Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach, w której przeprowadzono badanie kliniczne i hormonalne. Badanie uzyskało zgodę Komisji Bioetycznej Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach. Materiał badany stanowiły wycinki tkankowe o szerokości 1 cm pobierane z centralnych części łożysk podczas porodów. Wycinki tkanek po pobraniu utrwalano w 4% (v/v) roztworze paraformaldehydu w PBS o ph=7,4 w temperaturze 4 C przez 24 godziny. Następnie odwadniano je w szeregu alkoholowym o wzrastającym stężeniu etanolu: 50%, 70%, 95% i 100%. W kolejnym etapie, materiał przeprowadzono 3-krotnie przez ksylen, pozostawiając za każdym razem w ksylenie na 10 min, a następnie wycinki umieszczano w mieszaninie (1:1) ksylenu z parafiną i pozostawiano w temperaturze pokojowej do następnego dnia. W kolejnym etapie, tkankę umieszczano na 3 godziny w ciekłej parafinie o temperaturze nie wyższej niż 60 C, zmieniając parafinę po każdej pełnej godzinie. Tak przygotowane wycinki tkankowe ostatecznie zatapiano w bloczkach parafinowych. Preparaty mikroskopowe uzyskano poprzez krojenie bloczków parafinowych przy użyciu mikrotomu rotacyj-
nego na skrawki o grubości 5 μm, które naklejano na silanizowane szkiełka mikroskopowe. Z preparatów usuwano parafinę ogrzewając szkiełka w cieplarce w temperaturze 60 C przez 15 min. Dalsze odparafinowanie odbywało się w szeregu ksylenowym, przez który preparaty przeprowadzono 3-krotnie, pozostawiając za każdym razem w ksylenie na 10 minut. Nawodnienie tkanki osiągnięto dzięki przeprowadzeniu preparatów przez szereg alkoholowy o malejącym stężeniu. Zastosowano stężenia etanolu od absolutnego do alkoholu 30%. Szkiełka inkubowano przez 3 minuty w każdym ze stężeń etanolu. Ostatecznie preparaty płukano w wodzie destylowanej i buforze PBS o ph=7,4. W badanych preparatach łożysk wykonano przeglądowe topograficzne barwienie hematoksyliną i eozyną (HE). W analizowanych skrawkach tkankowych przeprowadzono reakcje immunohistochemiczne wykorzystując trójstopniową metodę ABC (avidin-biotin complex). Antygeny receptorów estrogenowych α i β uwidoczniono w procesie demaskacji, gotując skrawki w łaźni wodnej w roztworze do demaskacji o ph=9 (Dako, Dania) w temperaturze 95 C przez 40 minut. Antygeny aromatazy cytochromu P450 nie wymagały uwidocznienia w badanych tkankach. Po ostudzeniu, skrawki tkankowe płukano w buforze PBS i blokowano w nich aktywność endogennej peroksydazy przy użyciu 1,5% (v/v) roztworu H 2 O 2 w PBS (10 minut, temperatura pokojowa). Właściwą reakcję immunohistochemiczną poprzedzono inkubacją preparatów z nieimmunizowaną surowicą blokującą miejsca niespecyficznego wiązania przeciwciał z tkanką, pochodzącą od zwierzęcia, u którego wytworzono przeciwciała wtórne (30 minut, temperatura pokojowa). W przypadku zastosowania poliklonalnych przeciwciał pierwotnych nieimmunizowana surowica, a zarazem przeciwciało wtórne pochodziło od kozy, zaś w przypadku monoklonalnych przeciwciał pierwotnych nieimmunizowana surowica i przeciwciało wtórne pochodziło od konia. Po usunięciu surowicy na preparaty nałożono przeciwciała pierwotne. Wobec antygenów aromatazy zastosowano królicze przeciwciała poliklonalne (Abcam, Wielka Brytania). W celu przeprowadzenia reakcji na obecność antygenów receptorów estrogenowych α zastosowano mysie przeciwciała monoklonalne (Invitrogen, USA). Natomiast do detekcji antygenów receptorów estrogenowych β użyto króliczych przeciwciał poliklonalnych (Affinity BioReagents, USA). 20 godzinną inkubację preparatów z przeciwciałami pierwotnymi przeprowadzono w temperaturze 4 C. Technikę ABC wykonano za pomocą zestawu Vectastain ABC Kit (Vector Laboratories, USA) zgodnie z załączoną do zestawu instrukcją. Na preparaty tkankowe najpierw nałożono biotynylowane przeciwciała wtórne i inkubowano przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie kompleks awidyny-peroksydazy chrzanowej-biotyny i również poddano 30 minutowej inkubacji w temperaturze pokojowej. W celu wizualizacji powstałych kompleksów ABC zastosowano DAB jako chromogen oraz H 2 O 2. Inkubacja preparatów z DAB i H 2 O 2 w ciemności trwała, aż do pojawienia się reakcji barwnej. Tetrachlorek diaminobenzydyny w analizowanych preparatach tkankowych wybarwił na kolor brązowy te regiony komórki, w których znajdowały się poszukiwane antygeny. Następnie preparaty podbarwiono hematoksyliną Gilla, odwadniano i zamykano. Aby wyeliminować reakcje niespecyficzne, dla każdego z analizowanych preparatów wykonano równolegle kontrolę negatywną reakcji immunohistochemicznej, którą stanowiła inkubacja wycinków tkankowych bez przeciwciała pierwotnego. Celem sporządzenia dokumentacji fotograficznej badane preparaty łożysk fotografowano przy użyciu mikroskopu świetlnego firmy Nikon (Japonia, Precoptic Co., Polska) wyposażonego w kamerę cyfrową. Intensywność reakcji immunologicznej oceniano na podstawie 10 zdjęć wykonanych dla każdego z odczynów pod 200-krotnym powiększeniem (obiektyw x20 i okular - x10). Za pomocą mikroskopu świetlnego w badanych preparatach obserwowano powstałe odczyny immunohistochemiczne. Obserwacja pozwoliła na dokonanie oceny reakcji immunologicznej. Analizie poddano zarówno komórkową lokalizację badanych białek, jak również ich ilość po zastosowaniu komputerowej analizy obrazu. W polach preparatów mikroskopowych, w których zaobserwowano barwną reakcję immunohistochemiczną na wybrane białko, badano gęstości optyczną przy użyciu komputerowego programu KS300 (Carl Zeiss, Inc., Niemcy). Stopień absorbancji fali świetlnej o określonej długości mierzony w cytoplazmie komórek, w których wykryto kompleksy antygen-przeciwciało będące produktami reakcji immunohistochemicznej, świadczył o gęstości optycznej komórek. Dla wszystkich uzyskanych odczynów immunohistochemicznych w obrębie badanych preparatów mikroskopowych wykonano pomiary densytometryczne przy pomocy programu Image Pro Plus (Media Cybernetics, Inc., USA). Do obliczeń statystycznych posłużono się programem Statistica. W celu porównania rozkładów cech statystycznych zastosowano test Kołmogorowa-Smirnowa z poziomem istotności statystycznej przyjętym dla wartości p<0,01. Wykazano statystycznie znamienną różnicę pomiędzy rozkładem wszystkich analizowanych cech, a rozkładem normalnym, dlatego do opisu zmiennych wykorzystano medianę (zakres), a weryfikację hipotez przeprowadzono poprzez testy nieparametryczne. Porównań międzygrupowych dla poszczególnych zmiennych ilościowych dokonano za pomocą testów nieparametrycznych: Kruskala-Wallisa i U-Mann Whitney a. W przypadku uzyskania w teście Kruskala-Wallisa istotności statystycznej na poziomie p<0,05, zależności pomiędzy poszczególnymi cechami analizowano następnie z zastosowaniem testu U-Mann Whitney a. Wyniki Uzyskane wartości gęstości optycznych komórek wykazujących ekspresję aromatazy w łożyskach terminowych i przedwczesnych pozyskanych z centralnych części narządów przedstawiono w tabeli I. W części centralnej łożysk pochodzących z porodów przedwczesnych w grupie 26-32 tygodniowej gęstość optyczna komórek syncytiotrofoblastu z ekspresją aromatazy osiągnęła wartość wyższą w porównaniu z grupą kontrolną, osiągając poziom 150% kontroli. Analiza rozkładu ekspresji aromatazy w komórkach doczesnowych również wykazała wyższy poziom stężenia tego receptora w grupie łożysk 26-32 tygodniowych, w po-
Ryc. 1. Ekspresja aromatazy w centralnych częściach łożysk ludzkich pochodzących z porodów terminowych (A, C) i przedwczesnych (B, D) w syncytiotrofoblaście (A, B) i komórkach doczesnowych (C, D). Ryc. 2. Ekspresja receptorów estrogenowych α (ER-α) w centralnych częściach łożysk ludzkich pochodzących z porodów terminowych (A, C) i przedwczesnych (B, D) w syncytiotrofoblaście (A, B) i komórkach doczesnowych (C, D). równaniu z grupą kontrolną. Tym razem był to wzrost nieco niższy i stanowił 135% kontroli. Podobnie sytuacja kształtowała się w przypadku fibroblastów. W grupie łożysk 26-32 tygodniowych gęstość optyczna komórek z ekspresją aromatazy osiągnęła jednak tylko nieco wyższe wartości niż w grupie porodów terminowych. Lokalizacja aromatazy w badanych komórkach w obrębie części centralnych łożysk ograniczała się do cytoplazmy tych komórek. Nie zanotowano obecności produktów reakcji immunohistochemicznej w jadrach komórkowych. Ponadto nie zaobserwowano zmian w lokalizacji aromatazy w łożyskach z różnych przedziałów czasowych ciąż, tj. porodów między 26 a 32 tygodniem ciąży oraz porodów terminowych. Na rycinie 1 przedstawiono reprezentatywne zdjęcia fragmentów tkankowych centralnych części łożysk ludzkich pochodzących z porodów przedwczesnych i terminowych z ujawnionymi produktami reakcji immunohistochemicznej dla aromatazy w syncytiotrofoblaście i komórkach doczesnowych. Uzyskane wartości gęstości optycznych komórek wykazujących ekspresję receptora estrogenowego ER-α w łożyskach terminowych i przedwczesnych pozyskanych z centralnych części narządów przedstawiono w tabeli II. Oceniając poziom receptora ER-α w komórkach cytotrofoblastu wykazano, że w częściach centralnych łożysk gęstość optyczna produktu reakcji wyraźnie malała w miarę przebiegu ostatniej fazy ciąży, osiągając 155% wartości w grupie łożysk 26-32 tygodniowych w porównaniu z łożyskami z porodów terminowych. Analiza rozkładu ekspresji receptora ER-α w komórkach doczesnowych również wykazała wzrost stężenia tego receptora w grupie łożysk 26-32 tygodniowych, w porównaniu z grupą kontrolną, w której poziom ER-α był prawie trzykrotnie niższy niż w grupie doświadczalnej. W części centralnej łożysk pochodzących z porodów przedwczesnych gęstość optyczna komórek śródbłonkowych z ekspresją receptora estrogenowego ER-α osiągnęła wartości wyższe w porównaniu z grupą kontrolną. Łożyska przedwczesne cechowały się 270% poziomem ekspresji ER-α w porównaniu do kontroli. Gęstość optyczna produktu reakcji mierzona w fibroblastach charakteryzowała się tendencją wzrostową wraz ze wzrostem zaawansowania ciąży w jej fazie końcowej. W grupie łożysk 26-32 tygodniowych gęstość optyczna komórek z ekspresją receptora estrogenowego ER-α osiągnęła niższe wartości niż w grupie porodów terminowych, stanowiąc tylko 65% wartości grup z porodów terminowych. W częściach centralnych łożysk, pochodzących z porodów przedwczesnych między 26., a 32. tygodniem ciąży, gęstość optyczna produktu reakcji w komórkach Hofbauera wykazujących ekspresję receptora estrogenowego ER-α osiągnęła wartość wyższą w porównaniu z grupą porodów terminowych. W grupie badawczej obserwowano wzrost zawartości produktu reakcji na receptor estrogenowy ER-α, który kształtował się na poziomie poniżej 230% grupy kontrolnej. Również w części centralnej łożysk pochodzących z porodów przedwczesnych gęstość optyczna produktu reakcji na receptor estrogenowy ER-α ujawniona w komórkach syncytiotrofoblastu była wyższa w porównaniu z grupą porodów terminowych, i osiągała 130% wartości grupy kontrolnej. Lokalizację receptora estrogenowego ER-α w badanych komórkach w obrębie części centralnych łożysk pochodzących z porodów przedwczesnych i terminowych przedsta-
Ryc. 3. Ekspresja receptorów estrogenowych β (ER-β) w centralnych częściach łożysk ludzkich pochodzących z porodów terminowych (A, C) i przedwczesnych (B, D) w syncytiotrofoblaście (A, B) i komórkach doczesnowych (C, D). zujących ekspresję receptora estrogenowego ER-β w łożyskach terminowych i przedwczesnych pozyskanych z centralnych części narządów przedstawiono w tabeli IV. Oceniając poziom receptora ER-β w komórkach doczesnowych wykazano, że w częściach centralnych łożysk gęstość optyczna produktu w łożyskach grupy 26-32 tygodniowej była wyższa niż w łożyskach z porodów terminowych, osiągając około 140% kontroli. Analiza rozkładu receptora ER-β w częściach centralnej łożysk w komórkach śródbłonkowych wykazała tendencję do wzrostu stężenia tego receptora począwszy od łożysk 26-32 tygodniowych do łożysk terminowych. W grupie badawczej stwierdzono poziom 75% kontroli. Poziom receptora ER-β w fibroblastach był porównywalny w obu ocenianych grupach. Poziom receptora ER-β w komórkach Hofbauera w częściach centralnych łożysk w ocenionej serii badanej był istotnie niższy niż w kontroli, i osiągał tylko 70% poziomu grupy kontrolnej. W centrum łożysk z porodów między 26., a 32. tygodniem ciąży obserwowano nieco wyższą gęstość optyczną produktu reakcji w komórkach nabłonka owodni dla receptora estrogenowego ER-β w porównaniu do poziomu stwierdzonego w porodach terminowych. W częściach centralnych łożysk gęstość optyczna produktu reakcji na receptor estrogenowy ER-β ujawniona w komórkach syncytiotrofoblastu była podobna w grupie badanej i kontrolnej. Lokalizację receptora estrogenowego ER-β w badanych komórkach w obrębie części centralnych łożysk pochodzących z różnych przedziałów czasowych ciąż przedstawiono w tabeli V. Nie wykazano różnic w lokalizacji receptora ER-β w łożyskach pochodzących z porodów przedwczesnych i terminowych. Na rycinie 3 przedstawiono przykładowe zdjęcia fragmentów tkankowych centralnych części łożysk ludzkich pochodzących z porodów przedwczesnych i terminowych z obecnymi produktami reakcji immunohistochemicznej dla receptora ER-β. Dyskusja wiono w tabeli III. Nie zaobserwowano zmian w lokalizacji receptora ER-α w łożyskach z różnych przedziałów czasowych ciąż. Na rycinie 2 przedstawiono przykładowe zdjęcia fragmentów tkankowych centralnych części łożysk ludzkich pochodzących z porodów przedwczesnych i terminowych z obecnymi produktami reakcji immunohistochemicznej wobec receptora ER-α. Uzyskane wartości gęstości optycznych komórek wyka- Ekspresja aromatazy w łożyskach ludzkich w różnych przedziałach czasowych ciąż nie została do tej pory dogłębnie zbadana. Jako jedni z pierwszych zagadnieniem tym zajmowali się Fournet-Dulguerov i wsp. [15], którzy stwierdzili, że ekspresja aromatazy w łożysku w przebiegu ciąży nie ulega zmianie. Autorzy ci poddali analizie wyłącznie łożyska z pierwszego trymestru ciąży, w związku z czym wyniki ich pracy w odniesieniu do zmian stężenia aromatazy w przebiegu ciąży nie są w pełni wiarygodne. Tab. I. Gęstość optyczna aromatazy w komórkach z części centralnych łożysk ludzkich pochodzących z porodów przedwczesnych i terminowych Aromataza 26-32 tydzień ciąży Termin prawidłowy Komórki syncytiotrofoblastu 135,3 ± 11,8* 88,9 ± 9,1 Komórki doczesnowe 110,6 ± 9,1* 82,1 ± 7,7 Fibroblasty 181,8 ± 11,6* 157,5 ± 10,5 ( * ) - oznacza znamienność statystyczną pomiędzy kontrolą a grupą z porodu przedwczesnego dla poziomu istotności statystycznej p 0,05. Tab. II. Gęstość optyczna receptora ER-α w komórkach z części centralnych łożysk ludzkich pochodzących z porodów przedwczesnych i terminowych Receptor estrogenowy ER-α 26-32 tydzień ciąży Termin prawidłowy Komórki cytotrofoblastu 105,9 ± 21,3* 67,5 ± 9,6 Komórki doczesnowe 74,7 ± 9,6* 27,1 ± 6,9 Komórki śródbłonkowe 76,8 ± 13,3* 29,2 ± 7,9 Fibroblasty 51,5 ± 14,1* 78,3 ± 5,1 Komórki Hofbauera 103,7 ± 9,8* 45,5 ± 16,8 Komórki syncytiotrofoblastu 130,5 ± 9,1* 99,2 ± 7,2 ( * ) - oznacza znamienność statystyczną pomiędzy kontrolą a grupą z porodu przedwczesnego dla poziomu istotności statystycznej p 0,05.
Tab. III. Lokalizacja receptora ER-α w komórkach w obrębie części centralnych łożysk ludzkich pochodzących z porodów przedwczesnych i terminowych Fragment łożyska ER-α w jądrze komórkowym Podobne wyniki badań uzyskali Inkster i Brodie [7] oraz Kitawaki i wsp. [10]. Obydwa zespoły badawcze również analizowały zmiany ekspresji aromatazy w łożysku. Inkster i Brodie [7], pracując na zamrożonych wycinkach tkankowych łożysk pochodzących z pierwszego i trzeciego trymestru ciąży, wykazali brak zmian w ekspresji aromatazy wraz ze wzrostem zaawansowania ciąży. Podobnie Kitawaki i wsp. [10] nie zaobserwowali zmian w stężeniu i dystrybucji aromatazy w tkance łożyska. W ten sposób potwierdzili wcześniejsze doniesienia na temat stałego stężenia aromatazy w łożysku w przebiegu ciąży. ER-α w cytoplazmie Owodnia Fibroblasty + + Płyta kosmówkowa Pnie kosmkowe i kosmki Płyta podstawna Komórki cytotrofoblastu + - Komórki śródbłonkowe + - Komórki cytotrofoblastu + - Komórki śródbłonkowe + + Komórki zrębowe - + Komórki Hofbauera - + Komórki doczesnowe + + Fibroblasty + + Komórki cytotrofoblastu + - (+) oznacza obecność ER-α; (-) oznacza brak ER-α. Tab. IV. Gęstość optyczna receptora ER-β w komórkach z części centralnych łożysk ludzkich pochodzących z porodów przedwczesnych i terminowych Receptor estrogenowy ER-β 26-32 tydzień ciąży Termin prawidłowy Komórki doczesnowe 93,1 ± 9,6* 68,0 ± 11,4 Komórki śródbłonkowe 100,1 ± 25,6 133,1 ± 18,3 Fibroblasty 63,4 ± 10,1 62,1 ± 6,7 Komórki Hofbauera 66,4 ± 9,9* 91,8 ± 11,9 Nabłonek owodni 100,6 ± 11,4* 85,9 ± 8,2 Komórki syncytiotrofoblastu 84,7 ± 16,3 73,6 ± 11,3 ( * ) - oznacza znamienność statystyczną pomiędzy kontrolą a grupą z porodu przedwczesnego dla poziomu istotności statystycznej p 0,05. Tab. V. Lokalizacja receptora ER-β w komórkach w obrębie części centralnych łożysk ludzkich pochodzących z porodów przedwczesnych i terminowych Fragment łożyska Owodnia Płyta kosmówkowa Pnie kosmkowe i kosmki Płyta podstawna ER-β w jądrze komórkowym ER-β w cytoplazmie Nabłonek + - Fibroblasty + + Komórki syncytiotrofoblastu - + Komórki syncytiotrofoblastu - + Komórki śródbłonkowe + - Komórki Hofbauera - + Komórki doczesnowe + + Fibroblasty + + Komórki syncytitrofoblastu + - (+) oznacza obecność ER- ; (-) oznacza brak ER-. Wyniki badań własnych dotyczących aromatazy cytochromu P450 nie korelują z uprzednio przytoczonymi danymi. W przeciwieństwie do wyżej wymienionych autorów, w naszej pracy uzyskaliśmy podwyższoną ekspresję aromatazy w centralnej części łożysk przedwczesnych, tj. grupy między 26 a 32 tygodniem ciąży w porównaniu z łożyskami terminowymi. Uzyskane wyniki można tłumaczyć zwiększonym zapotrzebowaniem tkanki łożyska na hormony estrogenowe w trzecim trymestrze ciąży na skutek zmian morfologicznych zachodzących w centralnej części tego narządu. Aromataza cytochromu P450 jest kluczowym enzymem syntezy estrogenów, dlatego wzrost zapotrzebowania na estrogeny koreluje ze wzrostem ekspresji aromatazy w tkance łożyska. Przebudowa centralnej części łożyska może być stymulowana zmianami zachodzącymi w ustroju ciężarnej kobiety, u której stwierdzono nadciśnienie ciążowe. Udowodniono, że nadciśnienie ciążowe i biosynteza estrogenów są ze sobą ściśle związane. Bhansali i Eugere [16] badali komórkowe stężenia estradiolu i progesteronu w tkance łożyska u kobiet ciężarnych ze zdiagnozowanym nadciśnieniem tętniczym. W swojej pracy wykazali wzrost ilości hormonów estrogenowych w łożysku w przebiegu ciąży z nadciśnieniem. W pracy własnej nie oznaczaliśmy poziomu estrogenów w tkance łożyska, jednak na podstawie uzyskanych podwyższonych wartości białek: aromatazy i receptorów estrogenowych w łożyskach z porodów przedwczesnych indukowanych nadciśnieniem ciążowym w porównaniu z łożyskami terminowymi, możemy wnioskować, że nasze wyniki potwierdzają dane Bhansali i Eugere. Kitawaki i wsp. [10] w swojej pracy wykluczyli możliwość indukcji porodu przedwczesnego nadciśnieniem ciążowym. W związku z czym uzyskane przez nich wyniki ekspresji aromatazy w tkance łożyska odbiegają od naszych. Kitawaki i wsp. [10] oprócz analizy immunohistochemicznej wykonali również badania biochemiczne. Ocenie poddali aktywność aromatazy w łożyskach pochodzących z różnych przedziałów czasowych ciąż. Wyniki ich pracy wskazywały na wprost proporcjonalny wzrost aktywności aromatazy wraz ze wzrostem zaawansowania ciąży. Dane te odnajdują odzwierciedlenie w doniesieniach literaturowych głoszących, że zwiększona ilości estrogenów w późniejszych etapach ciąży wpływa na zachowanie dobrostanu płodu i matki. Odmienne wyniki badań immunohistochemicznych i biochemicznych Autorzy ci tłumaczyli z jednej strony mniejszą czułością testów immunohistochemicznych, a z drugiej powiększaniem łożyska i wzrostem ilości komórek w jego obrębie w miarę trwania ciąży. Ich zdaniem aktywności aromatazy w przebiegu ciąży nie zmienia się, a jej podwyższony poziom na późniejszych etapach ciąży wynika z proliferacji komórek w obrębie łożyska, w których białko to ulega ekspresji.
Obecność receptorów estrogenowych w tkankach ludzkich oceniana była przez wielu badaczy różnymi metodami, między innymi techniką RT-PCR, hybrydyzacji in situ, czy immunohistochemicznie. Badania te wykazały obecność receptorów estrogenowych zarówno w tkankach estrogenozależnych, jak i w tkankach nie uznawanych jako estrogenozależne, położonych poza narządem rodnym. Dokładne poznanie znaczenia receptorów estrogenowych w narządach i tkankach odległych pod względem funkcjonalnym od czynności rozrodczych jest ważne pod względem diagnostyczno-terapeutycznym dla wielu chorób kobiecych i męskich. W niniejszej pracy badano ekspresję receptorów ER-α i ER-β w łożyskach normalnych i urodzonych przedwcześnie przez kobiety obarczone nadciśnieniem tętniczym indukowanym ciążą. Wykazano, że poziom ER-α w łożyskach przedwczesnych jest wyraźnie wyższy niż w łożyskach prawidłowych, co koresponduje z doniesieniem Schiessl i wsp. [14]. Ta obserwacja dotyczy centralnej części łożyska. Wiadomo, że ER-α odgrywa ważną rolę w procesach proliferacji. Wysoki poziom tego receptora może świadczyć o zwiększonym zapotrzebowaniu na estrogeny, co być może jest związane z przebudową tej części łożyska. Podczas trzeciego trymestru ciąży, a w szczególności po 32 tygodniu ciąży, w łożysko mogą rozwijać się różnorakie nieprawidłowości określane często terminem starzenia się łożyska [14, 17, 18]. Nieprawidłowości te generalnie związane z degeneracją kosmków, jakkolwiek dotyczy to również zwłóknienia śródmiąższowego, czy obrzęku sinusoid kosmkowych [18-20]. Zwiększona proliferacja (dane niepublikowane) w tej części łożyska pośrednio może świadczyć o takich zmianach. Należy jednak pamiętać, że w ostatecznym dojrzewaniu komórek estrogenozależnych niezbędny jest udział receptora ER-β. W naszych badaniach wykazano wyraźnie wyższą ekspresje tego receptora w grupach badawczych niż w łożyskach prawidłowych. Wcześniej o podobnym spostrzeżeniu donosił Bukovsky i wsp. [12, 13], którzy ponadto wykazali unikalną rolę ER-β w regulacji funkcji łożyska. Ponieważ trofoblast jest głównym źródłem hormonów łożyskowych, to wysoka ekspresja receptorów ER-α i ER-β przez komórki trofoblastu może wiązać się ze stymulacją przez estrogeny produkcji hormonów łożyskowych. Szeroki zakres występowania receptora ER-β i jego obecność w narządach, które nie wykazują istnienia ER-α, a także w narządach, które do tej pory były uważane za nietypowe dla estrogenów, jak płuca, jelita, czy pęcherz moczowy, dowodzą, że ER-β nie jest jedynie powieleniem klasycznego receptora, lecz posiada swoiste do spełnienia funkcje. Dokładne poznanie znaczenia receptorów estrogenowych w narządach i tkankach odległych pod względem funkcjonalnym od czynności rozrodczych jest ważne pod względem diagnostyczno-terapeutycznym dla wielu, zarówno kobiecych jak i męskich, schorzeń. Obserwowana przeze mnie wzmożona immunoreaktywność ER-β, np. w komórkach doczesnowych, czy w nabłonku owodni nie jest niczym szczególnym. Taylor and Al.-Azzawa [15] obserwowali różny rozkład i ekspresję tego receptora w gruczole sutkowym w stanie spoczynkowym i w fazie proliferacji. Ten sam zespół wykazał, że w macicy ER-β stwierdzono w jądrach wszystkich komórek zrębu. Dowodzi to, że ER-β może mieć istotne znaczenie w rozwoju niektórych narządów. Jak sugeruje Bukovsky i wsp. [12, 13], a potwierdzają to nasze badania, receptor ER-α jest wystarczający dla podstawowego różnicowania tkanek estrogenowrażliwych. Brak receptora ER-β skutkuje defektami w morfologii tkanek ostatecznie zróżnicowanych i wskazuje, że ekspresja ER-β jest niezbędna do ostatecznego różnicowania komórek estrogenozależnych. Dotyczy to komórek cytotrofoblastu, komórek doczesnowych i komórek Hofbauera. Jeśli w łożyskach pochodzących z porodów przedwczesnych wystąpiły zmiany degeneracyjne, to wysoki poziom ekspresji ER-β w wymienionych komórkach może świadczyć o daleko zaawansowanych próbach naprawczych ze strony łożyska. Niniejsze badania dowodzą, że nie zawsze wysoki poziom estrogenów w tkance łożyska musi korelować z prawidłowo rozwijająca się ciążą i dobrostanem płodu. Uzyskanie w łożyskach przedwczesnych wyższej ekspresji białek warunkujących syntezę i funkcjonalność hormonów estrogenowych, tj. aromatazy oraz receptorów estrogenowych ER-α i ER-β, związane jest z patologią ciąży. Bamigboye i Morris [21] donoszą, że suplementacja estrogenami u kobiet z ciążą zagrożoną nie zapobiegała poronieniom. Istnieją także doniesienia literaturowe świadczące o wzroście ilości estrogenów w przebiegu ciąży obarczonej nadciśnieniem tętniczym [16] często prowadzącym do porodu przedwczesnego. Wnioski 1. Uzyskany wyższy poziom ekspresji aromatazy oraz receptorów estrogenowych ER-α i ER-β w częściach centralnych łożysk pochodzących z porodów przedwczesnych między 26 a 32 tygodniem ciąży w porównaniu z łożyskami z porodów terminowych może świadczyć o zwiększonym zapotrzebowaniu łożyska na estrogeny w trzecim trymestrze ciąży związanym z przebudową centralnej części tego narządu. 2. Ekspresja wyżej wymienionych białek na wysokim poziomie pomiędzy 26 a 32 tygodniem ciąży dowodzi, iż poród przedwczesny nie był bezpośrednio związany ze stężeniem analizowanych białek w łożysku. 3. Nie wykazano różnic w komórkowej lokalizacji aromatazy oraz receptorów estrogenowych ER-α i ER-β w centralnych częściach łożysk pochodzących z porodów przedwczesnych i terminowych, co przemawia za brakiem korelacji pomiędzy immunolokalizacją badanych białek w łożysku, a wystąpieniem porodu przedwczesnego. 4. Poród przedwczesny indukowany nadciśnieniem być może wiąże się ze wzrostem ilości hormonów estrogenowych w łożysku. Wniosek ten wymaga dalszego pogłębienia badań.
Piśmiennictwo 1. Chandiramani M, Tribe RM, Shennan AH. Poród przedwczesny i wcześniactwo. Położnictwo, Ginekologia, Medycyna rozrodu 2008; 2: 353-361. 2. Kubiak-Fortecka A, Wilczyński J. Ciąża i poród u kobiet w wieku dojrzałym. Przegl Menopauzalny 2009; 2: 667-671. 3. Soydemir F, Kenny L. Nadciśnienie tętnicze w ciąży. Położnictwo, Ginekologia, Medycyna rozrodu 2008; 1: 11-18. 4. Kaźmierczak W, Cholewa D, Fiegler P. Nadciśnienie tętnicze a czas trwania ciąży. Ginekol Prakt 2004; 12: 24-27. 5. Warenik-Szymankiewicz A, Męczekalski B. Czynniki hormonalne w etiopatogenezie porodu przedwczesnego. Endokrynol Pol 2004; 55: 800-802. 6. Takeyama J i wsp. Expression and cellular localization of estrogen receptors alpha and beta in the human fetus. J Clin Endocrinol Metab 2001; 86: 2258-2262. 7. Inkster SE, Brodie AM. Immunocytochemical studies of aromatase in early and full-term human placental tissues: comparison with biochemical assays. Biol Reprod 1989; 41: 889-898. 8. Milczarek R, Klimek J. Aromataza kluczowy enzym biosyntezy estrogenów. Post Biochem 2005; 51: 430-439. 9. Kowalewska-Łuczak I, Kmieć M, Terman A. Aromataza Cytochromu P450 kluczowy enzym syntezy estrogenów. Med Weter 2006; 62: 870-872. 10. Kitawaki J i wsp. Increasing aromatase cytochrome P-450 level in human placenta during pregnancy: studied by immunohistochemistry and enzyme-linked immunosorbent assay. Endocrinology 1992; 130: 2751-2757. 11. Conley A, Hinshelwood M. Mammalian aromatases. Reproduction 2001; 121: 685-695. 12. Bukovsky A i wsp. Expression and localization of estrogen receptor-alpha protein in normal and abnormal term placentae and stimulation of trophoblast differentiation by estradiol. Reprod Biol Endocrinol 2003; 1: 1-18. 13. Bukovsky A i wsp. Placental expression of estrogen receptor beta and its hormone binding variant comparison with estrogen receptor alpha and a role for estrogen receptors in asymmetric division and differentiation of estrogen-dependent cells. Reprod Biol Endocrinol 2003; 1: 1-21. 14. Schiessl B i wsp. Expression of endothelial NO synthase, inducible NO synthase, and estrogen receptors alpha and beta in placental tissue of normal, preeclamptic, and intrauterine growth-restricted pregnancies. J Histochem Cytochem 2005; 53: 1441-1449. 15. Fournet-Dulguerov N, MacLusky NJ, Leranth CZ, Todd R, Mendelson CR, Simpson ER, Naftolin F. Immunohistochemical localization of aromatase cytochrome P-450 and estradiol dehydrogenase in the syncytiotrophoblast of the human placenta. J Clin Endocrinol Metab 1987, 65(4): 757-764 16. Bhansali KG, Eugere EJ. Quantitative determination of 17 beta-estradiol and progesterone in cellular fractions of term placentae of normal and hypertensive patients. Res Commun Chem Pathol Pharmacol 1992; 77: 161-169. 17. Schneider H. Ontogenic changes in the nutritive function of the placenta. Placenta 1996; 17: 5-26. 18. Smith SC, Baker PN, Symonds EM. Placental apoptosis in normal human pregnancy. Am J Obstet Gynecol 1997; 177: 57-65. 19. Burton GJ i wsp. Stereological evaluation of vascular adaptations in human placental villi to differing forms of hypoxic stress. Placenta 1996; 17: 49-55. 20. Iwahashi M, Ooshima A, Nakano R. Increase in the relative level of type V collagen during development and ageing of the placenta. J Clin Pathol 1996; 49: 916-919. 21. Bamigboye AA, Morris J. Oestrogen supplementation, mainly diethylstilbestrol, for preventing miscarriages and other adverse pregnancy outcomes. Cochrane Database Syst Rev 2003; (3): CD004353 data otrzymania pracy: 06.12.2009 r. data akceptacji do druku: 26.01.2010 r. Adres do korespondencji: dr hab. Andrzej Plewka Zakład Proteomiki, Śląski Uniwersytet Medyczny ul. Ostrogórska 30 41-200 Sosnowiec, tel. : + 48 32 364 14 30 e-mail: aplewka@sum.edu.pl