Markery biochemiczne stosowane w ocenie ostrej i przewlekłej konsumpcji alkoholu etylowego

PRACE POGLĄDOWE Bogna GEPPERT Artur TEŻYK Czesław ŻABA Markery biochemiczne stosowane w ocenie ostrej i przewlekłej konsumpcji alkoholu etylowego Biochemical markers for acute and chronic alcohol consumption Katedra i Zakład Medycyny Sądowej Uniwersytet Medyczny im. Karola Marcinkowskiego, Poznań Kierownik: p o dr med. Czesław Żaba Dodatkowe słowa kluczowe: alkohol etylowy markery ostrej i przewlekłej konsumpcji alkoholu Additional key words: ethyl alcohol markers for acute and chronic alcohol consumption Adres do korespondencji: mgr farm. Bogna Geppert ul. Święcickiego 6, 60-781 Poznań tel. 618546426 sbogna@ump.edu.pl Pomimo iż, alkohol etylowy jest legalną i społecznie akceptowalną używką, jego nadużywanie stwarza szereg problemów, tak dla jednostki, jak i dla całego społeczeństwa. Ofiary śmiertelne i ranni w wypadkach samochodowych spowodowanych przez nietrzeźwych kierowców, agresywne zachowanie, problemy rodzinne oraz pogorszenie wydajności pracy to najczęstsze problemy społeczne związane z nadużywaniem alkoholu. Najbardziej specyficzną i prostą metodą dowiedzenia niedawnej konsumpcji etanolu jest potwierdzenie jego obecności w płynach ustrojowych osoby badanej. Głównym ograniczeniem jest w tym przypadku szybkość z jaką alkohol etylowy jest usuwany na drodze metabolicznej z organizmu człowieka, a co za tym idzie jego stosunkowo krótki czas detekcji. Obecnie równolegle do oznaczania alkoholu w płynach ustrojowych, wykorzystuje się markery jego spożycia, które w lepszy sposób obrazują ostrą jak i przewlekłą konsumpcję alkoholu etylowego. Obecność w ustroju markerów spożycia alkoholu jest skutkiem zaburzeń funkcji biochemicznych oraz procesów metabolicznych spowodowanych przez etanol, prowadzących do zmian ilościowych i jakościowych naturalnie występujących metabolitów bądź syntezy nowych, unikatowych związków. W praktyce markery spożycia etanolu dzieli się na markery ostrej konsumpcji (testy potwierdzające pojedyncze jego spożycie) oraz markery konsumpcji przewlekłej (potwierdzenie chronicznego spożywania alkoholu etylowego lub nie przestrzeganie abstynencji alkoholowej). Stosowanie markerów spożycia alkoholu etylowego stanowi cenną alternatywę i uzupełnienie tradycyjnych badań stosowanych w praktyce klinicznej i sądowo lekarskiej. Wstęp W większości społeczeństw alkohol etylowy jest legalną, powszechnie akceptowaną używką. Niestety dla około 10% populacji (zwłaszcza mężczyzn) okazjonalne spożywanie napojów alkoholowych In spite of the fact, that ethyl alcohol is a legal and socially accepted recreational drug its abuse may cause numerous problems for the individual and society. Casualties of car accidents caused by drunk drivers, aggressive behavior, family problems and effective less work are the main problems connected with alcohol abuse. The easiest and most effective way of proving recent alcohol consumption is confirming its presence in biological samples taken from the individual. However, the main disadvantage of this method is a short window detection for ethanol, because of its high speed of elimination process. Nowadays, in order to prevent and have a better control of alcohol abuse, markers that could provide a better view of short and long term ethanol consumption are in frequent use. Ethyl alcohol present in the body cause many qualitative and quantitative disturbances in biochemical metabolites that could be used as markers of its consumption. In practice markers of ethanol consumption are usually divided into acute (tests confirm single alcohol intake) and chronic (confirm long term alcohol consumption or lack of teetotalism). Markers of ethanol consumption are valuable alternative and complementation to customary examinations performed in medical practice and forensic medicine. prowadzi do rozwoju uzależnienia [7,27]. Ofiary śmiertelne i ranni w wypadkach samochodowych spowodowanych przez pijanych kierowców, agresywne zachowanie, problemy rodzinne oraz pogorszenie wydajności pracy to najczęstsze problemy 1163

społeczne związane z nadużywaniem alkoholu. Obecnie coraz częściej, aby zapobiegać i prawidłowo kontrolować problemy związane z nadużywaniem alkoholu, stosuje się markery jego spożycia, które w sposób wiarygodny obrazują historię konsumpcji, jak również pozwalają na ocenę ryzyka rozwoju choroby alkoholowej oraz pomagają w ocenie postępów jej leczenia. W toksykologii sądowej, badaniom poddaje się płyny ustrojowe osoby podejrzanej o popełnienie przestępstwa bądź wykroczenie (najczęściej krew i mocz) pod kątem obecności etanolu, aby ustalić jego poziom we krwi podczas popełnienia czynu zabronionego. Jako, że etanol w ciągu kilku do kilkunastu godzin jest wydalany z organizmu, szanse na jego wykrycie maleją wraz z upływem czasu i nierzadko zdarza się, iż pobranie próby krwi lub moczu przeprowadzane jest po jego całkowitym wyeliminowaniu z ustroju. Przyczyniło się to do rozwoju wiedzy na temat tzw. markerów ostrego spożycia alkoholu etylowego, weryfikujących historię jego niedawnego spożycia. Obecność w ustroju markerów spożycia alkoholu jest skutkiem zaburzeń procesów metabolicznych spowodowanych przez etanol, prowadzących do zmian ilościowych i jakościowych występujących naturalnie lub syntezy nowych, unikatowych związków, co ilustruje Rycina 1. Zwykle markery spożycia etanolu dzieli się ze względu na ich czas półtrwania, a co za tym idzie tzw. okno detekcji, czyli czas w jakim mogą być wykryte w organizmie po spożyciu alkoholu etylowego: Markery ostrego spożycia etanolu testy potwierdzające jego pojedyncze spożycie takie jak: etanol, metanol, aldehyd octowy, stosunek 5-HTOL/5-HIAA (5-hydroksytryptofol/ kwas 5-hydroksyindolooctowy), glukuronian etylu (EtG), siarczan etylu (EtS) oraz estry etylowe kwasów tłuszczowych(faee); Markery przewlekłego spożycia etanolu pojawiające się w wyniku zaburzenia prawidłowych procesów metabolicznych bądź uszkodzenia tkanek na skutek przewlekłego spożywania etanolu: fosfatydyloetanol (PEth), gamma-glutamylo-transferaza (GGT), aminotransferaza asparaginianowa (AST) i alaninowa (ALT), transferynadesialowana (CDT), średnia objętość krwinki czerwonej (MCV) [19]. W ostatnich latach zwraca się także uwagę na tzw. markery predyspozycji do wystąpienia uzależnienia od alkoholu etylowego, takie jak oksydaza monaminowa (MAO), cykloza adenylowa (AC) oraz Neuropeptyd Y (NPY) [19]. Markery spożycia alkoholu służą coraz częściej w ocenie roli alkoholu w przebiegu procesu chorobowego, kontroli efektywności terapii odwykowej, we wczesnym rozpoznawaniu nawrotów picia oraz w medycynie sądowej do oceny stanu trzeźwości osoby w chwili zgonu bądź zdarzenia [34,35]. Markery ostrej konsumpcji etanolu Najbardziej specyficzną i prostą drogą potwierdzenia niedawnej konsumpcji etanolu jest jego wykrycie w płynach ustrojowych badanego. W wielu przypadkach głównym ograniczeniem tej metody jest szybkość z jaką alkohol etylowy jest metabolizowany Rycina 1 Powiązanie metabolizmu etanolu z markerami jego konsumpcji. Correlation between ethyl alcohol and its markers. i wydalany z organizmu, a co za tym idzie jego stosunkowo krótkie okno detekcji [10,17]. W takim przypadku zasadne jest przeprowadzenie badań w kierunku obecności markerów ostrego spożycia etanolu. Dobry wskaźnik obrazujący ostre spożycie alkoholu powinien charakteryzować się: okresem półtrwania dłuższym niż substancja macierzysta (tj. dobrą wykrywalnością w płynach ustrojowych po całkowitym wyeliminowaniu etanolu z ustroju), wyraźnym wzrostem stężenia po jednorazowym spożyciu oraz brakiem kumulacji w tkankach przy wielokrotnej ekspozycji [28]. Metanol Obecność metanolu w płynach ustrojowych można wytłumaczyć jego podażą w napojach alkoholowych jak również endogenną syntezą (do 0,1 mg/dl). Napoje alkoholowe są mieszankami etanolu i wody, a dodatkowo zawierają inne składniki, w tym metanol (w ilości od 1 do 1000 mg/l). Podwyższony poziom metanolu we krwi, utrzymujący się przez dłuży czas po spożyciu znacznych ilości napojów alkoholowych, jest wynikiem konkurencji z etanolem o miejsce wiązania ADH, podczas ich metabolizmu. Etanol wykazuje 10-krotnie większe powinowactwo do enzymu, przez co hamuje oksydację metanolu, prowadząc do jego kumulacji, trwającej dopóki stężenie etanolu nie spadnie poniżej 100 mg/dl [10,19]. Stężenie metanolu we krwi po ostrej konsumpcji alkoholu może wynieść do 0,5 mg/dl [10], a czas potrzebny do osiągnięcia stężenia fizjologicznego mieści się w przedziale około 10-12 godzin, po wyeliminowaniu etanolu. W przypadku przewlekłego nadużywania alkoholu, metanol osiąga znacznie wyższe stężenia (przekraczające 1 mg/dl), a jego eliminacja może trwać kilka dni. Ze względu na to, iż podwyższony poziom metanolu utrzymuje się po osiągnięciu przez etanol wartości fizjologicznej, oznaczony we krwi lub w moczu może być wskaźnikiem niedawnej konsumpcji etanolu jak i jego nadużywania [10,19]. Współczynnik 5-HTOL/5-HIAA Serotonina (5-HT, 5-hydroksytryptamina) jest hormonem pochodzenia aminokwasowego, który odgrywa ważną rolę jako neurotransmiter w centralnym i obwodowym układzie nerwowym. Głównymi miejscami metabolizmu serotoniny są jelita, nerki, wątroba oraz płuca [30]. Metabolizm serotoniny przedstawia Rycina 2. Początkowo serotonina ulega oksydatywnej deaminacji do 5-hydroksyindolo- 3-acetaldehydu (5-HIAL) przy pomocy oksydazy aminowej typu A MAO-A. Dalej w zależności od relacji NAD + /NADH, w procesie biotransformacji 5-HIAL dominuje utlenienie lub redukcja [11]. Reakcja utleniania prowadzona przez dehydrogenazę aldehydową (ALDH) prowadzi do powstania kwasu 5-hydroksyindolooctowego (5-HIAA), stanowiącego w normalnych warunkach główny metabolit serotoniny.[9] Reakcja redukcji, katalizowana przez dehydrogenazę alkoholową (ADH), prowadzi do powstania 5-hydroksytryptofolu (5-HTOL), który w odróżnieniu od 5-HIAA, wydalany jest głównie pod postacią sprzężoną z kwasem siarkowym lub glukuronowym [3]. Interakcja pomiędzy metabolizmem serotoniny, a metabolizmem alkoholu przyczynia się do zwiększenia ilości produkowanego 5-HTOL kosztem 5-HIAA, co skutkuje nawet 100-krotnym podniesieniem wartości stosunku 5-HTOL/5-HIAA w moczu. [9,30] Przekierowanie metabolizmu serotoniny ze szlaku oksydatywnego na redukcyjny, następuje na skutek dwóch czynników związanych z utlenianiem etanolu w organizmie tj.: 1. Współzawodnictwo o centrum aktyw- 1164 B. Geppert i wsp.

Rycina 2 Główne szlaki metaboliczne serotoniny Main metabolic pathway of serotonin ne enzymu - dehydrogenazy aldehydowej, pomiędzy aldehydem serotoninowym (5-HIAL), a acetaldehydem, metabolitem etanolu; 2. Zmiana stanu redoks w wyniku przekształcania kofaktora NAD + w zredukowaną formę NADH, zachodzącego podczas utleniania etanolu do acetaldehydu - podniesiony poziom NADH sprzyja produkcji 5-HTOL przez dehydrogenazę alkoholową [3,18,30]. Badanie stężenia 5-HTOL w moczu, wykonywanie zarówno podczas życia jak i po śmierci, jest jedną z metod pozwalających na wykazanie wcześniejszego spożycia alkoholu etylowego, kilka godzin po tym, gdy nie jest on już wykrywany w płynach ustrojowych. Wzrost stężenia 5-HTOL jest proporcjonalny do dawki spożytego alkoholu i pozostaje na podniesionym poziomie średnio 5-15 godzin [3] po całkowitym wyeliminowaniu etanolu z ustroju [12,29]. W praktyce poziom 5-HTOL, w relacji konsumpcji alkoholu etylowego, wyrażany jest jako współczynnik 5-HTOL/5-HIAA, co eliminuje wpływ rozcieńczenia moczu lub też względny, przypadkowy wzrost jego stężenia (np. w wyniku podaży pokarmów bogatych w serotoninę lub tryptofan) [19]. W przypadku spożywania etanolu, wartość współczynnika 5-HTOL/5-HIAA w moczu wzrasta powyżej 15 [nmol/μmol]. Udowodnienie ostrego spożycia alkoholu na postawie oznaczeń metabolitów serotoniny jest możliwe od 6 do 15 godzin, po tym gdy został on już całkowicie wyeliminowany. Pomimo, iż wartość wskaźnika 5-HTOL/5-HIAA rośnie wraz z ilością skonsumowanego alkoholu, nie można bezpośrednio skorelować jego wielkości z przyjętą dawką etanolu. Współczynnik 5-HTOL/5-HIAA wykorzystywany jest także w toksykologii sądowej do różnicowania pomiędzy syntezą pośmiertną, a przyżyciowym spożyciem alkoholu etylowego stwierdzonego we krwi i moczu denatów [20,18]. Współczynnik 5-HTOL/5-HIAA może być również wyrażany jako GTOL/5-HIAA, czyli stosunek glukuronidu 5-hyroksytryptofolu do kwasu 5-hydroksyindolooctowego, co znacznie upraszcza procedurę analityczną [3,35]. Nieoksydacyjne metabolity etanolu Około 1% wchłoniętego etanolu wydalane jest w postaci tzw. metabolitów nieoksydacyjnych tj.: jako estry etylowe kwasów tłuszczowych (FAEE), glukuronian etylu (EtG), siarczan etylu (EtS) oraz fosfatydyloetanol (PEth). Pomimo, iż stężenie wymienionych metabolitów jest bardzo niskie, stanowią one grupę specyficznych wskaźników konsumpcji etanolu. Ich czas półtrwania wynosi 1 do 7 dni, co doskonale wypełnia okno detekcji pomiędzy krótkotrwałymi markerami ostrej konsumpcji (etanol, metanol, współczynnik 5-HTOL/5-HIAA), a markerami o długim okresie półtrwania (MCV, GGT, CDT, AST, ALT) [35]. Znaczenie praktyczne nieoksydacyjnych metabolitów etanolu znacznie wzrosło wraz z rozwojem technik analitycznych pozwalających na ich oznaczania [19]. Glukuronian etylu (EtG) Mniej niż 0,1% wchłoniętego alkoholu etylowego ulega sprzęganiu z kwasem UDP-glukuronowym tworząc glukuronian etylu (EtG), który jest wydalany z moczem. Ponadto EtG może być wykrywany we krwi oraz ciałku szklistym oka (w przypadku denatów) [20]. Z uwagi na możliwość rozcieńczenia próby moczu, korzystniejsze jest wyrażanie stężenia EtG jako stosunku EtG/kreatynina [19]. Czas detekcji EtG w surowicy lub w moczu zależy od ilości spożytego etanolu. U osób zdrowych pijących umiarkowane ilości alkoholu (<30 g/dzień) EtG jest obecny w surowicy do 8 h dłużej niż etanol. W przypadku większej konsumpcji można go wykazać w moczu nawet do 22-32 h po wyeliminowaniu alkoholu etylowego. W przeciwieństwie do metabolitów serotoniny 5-HTOL/5-HIAA, stężenie EtG w przypadku przewlekłej konsumpcji systematycznie wzrasta, co sugeruje kumulację tego związku w organizmie i tym samym ogranicza jego zastosowanie jako markera ostrej konsumpcji etanolu [28,30]. W ostatnim czasie coraz większe znaczenie zyskują oznaczenia EtG w próbce włosów, jako markera chronicznego spożywania alkoholu etylowego, zarówno do celów klinicznych jak i sądowych. Oznaczenie w próbce włosów EtG w stężeniu > 30 pg/mg wskazuje na wysokie prawdopodobieństwo chronicznego nadużywania alkoholu, natomiast stężenie 7 pg/mg sugeruje abstynencję badanej osoby [13,14,26]. Siarczan etylu (EtS) Kolejnym nieoksydacyjnym produktem metabolizmu etanolu jest siarczan etylu, który powstaje na drodze sprzęgania alkoholu etylowego z aktywnym siarczanem, w reakcji katalizowanej przez sulfotransferazę. Szlakiem tym metabolizowane jest poniżej 0,1% wchłoniętego etanolu. Czas detekcji EtS w płynach ustrojowych, po spożyciu alkoholu, jest podobny jak w przypadku glukuronianu etylu. Z uwagi mniejszą, w porównaniu z EtG, wrażliwość siarczanu etylu na działanie β-glukuronidazy, zainteresowanie tym markerem w ostatnich latach systematycznie wzrasta [19,25,35]. Estry etylowe kwasów tłuszczowych (FAEE ) Estry etylowe kwasów tłuszczowych (takich jak palmitynian, mirystynian, linolan, linolenian, oleinian, stearynian czy arachidonian) są produktami estryfikacji kwasów tłuszczowych z etanolem, powstającymi w wyniku działania syntazyfaees. Czas detekcji FAEE w surowicy, po zaprzestaniu spożywania alkoholu wynosi do 24 godzin, a w przypadku chronicznych biorców do 44 godzin. Wartości stężeń FAEE we krwi wzrastają wraz z ilością skonsumowanego alkoholu, dlatego też u osób długotrwale nadużywających etanolu są one wyraźnie wyższe niż po jednorazowej konsumpcji [2,19,21,25]. Podobnie jak glukuronian etylu oznaczanie estrów etylowych kwasów tłuszczowych we włosach jest cennym markerem chronicznego używania etanolu. 1165

Oznaczenie sumy mirystynianu, stearynianu, oleinianu i palmitynianu etylu w stężeniu > 0.5 ng/mg włosów sugeruje chroniczne nadużywanie alkoholu natomiast łączne stężenie wymienionych estrów niższe niż 200 pg/mg włosów nie wyklucza abstynencji [13,14,26]. Biochemiczne markery przewlekłego spożywania alkoholu etylowego Uzyskanie potwierdzenia nałogowego spożywania alkoholu etylowego napotyka często na trudności, ponieważ osoba uzależniona nie podaje rzeczywistych ilości spożywanych napojów alkoholowych, a może powstrzymywać się od spożywania etanolu na tyle długo by w momencie badania uzyskać wynik negatywny. W takich przypadkach, pomocne w ustaleniu faktycznej historii spożywania alkoholu etylowego są markery jego przewlekłego nadużywania. Pojawiają się one we krwi dopiero po kilku tygodniach, a nawet miesiącach nawracających epizodów nadmiernego spożywania etanolu, prowadząc do modyfikacji struktury i właściwości fizykochemicznych niektórych związków, jak również zaburzeń w przebiegu szlaków metabolicznych. Gamma-glutamylo-transferaza (GGT) Jest enzymem biorącym udział w przenoszeniu reszt γ-glutamylowych glutationu na akceptory peptydowe, zaangażowanym w syntezę glutationu oraz transport aminokwasów. Występuje przede wszystkim w hepatocytach i komórkach nabłonka przewodów żółciowych, skąd jest uwalniana w razie uszkodzenia. We krwi osób zdrowych występują tylko śladowe ilości GGT, natomiast jej podwyższony poziom można obserwować m.in. w wyniku uszkodzenia wątroby, spowodowanej długotrwałym obciążeniem etanolem. W przypadku osób nie nadużywających alkoholu, po minimum 5-tygodniowym okresie konsumpcji powyżej 60 g etanolu na dobę, poziom GGT wzrasta, przekraczając nawet 10-krotnie normę. Okres półtrwania gamma-glutamylo-transferazy wynosi od 14 do 26 dni, tak więc powrót do wartości fizjologicznych po zaprzestaniu picia następuje po 4-5 tygodniach [1]. Główną zaletą oznaczeń GGT jest niski koszt badania i możliwość wykonania go w większości laboratoriów. Niewątpliwą wadą jest natomiast niska swoistość markera, spowodowana możliwością podniesienia poziomu GGT przez inne czynniki uszkadzające komórki wątroby (leki, zła dieta, palenie papierosów) [19,24,34]. Aminotransferaza asparaginianowa (AST) oraz aminotransferaza alaninowa (ALT) AST oraz ALT są enzymami wątrobowymi, odpowiedzialnymi za metabolizm aminokwasów. Aminotransferaza alaninowa występuje w cytozolu komórek wątroby, natomiast aminotransferaza asparaginianowa w 80% jest zlokalizowana w mitochondriach, a pozostały procent znajduje się w cytozolu hepatocytów. Aktywność pozawątrobowa AST zaznacza się w mięśniach szkieletowych, sercu, nerkach, mózgu oraz trzustce. Głównym zadaniem tych dwóch enzymów jest transfer grup aminowych na α-ketokwasy odbywający się przy udziale fosforanu pirydoksalu, pełniącego rolę koenzymu. U osób przewlekle nadużywających alkohol, występuje niedobór tego związku, czego skutkiem jest zahamowanie aktywności ALT, prowadzące do wzrostu aktywności AST. Mając na uwadze występowanie tego zjawiska, zaproponowano pomiar stosunku AST/ALT (tzw. wskaźnik de Rittisa) jako markera, którego wartość powyżej 1,5 2 może sugerować alkoholową przyczynę uszkodzenia wątroby. Innym dobrym wskaźnikiem uszkodzenia wątroby, jest mast, czyli mitochondrialna aminotransferaza asparaginianowa. Uszkodzenie mitochondriów przez dostarczanie do organizmu dużych dawek etanolu, powoduje uwolnienie mast, którego pomiar w stosunku do całkowitej ilości AST (tast), pozwala z większym prawdopodobieństwem wskazać na uszkodzenie wątroby spowodowane przewlekłym nadużywaniem etanolu. Należy jednak mieć na uwadze, iż podobnie jak w przypadku gamma-glutamylo-transferazy, inne czynniki mogą również wpływać na zmianę wartości zarówno wskaźnika de Rittisa jak i stosunku mast/tast, dlatego też zwykle badania poziomu transaminaz łączy się z innymi testami biochemicznymi [19,34,35]. Średnia objętość krwinek czerwonych (MCV) Zwiększona objętość krwinek czerwonych, określana mianem anemii makrocytarnej, występuje u 4% dorosłej populacji, z tego w 65% związana jest z nadużywaniem alkoholu. Bezpośrednia przyczyna tego zjawiska nie jest dokładnie poznana, przypuszcza się, iż hematotoksyczne działanie wykazuje sam etanol, jak również jego metabolity. Ich oddziaływanie na erytrocyty opiera się na zwiększaniu przepuszczalności błon, zaburzaniu struktury i metabolizmu komórek, w ostateczności prowadzące do osłabienia ich trwałości i zwiększonej podatności na hemolizę. Swój udział we wzroście objętości krwinek ma także niedobór kwasu foliowego, będący skutkiem nadmiernych ilości etanolu w organizmie. Do wzrostu MCV dochodzi zwykle po minimum miesiącu intensywnej konsumpcji (tj. ponad 60 g alkoholu dziennie), a jego wartość skorelowana jest z ilością oraz częstością picia. Główną zaletą MCV jako markera przewlekłej konsumpcji alkoholu jest to, iż na jego podstawie jesteśmy w stanie wykazać intensywną konsumpcję etanolu nawet po kilku miesiącach od zaprzestania jego spożywania. Po mimo tego, iż marker ten charakteryzuje się dość wysoką specyficznością, jego wyłączne zastosowanie jako wskaźnika przewlekłej konsumpcji alkoholu jest ograniczone. Istnieje bowiem szereg innych przyczyn, które mogą powodować wzrost objętości krwinek czerwonych (np. palenie papierosów, niedobór kwasu foliowego i witaminy B 12, niedoczynność tarczycy, leki). W porównaniu z GGT, specyficzność MCV jest większa, dlatego często jest on wykorzystywany w kombinacji z innymi markerami jako wskaźnik przewlekłego nadużywania alkoholu [4,19,34,36]. Ubogowęglowodanowe izoformy transferyny czyli tzw. transferyna desialowana (CDT) W fizjologicznych warunkach transferyna posiada od 4 do 6 reszt kwasu sialowego w cząsteczce, a procent występowania tzw. transferyn desialowanych (asialo-, monosialo- i disialotransferaz), zawierających odpowiednio mniej reszt, jest bardzo niski. Nadmierna podaż alkoholu przyczynia się do zwiększenia ilości ubogowęglowodanowych izoform transferyny. Etanol i jego metabolity wpływają na funkcjonowanie enzymów modyfikujących transferynę (zwiększają aktywność sialidazy i obniżają sialilotransferazy), ograniczają przyłączanie kwasu sialowego do cząsteczek transferyny oraz zaburzają funkcjonowanie receptorów hepatocytów odpowiedzialnych za eliminację transferyny desialowanej. CDT jest w porównaniu z GGT bardziej specyficznym i czułym markerem przewlekłej konsumpcji alkoholu. Podniesienie poziomu CDT we krwi następuje po minimum tygodniowym spożywaniu co najmniej 50-80 g alkoholu dziennie. W okresie abstynencji wartości te normalizują się w przeciągu 14-17 dni (średni czas półtrwania CDT), a wypicie w tym czasie nawet małej ilości etanolu, prowadzi do ponownego wzrostu poziomu CDT. Dopiero kilkutygodniowe odstawienie alkoholu pozwala na powrót transferyny desialowanej do wartości fizjologicznych. Podobnie jak w przypadku poprzednio omówionych wskaźników przewlekłego spożywania alkoholu etylowego istnieją inne czynniki, które mogą dawać fałszywie pozytywne bądź fałszywie negatywne wyniki oznaczania CDT (polimorfizm genetyczny, niealkoholowe choroby wątroby, niedobór żelaza). Przedstawiając poziom CDT w odniesieniu do całkowitej ilości transferyny, jako procent CDT lub wskaźnik CDT/transferyna całkowita, możemy znacznie poprawić specyficzność markera [15,19,21,32,34]. Fosfatydyloetanol (PEth) Fosfatydyloetanol powstaje w wyniku reakcji etanolu z fosfolipidami błony komórkowej, katalizowanej przez fosfolipazę D. PEth jako jedyny z nieoksydacyjnych metabolitów etanolu jest stosowany do oceny przewlekłej konsumpcji alkoholu, ponieważ dopiero wysokie dawki etanolu (powyżej 40-50 g/dobę) spożywanie przez okres nie krótszy niż trzy tygodnie, powodują pojawienie się go we krwi w ilościach możliwych do detekcji. W przypadku przewlekłego spożywania znacznych ilości alkoholu (od 60 g/dziennie, przez co najmniej tydzień), obecność PEth we krwi stwierdzano przez dwa tygodnie od zaprzestania picia [8]. Niewątpliwą wadą fosfatydyloetanolu jako markera, jest możliwość jego syntezy in vitro w czasie przechowywania próbek krwi zawierających etanol [19,35]. Addukty aldehydu octowego Aldehyd octowy powstający w czasie reakcji utleniania alkoholu etylowego w organizmie jest wysoce reaktywnym związkiem, tworzącym addukty z wieloma białkami (przede wszystkim albuminami i hemoglobiną), DNA i fosfolipidami. Wiązanie się powstających adduktów z makrocząstecz- 1166 B. Geppert i wsp.

kami hepatocytów jest jedną z przyczyn alkoholowych uszkodzeń wątroby. Addukty acetaldehydu z białkami krwi (WBAA) występują zarówno w ostrym jak i przewlekłym nadużywaniu alkoholu, natomiast jego połączenia z hemoglobiną (HAA) pojawiają się już po jednorazowym wypiciu dużych dawek etanolu, a ich stężenie rośnie wraz ze spożytą ilością. Czas półtrwania powstających adduktów jest różny i zależy od rodzaju przyłączonego białka, co potencjalnie daje duże możliwości diagnostyczne. Tworzone połączenia aldehydu octowego mają charakter tzw. neoantygenów, stymulujących odpowiedź immunologiczną, co powoduje wzrost stężenia immunoglobulin A (IgA), szczególnie zauważalny u osób ciężko uzależnionych od alkoholu. Addukty aldehydu octowego stanowią obiecujące wskaźniki, jednak ich potencjał diagnostyczny wymaga przeprowadzenia dokładniejszych badań [19,23,31,35]. Podsumowanie Nadużywanie alkoholu etylowego stanowi poważny problem społeczny. Właściwa diagnoza osób uzależnionych jest podstawą wprowadzenia skutecznej terapii. Ukrywanie przez osoby nadużywające alkoholu faktycznej ilości spożywanych napojów alkoholowych, było zawsze jedną z głównych przyczyn utrudniających efektywne leczenie odwykowe. Zastosowanie w takich przypadkach procedur analitycznych opierających się na kompleksowym oznaczeniu, oprócz alkoholu etylowego, biochemicznych markerów (ostrej i przewlekłej konsumpcji) pozwala na uzyskanie pełniejszej historii jego spożywania. Niewątpliwym ograniczeniem, w szerszym zastosowaniu specyficznych markerów konsumpcji alkoholu etylowego, pozostaje wymóg dysponowania kosztownym sprzętem analitycznym, niezbędnym do przeprowadzania analiz. Możliwość zastosowania w ocenie stanu trzeźwości oraz leczeniu choroby alkoholowej markerów biochemicznych stanowi cenne uzupełnienie przeprowadzanych dotychczas badań. Piśmiennictwo 1. Athanaselis S., Stefanidou M., Koutselinis A.: Interpretation of postmortem alcohol concentrations. Forensic. Sci. Int. 2005, 149, 289. 2. Auwärter V., Kieβling B., Pragst F.: Squalene in hair a natural reference substance for the improved interpretation of fatty acid ethyl ester concentrations with respect to alcohol misuse. Forensic. Sci. Int. 2004, 145, 149. 3. Beck O., Helander A.: 5-hydroxytryptophol as a marker for recent alcohol intake. Addiction 2003, 98, (Suppl. 2), 63. 4. Chick J., Kreitman N., Plant M.: Mean cell volume and gamma-glutamyltranspeptidase as markers of drinking in working men. Lancet 1, 1249, 1981. 5. Davidson V.L., Sittman D.B.: Biochemia. Urban & Partner, Wrocław 2002. 6. Dierkes J., Wolfersdorf M., Borucki K. et al.: Determination of glucuronidated 5-hydroxytryptophol (GTOL), a marker of recent intake, by ELISA technique. Clin. Biochem. 2007, 40, 128. 7. Hanson G.R., Li T.K.: Public health implications of excessive alcohol consumption. J. Am. Med. Assoc. 2003, 289,1031. 8. Hanson P., Caron M., Johanson G. et al.: Blood phosphatidylethanol as a marker of alcohol abuse: levels in alcoholic males during withdrawal. Alcohol Clin. Exp. Res. 1997, 21, 108. 9. Helander A., Beck O., Boysen L.: 5-hydroxytryptophol conjugation in man: Influence of alcohol consumption and altered serotonin turnover. Life Sciences 1995, 56, 1529. 10. Helander A., Beck O., Jones A.W.: Laboratory testing for recent alcohol consumption: comparision of etanol, methanol, and 5-hydroksytryptophol. Clin. Chem. 1996, 42, 618. 11. Helander A., Eriksson C.J.P.: Laboratory tests for acute alcohol consumption: Results of the WHO/ ISBRA study on state and trait markers of alcohol use and dependence. Alcohol. Clin. Exp. Res. 2002, 26, 1070. 12. Helander A., von Wachenfeldt J., Hiltunen A., et al.: Comparison of urinary 5-hydroxytryptophol, breath ethanol and self-report for detection of recent alcohol use during outpatient treatment: a study on methadone patients. Drug. Alcohol. Depend. 1999, 56, 33. 13. http://www.soht.org/pdf/revised Alcohol marker Consensus.pdf. 14. http://www.soht.org/pdf/use of Alcohol Markers in Hair for Abstinence Assessment 2012.pdf. 15. Jeppson J.O., Kristennson H., Fimiani C.: Carbohydrate-deficient transferrin quantified by HPLC to determine heave consumption of alcohol. Clin. Chem. 1993, 39, 2115. 16. Johnson R.D., Lewis R.J., Canfield D.V., Blank C.L.: Accurate assignment of ethanol origin in postmortem urine: liquid chromatographic mass spectrometric determination of serotonin metabolites. J. Chromatogr. B. 2004, 805, 223. 17. Jones A.W., Helander A.: Disclosing recent drinking after alcohol had been cleared from the body. J. Anal. Toxicol. 1996, 20, 141. 18. Jones A.W., Helander A.: Time course and reproducibility of urinary excretion profiles of ethanol, methanol and the ratio of serotonin metabolites after intravenous infusion of ethanol. Alcohol. Clin. Exp. Res. 1999, 23, 1921. 19. Karch S.B.: Forensic Issues in Alcohol Testing. CRC Press Taylor & Francis Group, New York, 2008. 20. Kugelberg F.C., Jones A.W.: Interpreting results of ethanol analysis on postmortem specimens: A review of the literature. Forensic. Sci. Int. 2007, 165, 10. 21. Laposta M.: Fatty acid ethyl esters: short-term and long-term serum markers of ethanol intake. Clin. Chem. 1997, 43, 1527. 22. Maśliński S., Ryżewski J.: Patofizjologia. Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa 2000. 23. Niemelä O., Parkkila S.: Alcoholic macrocycytosis is there a role for acetaldehyde and adducts? Addict. Biol. 2004, 9, 3. 24. Peterson K.: Biomarkers for alcohol use and abuse A summary. Alcohol Research Health. 2004-2005, 28, 30. 25. Politi L., Leone F., Morini L., Polettini A.: Bioanalytical procedures for determination of conjugates or fatty acid esters of ethanol as markers of ethanol consumption: A review. Anal. Biochem. 2007, 368, 1. 26. Pragst F., Rothe M., Moench B. et al.: Combined use of fatty acid ethyl esters and ethyl glucuronide in hair for diagnosis of alcohol abuse: Interpretation and advantages. Forensic. Sci. Int. 2010, 196, 101. 27. Room R., Babor T., Rehm J.: Alcohol and public health. Lancet 2005, 365, 519. 28. Sarkola T., Dahl H., Eriksson C.J.P., Helander A.: Urinary ethyl glucuronide and 5-hydroxytryptophol levels during repeated ethanol ingestion in healthy human subjects. Alcohol Alcoholism, 2003, 38, 347. 29. Singer P.P., Jones G.R., Lewis R., Johnson R.: Loss of ethanol from vitreous humor in drowning deaths. J. Anal. Toxicol. 2007, 31, 522. 30. Some M., Helander A.: Urinary excretion patterns of 5-hydroxyindole-3-acetic acid and 5-hydroxytryptophol in various animal species: Implications for studies on serotonin metabolism and turnover rate. Life Sciences. 2002, 71, 2341. 31. Stevens V.J, Fantl W.J., Newman C.B. et al.: Acetaldehyde adducts with hemoglobin. J. Clin. Invest. 1981, 67, 361. 32. Stibler H.: Carbohydrate-deficient transferrin in serum: a new marker of potentially harmful alcohol consumption reviewed. Clin. Chem. 1991, 37, 2029. 33. Tekes K.: HPLC determination of serotonin and its metabolites from human platelet-rich plasma; Shift to 5-hydroxytryptophol formation following alcohol consumption. J. Chromatogr. Sci. 2008, 46, 169. 34. Waszkiewicz N., Konarzewska B., Waszkiewicz M i wsp.: Biomarkery nadużywania alkoholu. Część I. Biomarkery tradycyjne i ich interpretacja. Psychiatr. Pol. 2010, 44, 127. 35. Waszkiewicz N., Popławska R., Konarzewska B. i wsp.: Biomarkery nadużywania alkoholu. Część II. Nowe Biomarkery oraz ich interpretacja. Psychiatr. Pol. 2010, 44, 137. 36. Wu A., Chanarin I., Levi A.J.: Macrocytosis in chronic alcoholism. Lancet 1974, 1, 829. 1167