(62) Numer zgłoszenia, z którego nastąpiło wydzielenie: (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/US02/023447

PL 220846 B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 220846 (21) Numer zgłoszenia: 398575 (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (22) Data zgłoszenia: 23.07.2002 (62) Numer zgłoszenia, z którego nastąpiło wydzielenie: 368535 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: 23.07.2002, PCT/US02/023447 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: 31.07.2003, WO03/061555 (51) Int.Cl. A61K 39/12 (2006.01) A61K 39/193 (2006.01) C12N 13/00 (2006.01) C12N 15/46 (2006.01) (54) Kompozycja szczepionki przeciwko zakażeniu wirusem Zachodniego Nilu (30) Pierwszeństwo: 27.07.2001, US, 60/308,334 (73) Uprawniony z patentu: ZOETIS W LLC., Florham Park, US (43) Zgłoszenie ogłoszono: 04.04.2005 BUP 07/05 (72) Twórca(y) wynalazku: HSIEN-JUE CHU, Fort Dodge, US (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 29.01.2016 WUP 01/16 (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Magdalena Tagowska

2 PL 220 846 B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest kompozycja szczepionki przeciwko zakażeniu wirusem Zachodniego Nilu. Niniejszym opisano także sposoby podawania takich szczepionek ssakom, w szczególności koniom. Wirus Zachodniego Nilu, znany jako Flavivirus, zidentyfikowano po raz pierwszy w 1937 r. w Afryce i wykryto po raz pierwszy w Ameryce Północnej w 1999 r. Za główną przyczynę rozprzestrzeniania się zakażenia wewnątrz i pomiędzy krajami uważa się migrujące ptaki. Wirus jest przenoszony przez komary, które zakaziły się żerując na ptakach z wiremią. Następnie wirus namnaża się podczas okresów żywienia się dorosłego komara krwią. Następnie zakażone komary przekazują wirusa ludziom i zwierzętom, na których żerują. Wirus Zachodniego Nilu jest czynnikiem wywołującym chorobę wirusową Zachodniego Nilu, w szczególności zapalenie mózgu Zachodniego Nilu, w przeważającej większości u ludzi, innych ssaków i ptaków. Główny problem stanowi brak skutecznego leczenia choroby wywołanej przez wirusa Zachodniego Nilu. Poza lekami przeciwzapalnymi stosowanymi do zwalczania obrzęku tkanek ośrodkowego układu nerwowego, nie ma innego dostępnego działania medycznego. Nie ma także znanej dostępnej szczepionki zapobiegającej zakażeniu. Jedynym środkiem kontrolowania wirusa Zachodniego Nilu było do tej pory zapobieganie kontaktom z nosicielami. Naukowcy sądzą, że wirus Zachodniego Nilu przechodzi ten sam wzór zakażenia, który wykryto dla innych wirusów przenoszonych przez komary. Kiedy zakażony komar gryzie koniowatego, wirus dostaje się do skóry lub tkanek tuż poniżej miejsca ugryzienia, skąd przedostaje się do układu krążenia. Wirus może się namnażać we krwi i u koniowatego może wystąpić gorączka, która często nie jest wykrywana, ponieważ w tym czasie nie ma innych objawów choroby. Jednakże, kiedy wirus dokonuje inwazji układu nerwowego, objawy kliniczne pojawiają się w ciągu jednego do trzech dni. Najbardziej narażone koniowate, takie jak konie, wykazują najpierw objawy osłabienia lub paraliżu tylnego i złą koordynację. Zmianom fizycznym może towarzyszyć depresja i związane z nią zmiany zachowania. W poważnych przypadkach mogą rozwijać się drżenia, konwulsje, przebieranie kończynami i paraliż. Obserwowano również poważne problemy neurologiczne i zgony. Dotychczas nie jest dostępna szczepionka zapobiegająca zakażeniu wirusem Zachodniego Nilu u koniowatych i jedynym środkiem kontroli występowania wirusa Zachodniego Nilu jest zapobieganie kontaktowi z nosicielem. Dlatego też istnieje zapotrzebowanie na bezpieczne i skuteczne środki kontrolowania rozprzestrzeniania się wirusa Zachodniego Nilu u ssaków i ptaków. W szczególności istnieje zapotrzebowanie na szczepionkę, głównie do podawania koniowatym, wystarczająco bezpiecznej do podawania nawet ciężarnym klaczom, bez działań niepożądanych. Potrzebna jest również szczepionka nadająca się do zapobiegania lub łagodzenia objawów choroby wywołanej przez wirusa Zachodniego Nilu, zwłaszcza w zapaleniu mózgu Zachodniego Nilu, u koniowatych i innych ssaków. Przedmiotem wynalazku jest kompozycja szczepionki, która obejmuje: skutecznie immunizującą ilość plazmidowego DNA Zachodniego Nilu, przy czym plazmidowe DNA stanowi pcbwn, ulegający metabolizmowi olej, korzystnie olej SP, w immunogennie stymulującej ilości, oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik. Korzystnie ulegający metabolizmowi olej jest obecny w kompozycji według wynalazku w ilości od około 4% do 10% obj./obj., korzystniej w ilości około 5% obj./obj. Ponadto kompozycja obejmuje korzystnie składnik szczepionki skierowany przeciwko wirusowi wścieklizny, wirusowi Wschodniego końskiego zapalenia mózgu, wirusowi Zachodniego końskiego zapalenia mózgu, wirusowi Wenezuelskiego końskiego zapalenia mózgu, końskiemu wirusowi opryszczki, Ehrlichia risticii, Streptococcus equi, anatoksynie tężca, wirusowi końskiej grypy (EIV). W korzystnej postaci wykonania taki składnik szczepionki jest skierowany przeciwko końskiemu wirusowi opryszczki, a korzystniej stanowi EHV-1 lub EHV-4. Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja szczepionki obejmująca: a) plazmidowy DNA Zachodniego Nilu, przy czym plazmidowe DNA stanowi pcbwn; oraz b) około 4% do 10% obj./obj. adiuwanta z ulegającego metabolizmowi oleju obejmującego około 1 do 3% kopolimeru blokowego polioksyetyleno-polioksypropylenowego, około 2 do 6% skwalanu i około 0,1 do 0,5% monooleinianu polioksyetylenosorbitolu. Wynalazek dotyczy także szczepionki wirusa Zachodniego Nilu dla koniowatych obejmującej: a) plazmidowy DNA Zachodniego Nilu, przy czym plazmidowe DNA stanowi pcbwn; oraz

PL 220 846 B1 3 b) co najmniej około 1% obj./obj. adiuwanta zawierającego ulegający metabolizmowi olej, korzystnie olej SP, i co najmniej jeden czynnik zwilżający lub dyspergujący. Korzystnie szczepionka według wynalazku jest sformułowana w dwóch jednostkach dawki. Również korzystnie szczepionka według wynalazku zawiera co najmniej około 4% adiuwanta, a korzystniej około 4% do 10% adiuwanta. W korzystnej postaci wynalazku szczepionka według wynalazku zawiera co najmniej dwa czynniki zwilżające lub dyspergujące. Korzystniej czynnik zwilżający lub dyspergujący jest wybrany z grupy składającej się z niejonowych środków powierzchniowo czynnych, najkorzystniej z grupy składającej się z kopolimerów blokowych polioksyetylen/polioksypropylen i estrów polioksyetylenowych. Przedmiotem wynalazku jest kompozycja szczepionki wirusa Zachodniego Nilu obejmująca plazmidowy DNA Zachodniego Nilu, przy czym plazmidowe DNA stanowi pcbwn, w ilości około 50 do 3000 mikrogramów na dawkę, korzystnie około 100 do 1000 mikrogramów na dawkę, a najkorzystniej około 100 do 250 mikrogramów na dawkę, i immunogennie stymulującą ilość ulegającego metabolizmowi oleju. Szczegółowy opis wynalazku Ogólnie problem z projektowaniem nowej szczepionki polega na tym, że szczepionka z żywym wirusem może być potencjalnie niebezpieczna dla danego gospodarza, który jest jej celem i że szczepionka z zabitym lub inaktywowanym wirusem może potencjalnie nie posiadać zdolności do stymulowania wystarczająco skutecznej odpowiedzi immunologicznej. Aby otrzymać możliwą do przyjęcia skuteczność, w kompozycji szczepionki stosuje się powszechnie adiuwant lub immunogennie stymulujący składnik w połączeniu z zabitym lub inaktywowanym wirusem. Jednakże bezpieczeństwo gospodarza, który jest celem szczepionki, jest często zmniejszone przez dodawanie adiuwanta. Na przykład, okazywało się wielokrotnie, że ciężarne zwierzęta mają znacząco wyższy wskaźnik poronień po podawaniu szczepionki z zabitego lub inaktywowanego wirusa zawierającej adiuwant. Wiadomo obecnie, że kiedy używa się odpowiedniego adiuwanta np. metabolizowanego oleju, takiego jak olej SP, w połączeniu z immunogennie czynnym składnikiem jak tutaj opisywany, to wypadkowa kompozycja szczepionki przeciw wirusowi Zachodniego Nilu jest bezpieczna w użyciu i jest szczególnie użyteczna u koniowatych, zwłaszcza u koni, a nawet u ciężarnych klaczy, gdzie także wykazywała skuteczność. Dlatego też wynalazek osiąga współtowarzyszące sobie cele skutecznej immunizacji i bezpieczeństwa, zwłaszcza u zwierząt ciężarnych. Bezpieczna i skuteczna kompozycja szczepionki może obejmować: immunogennie czynny składnik wybrany z grupy zawierającej żywego atenuowanego, inaktywowanego lub zabitego całego wirusa Zachodniego Nilu lub jego podjednostkę, antygen pochodzący z omawianego wirusa, DNA pochodzący z omawianego wirusa, plazmidowy DNA wirusa Zachodniego Nilu, plazmid ze wstawkami sekwencji omawianego wirusa, oraz ich mieszaninę; adiuwant i ewentualnie farmaceutycznie dopuszczalny nośnik. Kompozycja szczepionki może być podawana bezpiecznie i skutecznie ssakom i ptakom, w szczególności koniowatym, takim jak konie, osły, osłowate itd. Kompozycja szczepionki jest w szczególności odpowiednia dla koni w celu zapobiegania lub łagodzenia objawów choroby wywołanej przez wirusa Zachodniego Nilu, takiej jak zapalenie mózgu. DNA pochodzący z wirusa Zachodniego Nilu można otrzymać poprzez jego izolację z takich źródeł jak płyny lub tkanki gatunków należących do koniowatych lub ptaków, u których zdiagnozowano zapalenie mózgu Zachodniego Nilu. Źródła te obejmują płyn mózgowo-rdzeniowy lub partie rdzenia kręgowego lub mózgu. DNA można również otrzymać stosując inne dostępne techniki, jak technologia plazmidowa. Na przykład, odpowiednie komórki organizmu, np. E. coli, można poddać transformacji plazmidem zawierającym wstawki sekwencji kodujące białko wirusa Zachodniego Nilu w celu otrzymania komórek wyjściowych (ang. master seed). Komórki wyjściowe mogą być następnie hodowane i pasażowane. Komórki poddane transformacji, zawierające DNA wirusa Zachodniego Nilu, można następnie zbierać oraz izolować i otrzymywać DNA stosując techniki dostępne specjalistom w dziedzinie. Całego wirusa Zachodniego Nilu lub jego podjednostkę można izolować z zakażonych zwierząt stosując tradycyjne techniki. Próbki wirusa mogą być również pozyskiwane ze zbiorów hodowli tkankowych, utrzymujących depozyt organizmów, takich jak wirus Zachodniego Nilu. W American Type Culture Collection (ATCC), na przykład, wirus Zachodniego Nilu jest zdeponowany pod numerami ATCC VR-82, VR-1267 i VR-1267 AF. Całego wirusa Zachodniego Nilu lub jego podjednostkę można użyć w postaci żywego atenuowanego wirusa, jednakże korzystniej w postaci zabitego lub inaktywowanego tradycyjnymi środkami inaktywującymi, na przykład chemiczną inaktywacją, stosując chemiczne środki inaktywujące, takie jak

4 PL 220 846 B1 podwójna etylenoimina, beta-propiolakton, formalina, aldehyd glutarowy, dodecylosiarczan sodowy lub podobne, lub ich mieszanina, najkorzystniej formalina. Omawianego wirusa można również inaktywować za pomocą ogrzewania lub psoralenu w obecności światła ultrafioletowego. Atenuację uzyskuje się tradycyjnymi metodami. Cały wirus Zachodniego Nilu lub jego podjednostkę można utrzymywać lub hodować w mózgach mysich lub w odpowiednich podłożach hodowli tkankowych, takich jak podłoża optimem (LTI, Grand Island, NY) lub MEM, lub w komórkach znanych w dziedzinie, takich jak komórki nerkowe szarej małpy afrykańskiej (ang. African green monkey kidney cells) (komórki Vero) lub komórki osesków chomika (BHK, ang. baby hamster cells), korzystnie w komórkach Vero. Omawianego wirusa można następnie oddzielać od hodowli tkankowej lub podłoża komórkowego stosując tradycyjne techniki, takie jak wirowanie, filtrowanie lub podobne. Korzystny izolat wirusa Zachodniego Nilu można otrzymać z National Veterinary Services Laboratory (część Departamentu Rolnictwa Stanów Zjednoczonych) w Ames, IA, jako szczep VM-2. Szczep wirusa można oczyszczać z łysinek do trzech razy i pasażować do X + 5 w komórkach Vero. W użytym tu znaczeniu termin immunogennie czynny"/ immunogennie aktywny" określa zdolność do stymulowania odpowiedzi immunologicznej, tj. do stymulowania wytwarzania przeciwciał, zwłaszcza przeciwciał humoralnych lub do stymulowania odpowiedzi komórkowej. Na przykład, zdolność do stymulowania wytwarzania krążących lub wydzielniczych przeciwciał lub wytwarzania odpowiedzi komórkowej na miejscowych obszarach śluzówki (np. śluzówka jelit), we krwi obwodowej, płynie mózgowo-rdzeniowym lub podobnych. Ilość czynnego immunogennie składnika, która jest skuteczna i immunizująca, może być różna i jest dowolną ilością, wystarczającą do wywołania odpowiedzi immunologicznej i nadania immunologicznej ochrony przeciwko chorobie wywoływanej przez wirusa Zachodniego Nilu. Ilość immunogennie czynnego składnika na dawkę jednostkową to korzystnie co najmniej około 1 x 10 4 TCID 50, korzystnie od około 1 x 10 4 TCID 50 do około 10 9 TCID 50, korzystniej co najmniej około 1 x 10 6 TCID 50, zwłaszcza 10 6 do 10 7 TCID 50 (korzystnie co najmniej około 1 x 10 7 ). Ilości te są stosowne dla zabitego lub inaktywowanego całego wirusa lub jego podjednostki lub antygenu lub DNA z niego pochodzącego lub ich mieszaniny. W szczególności pożądane jest, użycie w kompozycji szczepionki według wynalazku co najmniej około 5 x 10 7 TCID 50 zabitego lub inaktywowanego całego wirusa Zachodniego Nilu lub jego podjednostki lub antygenu lub DNA z niego pochodzącego lub ich mieszaniny. Rozważane jest, że w jednej jednostce dawki kompozycji szczepionki można wykorzystać około 50 do 3000 mikrogramów (μg lub 10-6 gramów) plazmidowego DNA wirusa Zachodniego Nilu. Bardziej korzystnie można wykorzystać około 100 do 1000 μg, a najbardziej korzystnie 100 do 250 μg DNA plazmidowego. Jako schemat szczepień rozważana jest tutaj co najmniej jedna dawka jednostkowa na zwierzę. Szczególnie użyteczne mogą być dwie lub większa liczba jednostek dawki. Dawka jednostkowa może typowo zawierać około 0,1 do 10 mililitrów kompozycji szczepionki, korzystnie około 0,5 do 5 mililitrów, a jeszcze bardziej korzystnie około 1 do 2 mililitrów, z każdą dawką jednostkową zawierającą uprzednio opisaną ilość wirusa lub składnika wirusowego. Specjalista w dziedzinie zauważy, że określona ilość kompozycji szczepionki na dawkę jednostkową, jak również ogólna liczba jednostek dawki w schemacie szczepienia, może być optymalizowana tak długo, jak zwierzęciu dostarczana jest skutecznie immunizująca ilość wirusa lub jego składnika. Kompozycja szczepionki według wynalazku przeciw wirusowi Zachodniego Nilu zawiera jeden lub więcej adiuwantów. W użytym tu znaczeniu termin adiuwant odnosi się do każdego składnika, który poprawia odpowiedź na szczepionkę lub immunogen. Typowo adiuwant obejmuje około 0,1 do 50% obj./obj. kompozycji szczepionki według wynalazku, korzystnie około 1 do 50% obj./obj. szczepionki, bardziej korzystnie około 1 do 20%, zwłaszcza 1 do 10% obj./obj. Jeszcze bardziej korzystne są ilości około 4 do 10%. Odpowiednie adiuwanty zawierają immunostymulujące oleje, takie jak pewne ulegające metabolizmowi oleje. Ulegające metabolizmowi oleje odpowiednie do użycia w kompozycji według wynalazku obejmują zarówno emulsje olejowe, np. olej SP (opisany dalej), Emulsigen (MPV Laboratories, Ralston, NZ), Montanide 264,266,26 (Seppic S.A. Paryż, Francja), a także olej arachidowy (z orzeszków ziemnych) i inne oleje powstałe na bazie roślinnej, skwalan (olej z wątroby rekina) lub inne metabolizowane oleje, dla których można pokazać, że są odpowiednie jako adiuwanty w weterynaryjnej praktyce szczepień.

PL 220 846 B1 5 Adiuwant oprócz ulegającego metabolizmowi oleju może być kompozycją obejmującą dodatkowo jeden lub więcej czynników zwilżających lub dyspergujących w ilości około 0,1 do 25%, bardziej korzystnie około 1 do 10% i jeszcze bardziej korzystnie około 1 do 3% objętości adiuwanta. Szczególnie korzystnymi czynnikami zwilżającymi lub dyspergującymi są niejonowe środki powierzchniowo czynne. Użyteczne niejonowe środki powierzchniowo czynne obejmują kopolimery blokowe polioksyetyleno-polioksypropylenowe, zwłaszcza te sprzedawane pod znakiem towarowym PLURONIC i dostępne w BASF Corporation (Mt. Olive, NJ). Inne użyteczne niejonowe środki powierzchniowo czynne obejmują estry polioksyetylenowe, takie jak monooleinian polioksyetylenosorbitolu, dostępny pod znakiem towarowym TWEEN 80. Jako część kompozycji szczepionki według wynalazku w adiuwancie pożądane może być włączenie więcej niż jednego, np. co najmniej dwóch, czynników zwilżających lub dyspergujących. Inne składniki adiuwanta mogą obejmować takie składniki konserwujące jak formalina i tiomersal, w ilościach do około 1% obj./obj. adiuwanta. Szczególnie korzystnym adiuwantem jest olej SP. Określenie olej SP, używane w opisie i przykładach, oznacza emulsję olejową obejmującą kopolimer blokowy polioksyetyleno-polioksypropylenowy, skwalan, monooleinian polioksyetylenosorbitolu i buforowany roztwór soli. Ogólnie emulsja olejowa SP zawiera około 1 do 3% obj./obj. kopolimeru blokowego, około 2 do 6% obj./obj. skwalanu, bardziej korzystnie około 3 do 6% obj./obj. skwalanu i około 0,1 do 0,5% obj./obj. monooleinianu polioksyetylenosorbitolu, przy czym resztę stanowi buforowany roztwów soli. Kiedy w kompozycji szczepionki według wynalazku jako adiuwant są wykorzystywane immunogennie stymulujące ilości oleju SP, mogą się one różnić w zależności od immunogennie aktywnego składnika, stopnia potencjalnej ekspozycji na zakażenie, metody podawania kompozycji szczepionki, wieku i rozmiaru koniowatego lub im podobnych. Ogólnie, odpowiednie są ilości około 1 do 50% obj./obj. kompozycji szczepionki, korzystnie około 4 do 10% obj./obj. i bardziej korzystnie około 4 do 5% obj./obj. oleju SP. Farmaceutycznie (lub farmakologicznie) dopuszczalnym nośnikiem, odpowiednim do wykorzystania w kompozycji szczepionki według wynalazku może być każdy konwencjonalny ciekły nośnik, odpowiedni do farmaceutycznych kompozycji weterynaryjnych, korzystniej zrównoważony roztwór soli lub inny roztwór na bazie wody, odpowiedni do stosowania w podłożach hodowli tkankowych. Wykorzystywane mogą być również inne dostępne nośniki. Dodatkowe dostępne w dziedzinie zaróbki mogą być również włączone w kompozycję szczepionki, zgodnie z różnymi wykonaniami opisanymi wcześniej. Można na przykład wykorzystać związki modyfikujące ph. Składniki kompozycji szczepionki według wynalazku, jak to opisano wcześniej, włączając nośnik, mogą być łączone razem za pomocą dostępnych technik. Dodatkowo rozważa się, że oprócz immunogennie czynnego składnika wirusa Zachodniego Nilu, jak to opisano powyżej, kompozycja szczepionki jako czynny składnik może również zawierać inne czynne składniki, takie jak antypatogenny składnik skierowany przeciw wirusowi wścieklizny, wirusowi Wschodniego zapalenia mózgu koniowatych, wirusowi Zachodniego zapalenia mózgu k o- niowatych, wirusowi Wenezuelskiego zapalenia mózgu koniowatych, wirusowi opryszczki koniowatych, takiego jak EHV-1 lub EHV-4, Ehrlichia risticii, Streptococcus equi, anatoksynie tężca, wirusowi grypy koniowatych (EIV), wirusowi Wschodniego, Zachodniego i Wenezuelskiego zapalenia nosa i płuc lub podobnym lub ich kombinacjom. Ilości jednego lub większej liczby tych wirusów mogą być określone na podstawie ich skuteczności opisanej w literaturze z dziedziny lub przy zastosowaniu dostępnych technik. W jednym z wykonań wynalazku immunogennie czynny składnik wynalazku może być wprowadzony do liposomów przy zastosowaniu znanej technologii, którą opisano w Nature, 1974, 252, 252 254 lub w Journal of Immunology, 1978, 120, 1109 13. W innym wykonaniu wynalazku immunogennie czynny składnik może być skoniugowany z odpowiednimi biologicznymi składnikami, takimi jak polisacharydy, peptydy, białka lub podobnymi lub ich kombinacją. W korzystnym wykonaniu wynalazku, kompozycja szczepionki według wynalazku może być wytworzona w formie dawki jednostkowej, jak to wcześniej opisano, aby ułatwić podawanie i zapewnić jednolitość dawkowania. Preparat może być wytworzony przy zastosowaniu dostępnych technik, takich jak te dające się zastosować do przygotowania emulsji.

6 PL 220 846 B1 Kompozycję szczepionki według wynalazku można podawać pozajelitowo, na przykład domięśniowo, podskórnie, dootrzewnowo, śródskórnie lub podobnie, korzystnie domięśniowo; lub omawianą kompozycję można podawać doustnie lub donosowo. Niniejszym opisano także sposób zapobiegania lub łagodzenia objawów zapaleniu mózgu Zachodniego Nilu u koniowatych, korzystnie u koni, który obejmuje podawanie omawianym koniowatym bezpiecznej kompozycji szczepionki, jak to powyżej opisano. W rzeczywistej praktyce, kompozycję szczepionki według wynalazku podaje się pozajelitowo, podskórnie, doustnie, donosowo lub innymi dostępnymi sposobami, korzystnie dootrzewnowo, bardziej korzystnie domięśniowo, w skutecznych ilościach zgodnie z planem, który można ustalić na podstawie przewidywanego czasu potencjalnej ekspozycji na nosiciela wirusa Zachodniego Nilu. W ten sposób, leczone zwierzę może mieć czas na budowanie odporności przed naturalną ekspozycją. Jako nieograniczający przykład, typowy plan postępowania lub schemat dawkowania może zawierać podawanie pozajelitowe, korzystniej wstrzyknięcie domięśniowe jednej dawki jednostkowej, co najmniej około 2 8 tygodni przed potencjalną ekspozycją. Korzystne jest co najmniej dwukrotne podawanie, na przykład jedna dawka jednostkowa około 8 tygodni przed potencjalną ekspozycją na wirusa i druga dawka jednostkowa około 3 5 tygodni przed potencjalną ekspozycją leczonego zwierzęcia. Jak opisano wcześniej, typowo dawka jednostkowa będzie w zakresie około 0,1 do 10 mililitrów kompozycji szczepionki zawierającej ilości czynnika czynnego i procentowe ilości adiuwanta i czynnika nieaktywnego(ych), jak opisano wcześniej. Bardziej korzystna jest być może dawka jednostkowa w zakresie około 0,5 do 5 mililitrów, a szczególnie korzystna w zakresie około 1 do 2 mililitra(ów). Dla lepszego zrozumienia wynalazku przestawiono poniżej następujące przykłady. Przykłady te jedynie ilustrują i zrozumiałym jest, że w żaden sposób nie ograniczają zakresu lub podstawowych zasad wynalazku. Faktycznie różne modyfikacje wynalazku, dodatkowe do tych pokazanych i opisanych tutaj, staną się oczywiste dla specjalistów w dziedzinie po następujących przykładach i powyższym opisie. Modyfikacje te również mieszczą się w zakresie załączonych zastrzeżeń. P r z y k ł a d 1 Przygotowanie szczepionki A) Przygotowanie oleju SP Opis składnika Objętość Kopolimer blokowy polioksyetyleno-polioksypropylenowy 20,0 ml (Pluronic L121, BASF, Mt. Olive, NJ) Skwalan (Kodak, Rochester, NY) 40,0 ml Monooleinian polioksyetylenosorbitolu (Tween 80, 3,2 ml Sigma Chemical, St. Louis, MO) Buforowany roztwór soli (roztwór D-V PBS, wolny od Ca i Mg) 936,8 ml Składniki miesza się i homogenizuje do czasu uzyskania stabilnej masy lub emulsji. Składniki lub mieszaninę można autoklawować przed homogenizacją. Emulsję można później sterylizować przez filtrację. Można dodać formalinę do stężenia końcowego 0,2%. Można dodać tiomersal do końcowego rozcieńczenia 1:10000. B) Przygotowanie szczepionki Izolat wirusa Zachodniego Nilu z koniowatego, otrzymany z USDA w AMES, IA (Lot No. VM-2, Equine Origin, 1999 izolat północno-amerykański, drugi pasaż w hodowli komórek VeroM), hodowano w licznych hodowlach komórek Vero w pożywce do hodowli tkankowej OptiMEM (LTI, Grand Island, NY) w temp. 37 C. Ustalano miano zebranego materiału, a następnie inaktywowano go za pomocą dodania 10% roztworu formaliny do końcowego stężenia 0,1%. Inaktywację prowadzi się w temp. 37 C przez okres nie krótszy niż 144 godziny. Następnie dodawana jest 0,1% formalina i przeprowadzana jest inkubacja w temp. 37 C przez kolejny okres nie krótszy niż 144 godz. Szczepionki są przygotowywane poprzez zawieszanie odpowiedniej objętości płynu z inaktywowanym wirusem w 1 20% objętościowych oleju SP na 1 ml dawki. P r z y k ł a d 2 Ocena odpowiedzi przeciwciał na domięśniowe wstrzyknięcie badanej szczepionki W ocenie tej, konie podzielono w sposób losowy na cztery grupy: pierwszej grupie, złożonej z dwudziestu koni, podano badaną szczepionkę w dawce 1 x 10 7 TCID 50 (dawka zakażająca hodowlę tkankową, ang. Tissue Culture Infectious Dose), drugiej grupie, złożonej z dwudziestu koni, podano badaną szczepionkę w dawce 5 x 10 7 TCID 50, trzeciej grupie, złożonej z pięciu koni, podano badaną

PL 220 846 B1 7 szczepionkę w dawce 1 x 10 8 TCID 50, a czwartą grupę, złożoną z ośmiu koni, pozostawiono jako nieszczepioną kontrolę środowiskową. Konie traktowane otrzymywały pierwszą dawkę szczepionki zgodnie z grupą, do której zostały przypisane. Po dwudziestu jeden dniach od podania pierwszej dawki, podano drugą dawkę tej samej szczepionki. Wszystkim koniom pobierano krew w celu uzyskania surowicy w czasie podawania pierwszej i drugiej dawki oraz w odstępach tygodniowych przez 28 dni po podaniu drugiej dawki. Badana szczepionka A Składnik Stężenie/dawka Objętość/ml Inaktywowany wirus Zachodniego Nilu 1 x 10 7 TCID 50 0,0347 ml MEM 1 nie dotyczy 0,9138 ml Olej SP 5% 0,0500 ml Polimyksyna B 2 30,0 μg/ml 0,003 ml Neomycyna 30,0 μg/ml 0,003 ml Tiomersal (5%) 1:20000 0,0010 ml Badana szczepionka B Składnik Stężenie/dawka Objętość/ml Inaktywowany wirus Zachodniego Nilu 5 x 10 7 TCID 50 0,1734 ml MEM nie dotyczy 0,7752 ml Olej SP 5% 0,0500 ml Polimyksyna B 2 30,0 μg/ml 0,0002 ml Neomycyna 3 30,0 μg/ml 0,0002 ml Tiomersal 4 (5%) 1:20000 0,0010 ml Badana szczepionka C Składnik Stężenie/dawka Objętość/ml Inaktywowany wirus Zachodniego Nilu 1 x 10 8 TCID 50 0,0367 ml MEM 1 nie dotyczy 0,6019 ml Olej SP 5% 0,0500 ml Polimyksyna B 2 30,0 μg/ml 0,0002 ml Neomycyna 3 30,0 μg/ml 0,0002 ml Tiomersal 4 (5%) 1:20000 0,0010 ml 1 LTI, Grand Island, NY 2 Sigma, St. Louis, MO 3 Sigma, St. Louis, MO 4 Sigma, St. Louis, MO Otrzymane dane serologiczne przedstawiono w poniższej Tabeli 1, w której 0 DPV 1 oznacza dzień 0 przed szczepieniem: a 14 DPV 2 oznacza dzień 14 po szczepieniu. NR oznacza brak wyników. Jak widać z danych zamieszczonych w Tabeli 1, traktowane konie ze wszystkich grup wykazały znaczący wzrost poziomu przeciwciał przeciw wirusowi Zachodniego Nilu, podczas gdy u koni kontrolnych poziom przeciwciał pozostał niski lub nie stwierdzono ich występowania. Poziom odp o- wiedzi u koni, które otrzymały szczepionkę był niezależny od poziomu antygenu w szczepionce, którą otrzymały. Badana szczepionka Dawka (TCID 50) T a b e l a 1 Badanie nr 1 Badanie nr 2 0DPV1 14DPV2 0DPV1 14DPV2 1 2 3 4 5 6 A 1 x 10 7 < 10 160 < 10 80 A 1 x 10 7 < 10 20 < 10 10 A 1 x 10 7 < 10 320 < 10 40 A 1 x 10 7 < 10 80 < 10 320 A 1 x 10 7 < 10 80 < 10 40 A 1 x 10 7 < 10 80 < 10 160

8 PL 220 846 B1 cd. tabeli 1 1 2 3 4 5 6 A 1 x 10 7 < 10 40 < 10 40 A 1 x 10 7 < 10 80 < 10 80 A 1 x 10 7 < 10 160 < 10 80 A 1 x 10 7 < 10 40 < 10 10 A 1 x 10 7 < 10 40 < 10 10 A 1 x 10 7 < 10 160 < 10 40 A 1 x 10 7 < 10 320 < 10 NR* A 1 x 10 7 < 10 320 < 10 NR A 1 x 10 7 < 10 320 < 10 80 A 1 x 10 7 < 10 160 < 10 20 A 1 x 10 7 20 320 < 10 160 A 1 x 10 7 < 10 80 < 10 80 A 1 x 10 7 < 10 80 < 10 160 A 1 x 10 7 < 10 160 < 10 160 B 5 x 10 7 < 10 80 < 10 40 B 5 x 10 7 < 10 20 < 10 < 10 B 5 x 10 7 < 10 320 < 10 160 B 5 x 10 7 < 10 80 < 10 320 B 5 x 10 7 < 10 320 < 10 160 B 5 x 10 7 < 10 80 < 10 80 B 5 x 10 7 < 10 160 < 10 320 B 5 x 10 7 < 10 80 < 10 40 B 5 x 10 7 < 10 160 < 10 40 B 5 x 10 7 < 10 40 < 10 80 B 5 x 10 7 < 10 20 < 10 20 B 5 x 10 7 < 10 320 < 10 160 B 5 x 10 7 < 10 40 < 10 320 B 5 x 10 7 < 10 80 < 10 40 B 5 x 10 7 < 10 80 < 10 NR B 5 x 10 7 < 20 320 < 10 80 B 5 x 10 7 20 160 < 10 80 B 5 x 10 7 < 10 320 < 10 160 B 5 x 10 7 < 10 320 < 10 320 B 5 x 10 7 < 10 80 < 10 160 C 1 x 10 8 < 10 320 < 10 320 C 1 x 10 8 < 10 320 < 10 160 C 1 x 10 8 < 10 160 < 10 80 C 1 x 10 8 < 10 320 < 10 NR

PL 220 846 B1 9 cd. tabeli 1 1 2 3 4 5 6 C 1 x 10 8 < 10 40 < 10 40 Kontrola 0 < 10 < 10 < 10 NR P r z y k ł a d 3 Ocena bezpieczeństwa badanej szczepionki u koni w warunkach terenowych W tym badaniu, 200 zdrowych koni płci męskiej i żeńskiej szczepiono dawką 6 x 10 6 TCID 50 inaktywowanej badanej szczepionki, podawanej domięśniowo w postaci szczepienia 1 ml dawką i następnie trzy do czterech tygodni później w postaci szczepienia drugą 1 ml dawką. Traktowane konie są trzymane i karmione z zastosowaniem tradycyjnych praktyk gospodarczych dla farmy lub stajni. Wszystkie traktowane konie były obserwowane przez weterynarza przez 30 minut po szczepieniu w celu stwierdzenia występowania szybkich reakcji, takich jak ślinienie, ciężkie lub niemiarowe oddychanie, drżenie lub anafilaksja. Przez dwa tygodnie po szczepieniu, konie obserwowano codziennie w celu stwierdzenia występowania opóźnionych reakcji takich jak letarg, anoreksja lub niezwykły obrzęk w miejscu wstrzyknięcia. Od badanych koni pobierano poprzez nakłucie żyły 5 do 10 ml próbki krwi w dniu pierwszego szczepienia (dzień zero) i co najmniej jeszcze raz po dwóch lub większej liczbie tygodni po drugim szczepieniu (dzień 36 lub późniejszy). Wykonano testy serologiczne stosując badanie PRNT [Chang, G.J., Hunt, A.R. i Davis B., Journal of Virology, 74 str. 4244 5422 (2000)]. Badana szczepionka Składnik Stężenie/dawka Objętość/ml Inaktywowany wirus Zachodniego Nilu 6 x 10 6 TCID 50 0,21 ml Olej SP 5% 0,05 ml MEM nie dotyczy 0,74 ml U mniej niż 2% koni zaobserwowano kliniczne objawy osłabienia. Ocena ta pokazuje, że szczepionka według wynalazku jest bezpieczna do stosowania u koni w warunkach terenowych. P r z y k ł a d 4 Ocena skuteczności badanej szczepionki (preparaty wielowalentne i monowalentne) u koni w warunkach terenowych. Oceniano skuteczność kombinacji szczepionki zawierającej zabity wirus Zachodniego Nilu (WNV) wobec choroby WNV wywołanej doświadczalnie. Ogółem rozdzielono 30 koni: do jednej grupy szczepionej (20 koni) i do jednej grupy kontrolnej (10 koni). Konie w grupie szczepionej otrzymały domięśniowo, w odstępie trzech tygodni, dwie dawki badanej szczepionki zawierającej zabity wirus Zachodniego Nilu (5 x 10 7 TCID 50 na dawkę z 5% oleju SP), wirus grypy, wirus zapalenia mózgu i rdzenia (Wschodniego, Zachodniego i Wenezuelskiego), wirus zapalenia nosa i płuc (serotyp 1 i 4) i anatoksynę tężca. Próbki surowicy zbierano okresowo dla zmierzenia odpowiedzi przeciwciał za pomocą badania PRNT (ang. plaque reduction neutralization test). Dwadzieścia cztery (24) dni po drugim szczepieniu, wszystkim koniom podano podskórnie WNV. Po tej prowokacji konie monitorowano pod kątem temperatury mierzonej w odbycie i jakichkolwiek objawów klinicznych dwa razy dziennie przez dwa tygodnie, a następnie raz w tygodniu w celu wykrycia wirusów we krwi. Konie poddawano eutanazji i sekcji zwłok w 21 i 22 DPC. Płyn mózgowo- -rdzeniowy (CSF), rdzeń kręgowy (szyjny, piersiowy i lędźwiowy) i próbki tkanek mózgu (części czołowej, potylicznej, rdzenia przedłużonego i pnia mózgu) badano dla stwierdzenia ciężkiej patologii i zbierano w celu izolacji wirusa.

10 PL 220 846 B1 Czternaście dni po drugim szczepieniu, 75% szczepionych zwierząt wykazało serokonwersję (miano 5), ze średnią geometryczną miana 10, podczas gdy zwierzęta kontrolne pozostały ujemne (miano < 5). Szczepienie wytworzyło znaczącą ochronę przeciw wiremii (prekursor rozwinięcia pełnoobjawowej choroby wywołanej przez wirusa Zachodniego Nilu). Dziewięć z 10 (90%) kontroli rozwinęło wiremię po prowokacji wirusem, podczas gdy tylko osiem z 20 (40%) szczepionych miało przejściową wiremię lub wiremię utrzymującą się najwyżej tylko kilka dni. Co ważne, w czasie okresu obserwacji nie zaobserwowano objawów klinicznych choroby wywołanej przez WNV u żadnego ze szczepionych zwierząt, które prowokowano wirusem. (Obserwowano przejściowe odpowiedzi gorączkowe u jednego kontrolnego i dwóch szczepionych koni. Jednakże nie było dowodów sugerujących, że odpowiedzi te były wywołane zakażeniem WNV). W tkance mózgowej u jednego zwierzęcia kontrolnego stwierdzono krwotok punkcikowaty w substancji białej i krwotok podtwardówkowy. Z próbek pobranych od tego zwierzęcia WNV wyizolowano z mózgu, ale nie wyizolowano z CSF i rdzenia kręgowego. Z żadnej próbki tkanek zbieranych od innych koni prowokowanych wirusem nie wyizolowano WNV. Wyniki tego badania pokazują znaczącą ochronę występującą u koni szczepionych badaną kombinacją szczepionki zarówno wobec wiremii, jak i objawów klinicznych choroby wywołanej przez WNV. Drugie badanie przeprowadzono według protokołu podobnego do tego powyżej, z wyjątkiem tego, że wykorzystano monowalentną szczepionkę przeciw WNV (samą szczepionkę wobec WNV) i że wszystkie konie po 12 miesiącach od drugiego szczepienia prowokowano wirusem WNV. U dziewięciu z 11 (81,8%) kontroli, po prowokacji, rozwinęła się wiremia, podczas gdy tylko jeden z 19 (5,3%) szczepionych koni miał przejściową wiremię. Podczas okresu obserwacji u żadnego z koni prowokowanych wirusem nie zaobserwowano objawów klinicznych związanych z WNV. U żadnego z koni prowokowanych wirusem nie obserwowano odpowiedzi w postaci gorączki. Nie wyizolowano WNV z żadnych tkanek lub próbek CSF pobranych od koni prowokowanych wirusem. Przed prowokowaniem wirusem, na koniec 12-miesiecznego okresu, 17 z dziewiętnastu szczepionych koni miało miana w badaniu PRNT wynoszące 5 lub wyższe, podczas gdy grupa kontrolna pozostała ujemna (< 5). Wyniki tego drugiego badania pokazują znaczącą ochronę (94% chronionej frakcji) wobec wiremii występującą u koni szczepionych zabitą monowalentną szczepionką przeciw WNV. Wyniki te wskazują również na długo utrzymującą się odporność ochronną. P r z y k ł a d 5 Ocena skuteczności badanej szczepionki DNA u koni w warunkach terenowych Przykład ten pokazuje skuteczność szczepionki DNA wobec wirusa Zachodniego Nilu (WNV), jako część dalszego wykonania według wynalazku. Szczepionka DNA zawierała 100 μg oczyszczonego DNA z adiuwantem w postaci 5% oleju SP na 2 ml dawki i była oceniana wobec doświadczalnej prowokacji WNV. W celu wytworzenia kompozycji szczepionki DNA wobec WNV, komórki bakteryjne zbierano z hodowli pasażowanej 10 razy z komórek wyjściowych, stosując szczep E. coli DH10B, otrzymany z Invitrogen (Carlsbad, CA), zawierający plazmid Zachodniego Nilu pcbwn, otrzymany z Centers for Disease Control (Fort Collins, CO). Komórki bakteryjne zawieszano w buforze glukoza-tris-edta i lizowano wodorotlenkiem sodowym i dodecylosiarczanem sodowym. Lizat neutralizowano roztworem octanu potasu. Złożony wytrącony materiał zawierający DNA, RNA, szczątki komórek i białka usuwano stosując filtrację. Przesącz poddawano wytrącaniu poprzez dodanie alkoholu izopropylowego. Osad zbierano za pomocą wirowania i zawieszano ponownie w buforze. Proces ten powtarzano stosując octan amonu. Zebrany osad zawieszano ponownie w buforze i nakładano na kolumnę chromatograficzną wypełnioną żywicą Polyflo. Kolumnę następnie płukano i z kolumny eluowano plazmidowy DNA. Ostatecznie eluat silnie diafiltrowano wobec soli fizjologicznej buforowanej fosforanem. Materiały oczyszczonego plazmidowego DNA były następnie dostarczone do mieszania. Badana szczepionka zawierała 100 μg plazmidowego DNA z adiuwantem w postaci 5% oleju SP. Konie wykorzystane w badaniu podzielono losowo na dwie grupy: dwadzieścia koni otrzymało szczepionkę DNA wobec WNV, a 10 koni wykorzystano jako kontrole. Pierwszą grupę szczepiono domięśniowo 2,0 ml dawkami szczepionki w odstępie trzech tygodni. Konie kontrolne nie otrzymały ani szczepień ani placebo. Jedną grupę koni (9 szczepionych i 5 kontrolnych) 5 tygodni po drugim szczepieniu prowokowano wirusem, podczas gdy drugą grupę koni (11 szczepionych i 5 kontrolnych) prowokowano wirusem 12 tygodni po drugim szczepieniu. W skrócie, na 12 dni przed prowokacją koni wirusem, komarom Aedes albopictus, zainfekowanym WNV, pozwalano na żerowanie na każdym koniu co najmniej 5 minut. Po prowokacji wirusem, w temp. -20 C zamrażano tylko te komary, które

PL 220 846 B1 11 były wypełnione krwią po posiłku na każdym koniu, a następnie analizowano miano wirusa miareczkowano jako pulę. Komary następnie homogenizowano za pomocą worteksu, stosując rozcieńczalnik. Homogenat wirowano, a supernatant przenoszono w celu analizy miana na komórkach Vero. Po prowokacji wirusem, konie monitorowano dwa razy dziennie przez co najmniej 9 dni pod kątem temperatury mierzonej w odbycie i w celu sprawdzenia objawów klinicznych dwa razy dziennie przez co najmniej 21 dni. Próbki surowicy pobierano dwa razy dziennie przez pierwszych 9 dni po prowokacji wirusem (DPC); jeden raz dziennie od 10 do 14 DPC i ostatecznie 21 DPC. Izolację wirusa przeprowadzono z próbek surowicy pobranych od 0 DPC do 10 DPC dla pierwszej grupy, którą prowokowano wirusem oraz od 0 DPC do 11 DPC dla drugiej grupy, którą prowokowano wirusem. Pierwszą grupę 14 koni i drugą grupę 16 koni poddano eutanazji i sekcji zwłok, odpowiednio 28 do 37 DPC i 29 do 38 DPC. Płyn mózgowo-rdzeniowy (CSF) i próbki tkanek mózgu, móżdżku i pnia mózgu pobierano w celu stwierdzenia ciężkiej patologii i izolacji wirusa. 14 dni po drugim szczepieniu, 6 z 20 szczepionych koni miało mierzalne miano wynoszące 2 lub więcej, a jeden koń miał miano 5. Szczepienie nadało ochronę wobec doświadczalnego prowokowania wirusem Zachodniego Nilu z wykorzystaniem komarów. Wiremię wykryto u 5 z 5 kontrolnych zwierząt i u 4 z 9 szczepionych w pierwszej grupie prowokowanej wirusem, podczas gdy 4 z 5 kontroli i 2 z 11 szczepionych miały wiremię w drugiej grupie koni prowokowanych wirusem. Wykryta wiremia była przejściowa i występowała tylko w ciągu sześciu dni po prowokacji. Ogólnie, wiremię wykryto u 9 z 10 (90%) koni kontrolnych i tylko u 6 z 20 (30%) szczepionych. Nie obserwowano objawów neurologicznych związanych z zakażeniem WNV u żadnego z badanych koni, w czasie okresu obserwacji, po prowokacji. Z żadnej próbki tkanek zbieranych od wszystkich badanych koni, nie wyizolowano WNV. Jeden koń z pierwszej grupy prowokowanej wirusem, poddany eutanazji 7 DPC, nie wykazywał dużych lub mikroskopowych dowodów zapalenia mózgu lub zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych. Wyniki tego badania wykazują znaczącą ochronę wobec wiremii u koni szczepionych badaną szczepionką. Zastrzeżenia patentowe 1. Kompozycja szczepionki, która obejmuje: plazmidowy DNA Zachodniego Nilu, przy czym plazmidowe DNA stanowi pcbwn, ulegający metabolizmowi olej, oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik. 2. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że ulegający metabolizmowi olej stanowi olej SP. 3. Kompozycja według zastrz. 2, znamienna tym, że ulegający metabolizmowi olej jest obecny w ilości od około 4% do 10% obj./obj. 4. Kompozycja według zastrz. 3, znamienna tym, że ulegający metabolizmowi olej jest obecny w ilości około 5% obj./obj. 5. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że ponadto obejmuje składnik szczepionki skierowany przeciwko wirusowi wścieklizny, wirusowi Wschodniego końskiego zapalenia mózgu, wirusowi Zachodniego końskiego zapalenia mózgu, wirusowi Wenezuelskiego końskiego zapalenia mózgu, końskiemu wirusowi opryszczki, Ehrlichia risticii, Streptococcus equi, anatoksynie tężca, wirusowi końskiej grypy (EIV). 6. Kompozycja według zastrz. 5, znamienna tym, że składnik szczepionki jest skierowany przeciwko końskiemu wirusowi opryszczki. 7. Kompozycja według zastrz. 6, znamienna tym, że koński wirus opryszczki stanowi EHV-1. 8. Kompozycja według zastrz. 6, znamienna tym, że koński wirus opryszczki stanowi EHV-4. 9. Kompozycja szczepionki obejmująca: a) plazmidowy DNA Zachodniego Nilu, przy czym plazmidowe DNA stanowi pcbwn; oraz b) około 4% do 10% obj./obj. adiuwanta z ulegającego metabolizmowi oleju obejmującego około 1 do 3% kopolimeru blokowego polioksyetyleno-polioksypropylenowego, około 2 do 6% skwalanu i około 0,1 do 0,5% monooleinianu polioksyetylenosorbitolu. 10. Szczepionka wirusa Zachodniego Nilu dla koniowatych obejmująca: a) plazmidowy DNA Zachodniego Nilu, przy czym plazmidowe DNA stanowi pcbwn; oraz

12 PL 220 846 B1 b) co najmniej około 1% obj./obj. adiuwanta zawierającego ulegający metabolizmowi olej i czynnik zwilżający lub dyspergujący. 11. Szczepionka według zastrz. 10, znamienna tym, że jest sformułowana w dwóch jednostkach dawki. 12. Szczepionka według zastrz. 10, znamienna tym, że zawiera co najmniej około 4% adiuwanta. 13. Szczepionka według zastrz. 12, znamienna tym, że zawiera około 4% do 10% adiuwanta. 14. Szczepionka według zastrz. 10, znamienna tym, że adiuwantem jest olej SP. 15. Szczepionka według zastrz. 10, znamienna tym, że czynnik zwilżający lub dyspergujący jest wybrany z grupy składającej się z niejonowych środków powierzchniowo czynnych. 16. Szczepionka według zastrz. 15, znamienna tym, że niejonowe środki powierzchniowo czynne są wybrane z grupy składającej się z kopolimerów blokowych polioksyetylen/polioksypropylen i estrów polioksyetylenowych. 17. Kompozycja szczepionki wirusa Zachodniego Nilu obejmująca plazmidowy DNA Zachodniego Nilu, przy czym plazmidowe DNA stanowi pcbwn, w ilości około 50 do 3000 mikrogramów na dawkę i immunogennie stymulującą ilość ulegającego metabolizmowi oleju. 18. Kompozycja według zastrz. 17, znamienna tym, że obejmuje około 100 do 1000 mikrogramów na dawkę. 19. Kompozycja według zastrz. 17, znamienna tym, że obejmuje około 100 do 250 mikrogramów na dawkę. Departament Wydawnictw UPRP Cena 4,92 zł (w tym 23% VAT)